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Methodenartikel

Isolation und Kultur der primären Aorten-Endothelzellen von Miniaturschweinen

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DOI:

10.3791/59673

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14. August 2019

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1Department of Nephrology, Shenzhen Longhua District Central Hospital, Affiliated Central Hospital of Shenzhen Longhua District, Guangdong Medical University, 2Shenzhen Xenotransplantation Medical Engineering Research and Development Center, Shenzhen Second People's Hospital, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen University School of Medicine, 3Department of Medical Laboratory, Shenzhen Longhua District Central Hospital, Affiliated Central Hospital of Shenzhen Longhua District, Guangdong Medical University, 4Department of Endocrinology, Shenzhen Longhua District Central Hospital, Affiliated Central Hospital of Shenzhen Longhua District, Guangdong Medical University, 5Xenotransplantation Program, Department of Surgery, University of Alabama at Birmingham, 6People's Hospital of Longhua

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Beschrieben wird eine wirksame enzymatische Methode zur Isolierung von primären porcineaortischen Endothelzellen (pAECs) von Miniaturschweinen. Die isolierten primären pAECs können verwendet werden, um die Immun- und Gerinnungsreaktion bei Xenotransplantation zu untersuchen.

Zusammenfassung

Xenotransplantation ist ein vielversprechender Weg, um den Mangel an menschlichen Organen für Patienten mit Organversagen im Endstadium zu beheben, und das Schwein gilt als geeignete Organquelle. Immunabstoßung und Gerinnung sind zwei große Hürden für den Erfolg der Xenotransplantation. Vaskuläre Endothelzell (EC) Verletzungen und Dysfunktion sind wichtig für die Entwicklung der Entzündung und Gerinnungsreaktionen bei Xenotransplantation. Daher ist die Isolierung von Porenaorten-Endothelzellen (pAECs) notwendig, um die Immunabstoßung und Gerinnungsreaktionen zu untersuchen. Hier haben wir einen einfachen enzymatischen Ansatz für die Isolierung, Charakterisierung und Erweiterung hochgereinigter pAECs von Miniaturschweinen entwickelt. Zuerst wurde das Miniaturschwein mit Ketamin beästheisiert, und eine Länge von Aorta wurde ausgeschnitten. Zweitens wurde die endotheliale Oberfläche der Aorta 15 min der Kollagenase IV-Verdauungslösung ausgesetzt. Drittens wurde die endotheliale Oberfläche der Aorta in nur einer Richtung mit einem Zellschaber (<10-mal) abgekratzt und während des Prozesses der Kratzen. Schließlich wurden die isolierten pAECs von Tag 3 und nach Durchgang 1 und Durchgang 2 durch Durchflusszytometrie mit einem Anti-CD31-Antikörper identifiziert. Die Prozentsätze der CD31-positiven Zellen betrugen 97,4 % bei 1,2 %, 94,4 % bei 1,1 % bzw. 92,4 % bei 1,7 % (mittlere SD). Die Konzentration von Kollagenase IV, die Verdauungszeit, die Richtung, die Häufigkeit und Intensität des Abkratzens sind entscheidend für die Verringerung der Fibroblastenkontamination und die Erlangung einer hohen Reinheit und einer großen Anzahl von ECs. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere enzymatische Methode eine hochwirksame Methode zur Isolierung von ECs aus der Miniatur-Schweineaorta ist, und die Zellen können in vitro erweitert werden, um die Immun- und Gerinnungsreaktionen bei der Xenotransplantation zu untersuchen.

Einleitung

Der Mangel an verfügbaren Organen für die Transplantation ist weltweit ein offenes Problem1. Nach Angaben der Rotkreuz-Gesellschaft Chinas erhielt 2018 nur eine kleine Anzahl von Patienten mit Organversagen im Endstadium ein geeignetes Organ in China.

Xenotransplantation ist ein vielversprechender Weg, um das Problem des Organmangels zu lösen. Schweineorgane gelten aufgrund anatomischer und physiologischer Ähnlichkeiten als die am besten geeigneten Organe für den Menschen2,3. Das Versagen eines Schweinexenografts hängt weitgehend mit der Immunabstoßung und Gerinnungsreaktionen des Primaten zusammen. Porcine Endothelzellen (ECs) sind kritisch, da diese Zellen die ersten sind, die mit dem Primaten-Immunsystem interagieren, das Antikörper, Komplement, Zytokine und Immunzellen (z. B. T-Zellen, B-Zellen und Makrophagen)4,5umfasst. Schweine-ECs spielen eine wichtige Rolle in Schweineorgan und Islet Xenotransplantation6,7. Daher sind ECs wichtige Zellen für die Untersuchung der Abstoßungs- und Gerinnungsreaktionen auf ein Schweinetransplantat. Für die Xenotransplantationsforschung ist die Isolierung hochwertiger Schweine-ECs erforderlich.

Bei Versuchen, ECs aus verschiedenen Organen (z.B. Herz, Niere, Leber und Aorta) zu isolieren, wurden mehrere Protokolle in einer Xenotransplantateinstellung8,9,10,11,12berichtet. Die Beibehaltung einer ultrareinen Kultur isolierter ECs ist jedoch ein herausragendes Problem in Standardprotokollen. Die erhöhte Konzentration der verdauten Lösung, ungeeignete Verdauungszeit und Kratzintensität können zur erhöhten Fibroblastenkontamination in aktuellen Studien8,10,13beitragen. Außerdem wird die Methode der isolierten pAECs von Miniaturschweinen weniger untersucht. Hier beschreiben wir eine optimierte enzymatische Methode zur Isolierung hochgereinigter pAECs von Miniaturschweinen (Wuzhishan oder Bama). Mehrere Schritte des Protokolls wurden entwickelt, um die Fibroblastenkontamination zu reduzieren und hochreine ECs zu erhalten.

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Protokoll

Die Verwendung von Tieren wurde von der Ethik-Überprüfungskommission des Shenzhen Second People es Hospital in Übereinstimmung mit den Grundsätzen des Tierschutzes genehmigt.

1. Vorbereitung von Tieren, Medien und Puffern

  1. Bereiten Sie das Miniaturschwein vor.
    HINWEIS: Alle Miniaturschweine waren chinesische Wuzhishan- oder Bama-Schweine (männlich). Das Alter und das Gewicht der Schweine betrugen 100 Tage bei 8 Tagen bzw. 5,7 kg bei 1,0 kg (Mittelwert sD, n = 3).
  2. Bereiten Sie das Kulturmedium vor: Endothelzellmedium (ECM) ergänzt durch 10% (v/v) hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum (FBS), 1% (v/v) Penicillin/Streptomycin (P/S) und 1% (v/v) endotheliale Zellwachstumsergänzung (ECGS).
  3. Bereiten Sie den Waschpuffer vor: 1x PBS-Lösung (pH 7.4) mit 1% (v/v) P/S.
  4. Bereiten Sie eine 0,005% Kollagennase IV Verdauungslösung: 1 mg Kollagenase IV Pulver in 20 ml PBS-Lösung. Die Kollagenase-Verdauungslösung vor der Verdauung bei 37 °C vorwärmen.
  5. Bereiten Sie den Stopppuffer vor: Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) ergänzt durch 10% hitzeinaktivierte FBS und 1% P/S.

2. Chirurgie und Vorbereitung zur Isolierung von Porenaorten-Endothelzellen

  1. Desinfizieren des Operationssaals mit UV-Licht für 1 h und medizinischem Desinfektionsmittel 84 Flüssigkeit (verfügbarer Chlorgehalt beträgt 4,0% - 5,0%, Materialtabelle) vor der Durchführung der Operation.
  2. Nachdem das Miniaturschwein eine intramuskuläre Injektion aus 15 mg/kg Ketamin, 15 mg/kg Xylazinhydrochlorid und 0,05 mg/kg Phenacetinhydrochlorid erhalten hatte ( Volumen: 100 l/kg, Materialtabelle) (Abbildung 1A), bestätigen die Anästhesiestatus mit Überprüfung des schmerzhaften Stimulus von Schweinen (z. B. Kneifen eines Ohres oder Schütteln eines Vorderbeins) und physiologischen Index (z. B. Blutdruck, Herz- und Atemfrequenz).
    HINWEIS: Eine weitere halbe Dosis Injektion könnte dem Schwein gegeben werden, wenn es die Anzeichen des Aufwachens zeigt.
  3. Den Bauch mit einem Skalpell schneiden, die unterlegene Vena cava aussetzen und folglich Heparin-Natrium (5.000 U, Materialtabelle)mit 5 ml Spritze in die untere Vena cava injizieren.
  4. Fünf Minuten später einen Katheter in die Bauchaorta zu Blut geben, die Brusthaut schneiden und das Zwier mit einem Skalpell zerschneiden und anschließend den linken Ventrikel abschneiden.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Das Schwein eingeschläfert wird, indem Sie den Aortenpuls nach dem Bluten und Schneiden des Herzens überprüfen.
  5. Verbrauchen Sie die Rippen mit Knochenzangen (Tabelle der Materialien), und belichten Sie das Herz und die Lunge. Finden Sie die Aorta posterior zu Herz und Lunge und klemmen Sie die beiden Enden. Waschen Sie die Aorta einmal mit vorgekühlten Waschpuffer (Abbildung 1B,C).
  6. Schneiden Sie die Aorta mit der Schere aus und halten Sie die Aorta an jedem Ende geklemmt. Verbrauchen überschüssiges Gewebe um die Aorta mit sterilen Zangen und Schere. Die Aorta in ein 50 ml Zentrifugenrohr geben, die Aorta mit vorgekühltem Waschpuffer 3x (30 ml pro Waschgang) waschen und die Aorta ins Labor geben (Abbildung 1D).

3. Isolierung von Porcine Aorten-Endothelzellen

  1. Unter aseptischen Bedingungen die Schweineaorta aus dem Waschpuffer entfernen und auf eine 150 mm Petrischale legen (Abbildung 2A).
  2. Schneiden Sie die beiden Enden der Aorta vorsichtig ab und verbrauchen Sie überschüssiges Gewebe um Aorta herum mit sterilen Zangen und Scheren wieder (Abbildung2B). Waschen Sie die Außen- und Innenseite der Aorta (über die Kulturschale bei Raumtemperatur) mit 20 bis 50 ml Waschpuffer.
    HINWEIS: Versuchen Sie, nur den Bereich zu schneiden, in dem die Klemmen während der Operation platziert wurden, da einige ECs in diesem Bereich beschädigt wurden, und entfernen Sie überschüssiges Gewebe und arterielle Seitenzweige.
  3. Passieren Sie eine chirurgische Naht durch die Aorta und binden Sie dann ein Ende der Aorta mit der chirurgischen Naht (5-0, 90cm, Tisch aus Materialien). Bewahren Sie die chirurgische Naht im Inneren der Aorta auf (Abbildung 2C,D).
  4. Fixieren Sie die Aorta vorsichtig in der Nähe des gebundenen Endes mit Zangen, und ziehen Sie dann die chirurgische Naht langsam, um die Aorta umzukehren, bis die endotheliale Oberfläche der Aorta freigelegt wird (Abbildung 2E-G).
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Aorta in der Nähe des gebundenen Endes fixiert wird und fixieren Sie die Aorta nicht fest, sonst kann die Aorta nicht durch Ziehen der chirurgischen Naht umgekehrt werden.
  5. Die endotheliale Oberfläche der Aorta mit einem Waschpuffer 3x (10 ml pro Waschgang) waschen und diese Lösung entsorgen. Legen Sie die Aorta in ein 15 ml Zentrifugenrohr und bedecken Sie die Aorta mit 10 ml 0,005% Kollagennase IV Verdauungslösung in das Rohr (Abbildung 2H).
    HINWEIS: Die 0,005% Kollagennase IV Verdauungslösung bei 37 °C vor der Verdauung vorwärmen.
  6. Inkubieren Sie bei 37 °C für 15 min. Legen Sie die verdaute Aorta und Verdauungslösung in eine 100 mm Kulturschale und stoppen Sie die Wirkung von 0,005% Kollagennase IV, indem Sie 10 x 15 ml vorgekühlten Stopppuffer hinzufügen.
    HINWEIS: Die empfohlene Verdauungszeit liegt zwischen 10 und 20 Minuten. Stellen Sie sicher, dass die Endotheloberfläche der Aorta durch den Stopppuffer abgedeckt ist.
  7. Mit einem Zellschaber (Abbildung2I) kratzen Sie pAECs vorsichtig von der Innenfläche der Aorta ab . Waschen Sie die abgekratzte Aorta 3x mit Waschpuffer (5 ml pro Zeit). Die Lösung aus der Kulturschale in ein 50 ml Zentrifugenrohr geben. Waschen Sie den Boden der Kulturschale 2x mit Waschpuffer (5 ml pro Zeit), und legen Sie die Lösung wieder in ein 50 ml Zentrifugenrohr.
    HINWEIS: In eine Richtung vorsichtig kratzen und nicht komprimieren. Berühren Sie das Gewebe nicht in der Nähe der Ränder und Löcher. Es wird empfohlen, 5 x 8x zu verschrotten.
  8. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 600 x g für 6 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und lassen Sie 10 ml Lösung an der Unterseite eines 50 ml Zentrifugenrohrs. 20 ml Waschpuffer in das 50 ml Zentrifugenrohr geben und die Pellets wieder aufhängen. Vermeiden Sie Blasen während dieses Schritts.
  9. Zentrifuge bei 600 x g für 6 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand langsam. Die Zellpellets mit 1 ml Kulturmedium aussetzen und gut vermischen.
    ANMERKUNG: Die erhaltene durchschnittliche Anzahl von ECs pro cm Aorta beträgt 1,9 x 105 x 1,4 x 104 (mittelwert ig, sD, n = 3).
  10. Zählen Sie die Zellen mit einem Zellenzähler. Die Zellen in einem Gefäß verankern und kulturieren, ohne Materialien entsprechend der Zellzahl zu beschichten. Wenn die Zellenzahl kleiner oder gleich 1,0 x 106ist, kulturieren Zellen in einem 25 cm2 Kolben. Wenn die Zellenzahl größer als 1,0 x 106ist, kulturieren Zellen in mehreren 25 cm2 Kolben (1,0 x 106 Zellen pro Kolben). Den Kolben in einen Inkubator (ohne Schütteln) bei 37 °C mit 5% CO2 stellen und das Medium alle 2 bis 3 Tage austauschen.
    HINWEIS: Einige Zellen werden durch den Zellschaber beschädigt. Ein Zelllebensfähigkeitstest ergab, dass der Anteil der lebenden Zellen 95,7 % bis 1,7 % betrug (Mittelwert sD, n = 3). Die Verdoppelungszeit der isolierten Zellen beträgt ca. 1 bis 2 Tage.

4. Ernte und Charakterisierung reiner Endothelzellen

  1. Lassen Sie die Zellen für etwa 4-5 Tage wachsen. Wenn die Zellen 80% Zusammenfluss erreichen (Abbildung 3A), verdauen Sie die Zellen mit 0,25% Trypsin und durchgehen die Zellen. Dann sammeln Sie einige der isolierten Zellen (Tag 3, Passage 1 und Passage 2) und identifizieren Sie durch Durchflusszytometrie (mit einem Anti-CD31-Antikörper).
  2. Etikettisolierte pAECs (Zellnummer: 1 x 105) (Tag 3, Passage 1 und Passage 2) mit Anti-Porin CD31-Fluorescein isothiocyanat (FITC) konjugierter Antikörper (10 L Antikörper für pro 100 L-Zellen, gebeizt für 30 min bei 4 °C) für die Durchflusszytometrie-Analyse.
  3. Gate gesamt lebende Zellpopulation mit einem vorwärts verstreuten Plot, unbefleckte Probe als negativer Kontrolle. Dann präsentieren Sie die CD31-positiven Zellen der Gated-Zellen mit Histogramm.
    HINWEIS: Die Wirksamkeit von CD31-positiven Zellen beträgt 97,4 % bei 1,2 % (Tag 3), 94,4 % bis 1,1 % (P1) bzw. 92,4 % 1,7 % (P2) (Mittelwert SD) (Abbildung3B).

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Ergebnisse

Unsere Methode zielt darauf ab, eine effektive Möglichkeit zu bieten, hochgereinigte ECs von den Aortas von Miniaturschweinen zu isolieren. Der Prozess der Aorta-Operation ist in Abbildung 1dargestellt. Der erste Schritt ist, dass die ganze Aorta vom Schwein entfernt wird. Die Verhinderung anderer Zell- oder Bakterienkontaminationen ist sehr wichtig. So verletzen Sie nicht andere Organe oder Gewebe, falls ungezielte Zellen oder Bakterien die Aorta kontaminieren, und waschen Sie die Aorta mit...

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Diskussion

Endothelzellen werden häufig in der Forschung von vaskulären Dysfunktion, Diabetes, Geweberegeneration, Transplantation, und Krebs14,15,16,17,18verwendet. Um die Biologie und Funktion von ECs bei diesen Krankheiten zu verstehen und zu charakterisieren, wurden zahlreiche Methoden zur Isolierung der ECs verschiedener erkrankter Organe oder Gewebe berichtet

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Die Arbeit wurde durch Stipendien der Natural Science Foundation der Provinz Guangdong, Grant/Award Nummer: 2016A030313028; Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province, Grant/Award Number: B2018003; Shenzhen Foundation of Science and Technology, Grant/Award-Nummer: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 und JCYJ201604281420404945; Shenzhen Longhua District Foundation of Science and Technology, Grant/Award Number: 2017013; National Key R&D Programm von China, Grant/Award-Nummer: 2017YFC1103704; Sanming Project of Medicine in Shenzhen, Grant/Award Number: SZSM201412020; Sonderfonds für den Bau hochrangiger Krankenhäuser in der Provinz Guangdong (2019); Fund for High Level Medical Discipline Construction of Shenzhen, Grant/Award Number: 2016031638; Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission, Grant/Award Number: SZXJ2017021 und SZXJ2018059. Wir danken Hancheng Zhang und Zhicheng Zou von der Universität Shenzhen für die Unterstützung bei der Erstellung des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BD FACSAria IIBD Bioscience
BoneforcepsBeijing HeLi KeChuang Technology Development CO., Ltd. ChinaHL-YGQ   
BOON Einwegspritze (10ml)Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China
CD31-FITC AntikörperBio-RadMCA1746F
ZellschaberCorning 3010#
Kollagenase IVSigma-AldrichC5138#-1G
Verbindung Ketamin Injektion Veterinärpharmazeutische Fabrik von Shenyang, ChinaKetaminhydrochlorid 0,3 g / 2 ml, Xylazinhydrochlorid : 0,3 g / 2 ml, Phenacetinhydrochlorid 1 mg / 2 ml
DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol, Dihydrochlorid)Life TechnologiesD1306 #
DMEMLife Technologies11965118 #
ECMSciencell1001 #
EKGSciencell1052#
Eppendorf Mikroröhrchen mit Schnappverschluss (1,5 ml)AXYGENMCT-150-C#
Falcon 100mm ZellkulturschaleCorning353003#
Fötales RinderserumGIBCO10270-106#
Flowjo v10.0
Pinzette ShangHai medizinische Instrumente Co., Ltd.China
Heparin NatriumJiangsu WanBang biopharmazeutische Co., Ltd.China
JodtinkturGuilin LiFeng Medical Supplies Co., Ltd.China
Miniaturschwein (Bama oder Wuzhishan)Kang Yi Ökologische Landwirtschaft Co., Ltd, China
Mshot Mikroskop  Verifizierter Lieferant - Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd.M152
Petrischalen (150 x 15 mm)Biologixgroup66-1515#
Penicillin/StreptomycinLife Technologies15070063#
Rechteckige Zellkulturflasche mit schrägem Hals und Entlüftungskappe ? T25?Corning 3289#
SchereShangHai medizinische Instrumente Co., Ltd.China
Serologische Transferpipetten (10ml)JET BiofilGSP010010# 
Sterile PasteurpipetteGeneBrickGY0025#
Steriler Spritzenvorsatzfilter (0,22 Mikro; m)MilliporeSLGV033RS#
Chirurgisches SkalpellShangHai medizinische Instrumente Co.,Ltd.China22#
Chirurgisches NahtmaterialShanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd5-0#
Spritze?5mL?Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China
Trypsin-EDTA (0,25%), PhenolrotGIBCO25200056#
75% Medizinischer AlkoholGuilin LiFeng Medical Supplies Co., Ltd.China
20 x PBS Lösung (pH 7,4, Nukleasefrei)Sangon BiotechB540627#
Medizinisches Desinfektionsmittel 84 flüssigSichuan Provinz Yijieshi Medical Technology Co., Ltd450ml/Flasche

Referenzen

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