Methodenartikel

Einsatz der Atomkraftmikroskopie zur Messung mechanischer Eigenschaften und Turgordruck von Pflanzenzellen und Pflanzengeweben

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DOI:

10.3791/59674

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15. Juli 2019

 ,  , 
1SFR Biosciences, Université de Lyon, 2Laboratoire de Reproduction et Développement des Plantes, Université de Lyon, ENS de Lyon, UCBL, INRA, CNRS

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Die Atomkraftmikroskopie (AFM), die als Nano- und Mikroeindrüsenwerkzeug für Zellen und Gewebe betrieben wird. Das Gerät ermöglicht die gleichzeitige Erfassung der 3D-Oberflächentopographie der Probe und ihrer mechanischen Eigenschaften, einschließlich zellwandiger Young-Moduls sowie Turgordruck.

Zusammenfassung

Wir stellen hier den Einsatz der Atomkraftmikroskopie vor, um Pflanzengewebe einzurücken und seine mechanischen Eigenschaften wiederzuerlangen. Anhand von zwei verschiedenen Mikroskopen im Einzugsmodus zeigen wir, wie man einen elastischen Modul misst und damit mechanische Eigenschaften der Zellwand bewertet. Darüber hinaus erklären wir auch, wie der Turgordruck bewertet wird. Die Hauptvorteile der Atomkraftmikroskopie sind, dass sie nicht-invasiv, relativ schnell (5 bis 20 min) ist und dass praktisch jede Art von lebendem Pflanzengewebe, das oberflächlich flach ist, ohne Behandlungsbedarf analysiert werden kann. Die Auflösung kann sehr gut sein, abhängig von der Spitzengröße und der Anzahl der Messungen pro Flächeneinheit. Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass sie nur direkten Zugriff auf die oberflächliche Zellschicht gewährt.

Einleitung

Die Atomkraftmikroskopie (AFM) gehört zur Scan-Sondenmikroskopie-Familie (SPM), bei der eine Spitze mit einem Radius von in der Regel wenigen Nanometern die Oberfläche einer Probe scannt. Die Detektion einer Oberfläche erfolgt nicht über optische oder elektronenbasierte Methoden, sondern über die Wechselwirkungskräfte zwischen der Spitze und der Probenoberfläche. Somit beschränkt sich diese Technik nicht auf die topographische Charakterisierung einer Probenoberfläche (3D-Auflösung, die auf wenige Nanometer sinken kann), sondern ermöglicht auch die Messung jeder Art von Wechselwirkungskräften wie Elektrostatik, Van der Waals oder Kontaktkräften. Darüber hinaus kann die Spitze verwendet werden, um Kräfte an der Oberfläche einer biologischen Probe anzuwenden und die resultierende Verformung, die sogenannte "Einrückung", zu messen, um ihre mechanischen Eigenschaften (z.B. Young-Modul, viskoelastische Eigenschaften) zu bestimmen.

Mechanische Eigenschaften von Pflanzenzellwänden sind wichtig, um bei dem Versuch, Mechanismen zu verstehen, die Entwicklungsprozessen zugrunde liegen,1,2,3zu berücksichtigen. Tatsächlich werden diese Eigenschaften während der Entwicklung streng kontrolliert, insbesondere da eine Zellwandenthärtung erforderlich ist, damit Zellen wachsen können. AFM kann verwendet werden, um diese Eigenschaften zu messen und zu untersuchen, wie sie zwischen Organen, Geweben oder Entwicklungsstadien wechseln.

In diesem Artikel beschreiben wir, wie wir AFM verwenden, um sowohl die mechanischen Eigenschaften der Zellwand als auch den Turgordruck zu messen. Diese beiden Anwendungen werden auf zwei verschiedenen AFM-Mikroskopen demonstriert und werden hier danach detailliert beschrieben.

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Protokoll

1.Messung der mechanischen Eigenschaften der Zellenwand

HINWEIS: Beispiel für das sich entwickelnde Gynoezium von Arabidopsis wird vorgestellt.

  1. Vorbereitung der biologischen Proben
    1. Sammeln Sie eine geschlossene Blütenknospe in Stufe 9 bis 10 (ca. 0,5 mm lang) nach veröffentlichten Stufen Bestimmung für Arabidopsis4. Unter einem Fernglas, mit feiner Pinzette, vorsichtig öffnen Sie die Knospe, um den Entwicklungsstand zu überprüfen und sammeln Sie das Gynoecium in der Mitte der Blume.
    2. Setzen Sie das Gynoecium auf doppeltes Seitenband in der Mitte der Abdeckung einer kleinen Petrischale (Durchmesser von 5 cm).
      HINWEIS: Alternativ kann biokompatibler Klebstoff auch für eine effizientere Immobilisierung der Probe beim Einzug verwendet werden.
    3. Fügen Sie schnell Wasser hinzu, bis die Probe vollständig abgedeckt ist. Dies vermeidet Austrocknung und reduziert die Haftung der Spitze an der Probe. Alternativ tauchen Sie die Probe in flüssiges Medium, wie Arabidopsis apex culture medium5.
  2. AFM-Kalibrierung
    1. Stellen Sie die Auslegerfederkonstante k hoch genug ein, um die Verformung der Probenoberfläche bis zum gewünschten Einzug zu ermöglichen, aber nicht zu hoch, um einen Verlust der Empfindlichkeit zu vermeiden.
      HINWEIS: Als grobe Faustregel kann die Größenordnung der Federkonstante als k-E - ,wobei der gewünschte Einzug der Fall ist, gewählt werden, wenn Youngs Modul der Probe bekannt ist.
    2. Verwenden Sie eine R = 400 nm kugelförmige Spitze mit 15 m Spitzen-Bindetilever-Abstand.
      HINWEIS: Der Spitzenradius steht in direktem Zusammenhang mit der seitlichen Auflösung. Im Allgemeinen wählen Sie für die Einrückung auf biologische Materialien abgerundete Spitzen(R größer als 10-20 nm) oder kolloidale Sonden. Kleine kolloidale Sonden können aufgrund des geringen Abstands zwischen Spitze und Ausleger, der die Probenoberfläche berühren kann, schwierig zu bedienen sein.
    3. Schalten Sie die Software ein und platzieren Sie den Kopf vor dem Experiment mindestens 2-3 h horizontal: Dies ermöglicht es dem Kopf, sich zu thermischisieren und wird thermisch induzierte Freischwinger-Laser-relative Bewegungen vermeiden. Wenn das Mikroskop mit einem CellHesion-Modul ausgestattet ist (erweitert den verfügbaren Z-Piezo-Bereich auf 100 statt 15 m), schalten Sie zuerst den Controller ein und wählen Sie dann beim Starten der Software den CellHesion-Modus.
    4. Montieren Sie den Ausleger auf dem Glasstein und montieren Sie den Block auf dem Kopf. Legen Sie ein Tröpfchen von ein paar Mikroliter Reinstwasser auf die Spitze, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, wenn die Spitze in Wasser getaucht wird.
    5. Legen Sie eine harte Probe (gereinigtes Glasschlitten oder Saphir) und fügen Sie 30-50 l Reinstwasser hinzu.
      HINWEIS: Das hier beschriebene Kalibrierverfahren ist die manchmal so genannte Kontaktkalibrierung. Zuerst wird eine Kraftkurve auf einer steifen und flachen Oberfläche gemacht und dann wird das Schwingungsspektrum des thermisch angeregten Auslegers aufgezeichnet, um die Federkonstante zu berechnen. Andere Kalibrierprotokolle existieren und werden im Diskussionsabsatz kurz beschrieben.
    6. Legen Sie den Kopf auf die Bühne (achten Sie darauf, die Z-Motoren hoch genug zu heben). Verwenden Sie das optische Bild, um den Laser grob auf den Ausleger zu legen.
      1. Bewegen Sie den Laser entlang der Hauptachse des Auslegers, der das Summensignal auf der Photodiode überwacht.
        HINWEIS: Bei Verwendung von Standardauslegern sollte eine Summe von mehr als 0,5 V ermittelt werden.
      2. Bewegen Sie den Laser in die andere Richtung und maximieren Sie das Summensignal, um den Laser in der Mitte des Auslegers zu positionieren. Dadurch wird das Quergespräch zwischen seitlicher und vertikaler Durchbiegung minimiert.
    7. Messung der Ablenkempfindlichkeit
      HINWEIS: Die Photodiode liest Laserverschiebung und liefert ein Signal in Volt. Um die Verformung in metrischer Einheit messen zu können, muss die Ablenkempfindlichkeit gemessen werden.
      1. Stellen Sie das Gerät in Kontakt - Kraftspektroskopie. Legen Sie einen relativen Sollwert auf 2 V, eine Z-Länge auf 0,5 m und die Geschwindigkeit auf 2 m/s(Abtastrate auf 10000 Hz) zu verlängern, und wählen Sie Z Closed Loopaus.
      2. Öffnen Sie den Kalibrierungs-Manager, und wählen Sie den Kontaktteil der Kraftkurve (der linear sein sollte), um eine lineare Anpassung zu machen: Die Umkehrung der Neigung ergibt die Ablenkempfindlichkeit. Der Photodiodenwert wird nun in metrischer Einheit kalibriert.
    8. Bestimmung der Federkonstante. Wählen Sie im Kalibrierungs-Manager die Federkonstante aus, um eine thermische Spektrumerfassung auszuführen. Um das Signal für eine längere Zeit zu durchschnittlich, wählen Sie das Symbol . Das Leistungsspektrum des thermisch angeregten Auslegers kann mehrere Spitzen aufweisen; zeichnen Sie eine Auswahl um diejenige, die mit der niedrigsten Frequenz platziert ist, um sie zu passen.
      HINWEIS: Wenn die thermische Melodie in Flüssigkeit durchgeführt wird, wird die Resonanzspitze breiter und ihre Frequenz im Vergleich zu nominal verringert.
  3. Kraftspektroskopie-ExperimentAufbau und -Erfassung
    1. Platzieren Sie die Probe auf der AFM-Stufe, und legen Sie den Kopf über die Probe.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Kopf so eingefahren wurde, dass ein harter Kontakt zwischen der Spitze und der Probenoberfläche vermieden wird.
    2. Lassen Sie den Ausleger für ein paar Minuten thermischisieren.
    3. Im QI-Modus nähern Sie sich mit einer Sollwertkraft von 50 nN.
    4. Stellen Sie eine Z-Länge von 4 m und eine Scanfläche auf 80 x 80 m2 mit einer Pixelanzahl von 40 x 40 ein. Stellen Sie im Bedienfeld Erweiterte Bildeinstellungen den Modus auf konstante Geschwindigkeit ein. Stellen Sie die Verlängerungs- und Einziehgeschwindigkeit auf 200 m/s und die Abtastraten auf 25 kHz ein.
    5. Starten Sie das Scannen und verwenden Sie dieses schnelle Scannen mit niedriger Kraft, um zu überprüfen, ob sich das Beispiel bewegt. Stellen Sie sicher, dass der gescannte Bereich frei von Schmutz oder umgelenkten Zellen ist, und suchen Sie einen Bereich von Interesse so flach wie möglich, um die Messungen durchzuführen.
      HINWEIS: Um die reale Stichprobenneigung zu schätzen, sollte die Zeilennivellieren auf OFF oder auf Konstantegesetzt werden. Ein übermäßiger Neigungswinkel zwischen der Einzugsachse und der Oberfläche wirkt sich auf den gemessenen Young-Modul5aus.
    6. Sobald ein Interessengebiet gefunden wurde, wählen Sie einen Bereich von 40 x 40 bis 60 x 60 x2 2 um ihn herum aus und erhöhen Sie die Pixelzahl auf 2 Pixel/m. Erhöhen Sie den Sollwert auf 500 nm, um 100-200 nm Einzug zu erhalten. Passen Sie diesen Wert ggf. zu Beginn des Experiments an. Verringern Sie die Z-Länge auf 2 m. Verringern Sie die Verlängerungs- und Einziehgeschwindigkeit auf 100 m/s und erhöhen Sie die Abtastrate auf 50 kHz.
    7. Starten Sie das Scannen und speichern Sie die Ausgabe (in der Regel aus einem Bild und einer Datendatei zusammengesetzt).
    8. Am Ende des Messtages den Spitzenhalter entfernen und vorsichtig mit Reinstwasser und 70% EtOH abspülen.
    9. Trocknen und entfernen Sie den Ausleger. Für weitere Experimente mit der gleichen Spitze sollten Sie es mit einem Nassreinigungsprotokoll und, wenn möglich, einer Nachbehandlung mit Plasma O2 reinigen. Lassen Sie das Wasser nicht auf dem Ausleger und/oder Spitzenhalter trocknen, um eine Salzkristallisation zu vermeiden.
  4. Datenanalyse (für 6.x Data Processing Software Version)
    1. Öffnen Sie die Datenverarbeitungssoftware, und laden Sie die Datendatei.
    2. Klicken Sie auf Diese Karte für die Stapelverarbeitung verwenden, um dieselben Analyseparameter für alle Kurven der Karte zu verwenden.
    3. Wählen Sie im vordefinierten Vorgang Load Hertz fitaus.
    4. Verwenden Sie die erste Registerkarte, um die Kalibrierungsparameter zu überprüfen oder zu ändern.
    5. Entfernen Sie auf der zweiten Registerkarte einen Versatz (oder einen Versatz plus eine Neigung) von der Basislinie, um den Durchschnittswert auf 0 festzulegen.
    6. Schätzen Sie in der dritten Registerkarte die Position des Kontaktpunkts (POC), indem Sie sie als den ersten Punkt betrachten, der die 0-Kraft kreuzt, wenn sie vom Sollwert entlang der Extendkurve herunterkommt.
    7. Die Registerkarte Vertikale Spitzenposition berechnet die Spitzenbewegung, indem die Auslegerablenkung von der Höhe gemessen subtrahiert wird. Verwenden Sie in diesem Schritt die Ungsmoothed height (Rohdaten) für die folgende Anpassung, indem Sie das entsprechende Kontrollkästchen aktivieren.
    8. Wählen Sie auf der Registerkarte Elastizitätsanpassung das entsprechende Anpassungsmodell aus. Wenn keine oder eine schwache Haftung auf Rückzugskurven sichtbar ist (entsprechend weniger als 10 % der Sollwertkraft oder der maximalen Durchschnittskraft bei der ausgewählten Einzugstiefe), sollte der Modelltyp auf Hertz/Sneddon gesetzt werden und die Verlängerungskurve verwendet werden. Bei stärkerer Haftung sollte das DMT-Modell, das für das Derjaguin-Muller-Toporov-Modell steht, bevorzugt werden und die Anpassung sollte auf Einziehkurven erfolgen (details zu den verfügbaren Kontaktmodellen und verwandten Formeln finden Sie im Handbuch).
      1. Legen Sie geometrische Spitzenparameter basierend auf der nominalen Spitzenform fest. Hier ist Tip Shape Kugel und Tip Radius ist 400 nm.
      2. Stellen Sie das Poisson-Verhältnis auf 0,5 fest, wie es konventionell für biologisches Material (entsprechend inkompressiblem Material) durchgeführt wird.
    9. Passen Sie sich an eine bestimmte Einbuchtungan. Standardmäßig wird die Anpassung über die gesamte Kurve ausgeführt. Wenn die Passung bis zu einem bestimmten Einzug erfolgen muss, aktivieren Sie zuerst das Kontrollkästchen Umschaltkurve; Dadurch wird der Ursprung der Kurve basierend auf neu ermittelten Basislinien- und POC-Werten verschoben.
      1. Fügen Sie eine zweite Elasticity Fit-Routine hinzu, indem Sie auf das Symbol im Hauptfenster klicken.
      2. Stellen Sie alle Anpassungsparameter erneut ein und geben Sie in X min den gewünschten Einzug an. Fügen Sie so viele Schritte wie nötig hinzu (2 bis 3 Schritte sollten ausreichen), um die Bestimmung der POC-Position und anschließend die berechnete Einzugstiefe zu verfeinern. Der Prozess kann an dieser Stelle gespeichert werden.
    10. Klicken Sie auf Behalten und gelten, um die vorherigen Schritte auf allen Kurven der Karte zu durchlaufen.
    11. Speichern Sie die Ergebnisse. Ein Bild und eine .tsv-Datei werden abgerufen.

2. Messung des Turgordrucks

HINWEIS: Ein Beispiel für das mit Oryzalin behandelte Blütenstand-Meristem der Arabidopsis wird vorgestellt.

  1. Herstellung einer biologischen Probe
    1. Collect Arabidopsis inflorescence meristem (IM) behandelt mit dem Mikrotubuli-Depolymerisationsmedikament Oryzalin aus In-vitro-Pflanzen, die auf einem Medium angebaut werden, das den polaren Auxin-Transportinhibitor 1-N-Naphthylphthalamsäure (NPA) nach veröffentlichter Methode enthält 6.
    2. Montage von IM-Beispiel nach einer der beiden Optionen
      1. Zur Langzeitüberwachung: Montieren Sie die Probe in einer Petrischale, die Arabidopsis apex culture medium (ACM)7,8 und 0.1% Pflanzenschutzgemisch (PPM) enthält, um eine Kontamination zu verhindern. Halten Sie die IM-Spitze über der ACM-Oberfläche auf und stützen Sie die Basis von IM mit einem Tropfen von 2% Agarose.
      2. Zur Messung mit schnellen Lösungswechseln: Montieren Sie die Probe in einer Petrischale, die ein kleines Stück Klebemastix hält, und versiegeln Sie schnell den Spalt zwischen Mastix und Probenbasis mit biokompatiblem Kleber. Warten Sie, bis sich der Kleber erstarrt (weniger als 2 min), und tauchen Sie die Probe dann in flüssigen ACM mit 0,1 % PPM ein.
        HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Probenoberfläche bei der Befestigung der Probenbasis nicht mit Agarose oder Kleber beschichtet ist. Die AFM-Messung des Turgordrucks erfordert, dass die Probe stabil montiert wird, und die vorherigen Montagemethoden sorgen für eine akzeptable Stabilität. Je nach Probe können andere Montagemethoden verwendet werden, wie doppelseitiges Band, Polylysin usw.
  2. AFM-Kalibrierung
    1. Schalten Sie die AFM-Erfassungssoftware ein und wählen Sie den PeakForce QNM(große Amplituden)-Messmodus.
    2. Führen Sie die Kalibrierung nach demselben Prinzip durch, das in den Schritten 2.1 bis 2.6 beschrieben ist.
    3. Legen Sie im Fenster Parameter überprüfen die Scangröße auf 0 fest. Legen Sie im Ramp-Fenster die Rampengröße zwischen 200 nm und 500 nm, die Trig-Schwelle zwischen 2 V und 5 V und die Anzahl der Proben auf 2048 oder höher fest.
    4. Richten Sie die Auslegerspitze an der Kalibrierungsprobe aus, und klicken Sie auf Approach.
    5. Nach dem Kontakt, gehen Sie zum Ramp-Fenster und klicken Sie auf die Schaltfläche Kontinuierliche Rampe. Bestimmen Sie im linearen Regime der Kurve die Neigung, indem Sie auf die Schaltfläche Empfindlichkeit aktualisieren klicken. Wiederholen Sie die Umlenkempfindlichkeitsmessung mehrmals und aktualisieren Sie die Kalibrierung manuell mit dem Messdurchschnitt, indem Sie den Tab-Detektor aus dem Menü Kalibrierungöffnen.
    6. Ziehen Sie den AFM-Kopf ein und entfernen Sie die Kalibrierprobe.
      HINWEIS: Es wird vorgeschlagen, den AFM-Kopf vollständig zurückzuziehen, indem Sie die Registerkarte Stage - Initialize auswählen, um versehentlichen harten Kontakt bei Probenwechsel zu verhindern.
  3. Kraftspektroskopie-ExperimentAufbau und -Erfassung
    1. Wenn die Probe noch nicht untergetaucht ist, tauchen Sie sie mit flüssigem ACM ein, das PPM enthält.
    2. Geben Sie in der Erfassungssoftware die Messparameter wie folgt an:
      1. Legen Sie im Parameterfenster Prüfen die Federkonstante auf die gefertigte Federkonstante des Auslegers oder die ermittelte Federkonstante wie in Schritt 2.8 fest. In diesem Beispiel wird er auf 42 N/m festgelegt.
      2. Legen Sie in diesem Beispiel den Spitzenradius auf 400 nm fest.
      3. Stellen Sie das Verhältnis von Sample Poisson auf 0,5 fest, da Wasser hauptsächlich zum Turgordruck beiträgt.
      4. Legen Sie Sample/Line auf 128 fest, um eine schnelle Erfassung zu gewährleisten.
      5. Stellen Sie die Scanrate auf 0,2 Hz ein.
      6. Stellen Sie die Scangröße auf 1 m fest.
        HINWEIS: Das Festlegen der Scanrate und der kleinen Scangröße kann effektiv verhindert, dass AFM-Scan-ausgelöste Probenschäden verursacht werden. Es wird empfohlen, diese beiden Parameter bei jeder Stichprobenänderung zu reduzieren.
      7. Stellen Sie im Ramp-Fenster die Rampengröße auf 5 m fest.
        HINWEIS: Es ist besser, Rampengröße größer als vorgesehen Einzugstiefe für eine bessere Baseline-Erfassung.
      8. Setzen Sie den Trig-Schwellenwert auf das Maximum.
      9. Legen Sie die Anzahl der Proben auf 4608 fest.
      10. Optional, in Mikroskop - Engagement-Parameter-Registerkarte, reduzieren Sie die folgenden Parameter, um starke kontaktinduzierte Probenschäden zu verhindern. Legen Sie Peak Force Engage Setpoint auf 0,3 V fest (Standard 0,5 V). Setzen Sie Engage int. Gain auf 0,5 (Standard 0,75). Stellen Sie den SPM-Einlimenschritt auf 4 m (Standard 15 m) ein.
    3. Platzieren und richten Sie die Probe unter dem AFM-Kopf aus, und nähern Sie sich, bis der Ausleger untergetaucht ist, aber nicht in Kontakt mit der Probenoberfläche.
      HINWEIS: Während der Annäherung, leicht blasen auf der Oberfläche der flüssigen ACM, bis eine flüssige Brücke zwischen dem Ausleger und der flüssigen Oberfläche gebildet wird. Dies verhindert in der Regel harten Kontakt.
    4. Mit Sorgfalt, manuell nähern sich auf die Probe. Wenn sich die Sonde relativ nahe an der Probenoberfläche befindet, klicken Sie auf Ansatz.
    5. Bei Kontakt erhöhen Sie schrittweise die Scangröße und/oder scan-Rate bis zu einem gewünschten Gleichgewicht, ohne die Probe und/oder den Ausleger zu beschädigen.
      HINWEIS: Die Scangröße wird durch die Oberflächenkrümmung und Rauheit der Probe begrenzt. Bei oryzalinbehandeltem IM kann mit einer Scanrate von 0,3 Hz eine Scanfläche von 50 x 50 m2 erreicht werden.
    6. Stellen Sie beim Scannen fest, ob der Messbereich wie gewünscht ist. Verschieben Sie bei Bedarf. Wenn Sie zufrieden sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Point and Shoot, um den Punkt zu initiieren und das Fenster zu schießen.
    7. Wählen Sie vor der Aufzeichnung des Scans einen geeigneten Bildkanal aus, der eine eindeutige Identifizierung von Zellkonturen erleichtern kann. Oft ist Peak Force Error, DMT Modulus, LogDMT Modulus oder Dissipation geeignet. Geben Sie das Speichern des Verzeichnisses und des Dateinamens an. Klicken Sie dann auf Ramp beim nächsten Scan, um die Aufnahme zu starten.
      HINWEIS: Eine Zeichenfolge aus einem Punkt und drei Zahlen wird automatisch nach dem angegebenen Dateinamen hinzugefügt (z. B. .000). Diese Zahl erhöht sich automatisch um 1 bei jeder gespeicherten Scanwiederholung.
    8. Wenn der Scan abgeschlossen ist, wird die Software-Schnittstelle automatisch zum Ramp-Fenster umgeleitet. Klicken Sie auf das gescannte Bild, um die zu einrückenden Positionen anzugeben.
      HINWEIS: Vor der Aufzeichnung von Einzügen ist es besser, mehrere Markierungen auszuwählen, um Testeinzüge durchzuführen, indem Sie nur auf Rampklicken, falls eine Parameteränderung erforderlich ist (für Rampengröße, Piezopositionusw.). Die Einzugstiefe muss größer sein als die Zellwanddicke (idealerweise separat durch Transmissionselektronenmikroskopie bestimmt).
    9. Wählen Sie mindestens drei Einzugsstellen pro Zelle in der Nähe des Barycenters aus, und wiederholen Sie den Einzug dreimal pro Standort. Dies würde für weitere Analysen mindestens neun Kraftkurven pro Zelle ergeben. Wenn Sie mit der Platzierung der Einzugswebsite zufrieden sind, klicken Sie auf Ramp und erfassen. Die Krafteindrungenwerdenwerdenwerdenwerden werden automatisch im angegebenen Verzeichnis gespeichert.
    10. Wenn die Rampen abgeschlossen sind, verschieben Sie sich für die Kachelmessung an eine andere Position, oder ziehen Sie den Scankopf zurück und wechseln Sie die Probe.
    11. Reinigen Sie den Ausleger nach Fertigstellung wie in den Schritten 1.3.8 und 1.3.9.
  4. Datenanalyse
    1. Öffnen Sie in der Analysesoftware die Datei *.mca. Dies zeigt die Position jeder Kraftkurve auf dem gescannten Bild. Falls gewünscht, wählen Sie Kraftkurven für die Analyse vor.
    2. Öffnen Sie eine zu analysierende Kraftkurve, in der Regel im Format x0000y.00z, wobei x der angegebene Dateiname im Speicherverzeichnis ist, während y und z automatisch registrierte Zahlen sind, die die Einzugssequenz und Scannummer bezeichnen.
    3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Baseline-Korrektur, und ziehen Sie die blauen Strichlinien auf der Kraftkurve, bis der Quellbasisstart und der Quellbasisausgangsstopp erweitern bei 0 % bzw. 80 % liegen. Klicken Sie auf Ausführen.
      HINWEIS: Alternativ kann der Quell-Baseline-Stopp für Quellquellen auf unterschiedliche Werte festgelegt werden, sofern er sich noch innerhalb der Baseline und nicht außerhalb des Kontaktpunkts befindet.
    4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Boxcar-Filter und klicken Sie auf Ausführen, um die Kraftkurve zu glätten.
    5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Einzug.
      1. Legen Sie im Eingabefenster die aktive Kurve auf Erweiternfest.
      2. Legen Sie die Anpassungsmethode auf linearisiertes Modell fest, und fügen Sie die Haftkraft auf Jaein.
      3. Setzen Sie Max Force Fit Boundary auf 99% und Min Force Fit Boundary auf 75%.
      4. Legen Sie Modell auf Steifigkeit anpassen (Linear) fest.
        HINWEIS: Dieses Setup berechnet die scheinbare Steifigkeit k für Turgor-Druckabzug. In diesem Beispiel spiegeln die Anpassungsgrenzen eine Steifigkeitsanpassung von etwa 1,5 m Einzugstiefe wider.
    6. Kraftkurven können im Batch analysiert werden. Klicken Sie auf die Schaltfläche Verlauf ausführen, geben Sie das Berichtsverzeichnis an, und fügen Sie alle anderen Kraftkurven hinzu, die die gleiche Behandlung erfordern. Wenn Sie zufrieden sind, klicken Sie auf Ausführen. Standardmäßig wird die Anpassung als *.txt-Datei gespeichert.
    7. Wenn k stapelweise montiert ist, klicken Sie auf Verlauf 5 Einzug, um zum Einzugsfenster zurückzukehren.
      1. Ändern Sie Max Force Fit Boundary auf 10% und Min Force Fit Boundary auf 0%.
      2. Legen Sie Modell auf Hertzian (Sphärisch) an.
        HINWEIS: Dadurch wird der Zellwand-Young-Modul E für den Turgordruckabzug berechnet. In diesem Beispiel spiegeln die Anpassungsgrenzen eine Hertzsche Passung (mit kugelförmiger Sonde) von etwa 0,4 m Einzugstiefe wider.
    8. Wiederholen Sie Schritt 2.4.6 für Chargenfit für E.
    9. Öffnen Sie die *.00z-Datei (z ist die automatisch registrierte Scannummer), um die verschiedenen Scankanäle anzuzeigen. Klicken Sie im Fenster Höhenkanal auf Abschnitt. Auf diese Weise wird die Messung der Oberflächenkrümmung der Probe ermöglicht, die für den Turgordruckabzug erforderlich ist.
      1. Zeichnen Sie eine Linie über die lange Achse einer Zelle, verschieben Sie die Strichliniengrenzen an die Zellkanten, und zeichnen Sie den Radiuswert r1auf. Wiederholen Sie dies für die kurze Achse, um radius r2abzurufen. Berechnen Sie die mittlere Krümmung der Zelloberfläche M und die Gaußsche Krümmung G mit den beiden Radienmessungen wie folgt:
        figure-protocol-1undfigure-protocol-2 
    10. Leiten Sie Turgordruck P mit dem Dünnschalenmodell 9 wie folgt ab:
      figure-protocol-3 
      mit
      figure-protocol-4
      wobei t die Zellwanddicke ist, die z.B. durch Elektronenmikroskopie bestimmt wird.
      HINWEIS: Der Abzug des Turgordrucks ist ein passender Prozess, bei dem Iterationen erforderlich sind. Vier Iterationen sind in der Regel in der Lage, stabiles Produkt zu reproduzieren, jedoch können mehr Iterationen durchgeführt werden (z. B. 100 Mal).
    11. Berechnen Sie den Mittelwert E, k und P pro Zelle. Registrieren Sie auch die intrazelluläre Variabilität (z. B. Standardabweichung) für die Dokumentation.

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Ergebnisse

Abbildung 1A und Abbildung 1B zeigen einen Screenshot, der das Ergebnis der Schritte 1.3.4 bis 1.3.6 des Protokolls veranschaulicht, der verwendet wird, um eine Interessenregion zu finden, in der die QI-Karte erworben werden soll. Es ist erwähnenswert, dass die Region von Interesse gewählt wurde, um nicht auf einer geneigten Oberfläche (d.h. so flach wie möglich) zu sein. Tatsächlich, wie routier et al.5be...

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Diskussion

Die Entstehung von Formen in Pflanzen wird hauptsächlich durch die koordinierte Geschwindigkeit und Wachstumsrichtung in Zeit und Raum bestimmt. Pflanzenzellen sind in einer starren Zellwand aus einer polysaccharidischen Matrix eingeschlossen, die sie zusammenklebt. Dadurch wird die Zellausdehnung durch das Gleichgewicht zwischen dem Turgordruck, der an der Zellwand zieht, und der Steifigkeit der Zellwand gesteuert, die diesem Druck standhält. Um die Mechanismen zu verstehen, die der Entwicklung zugrunde liegen, ist es w...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir danken dem PLATIM-Team für die technische Unterstützung sowie Arezki Boudaoud und Mitgliedern des Biophysic-Teams im RDP-Labor für hilfreiche Diskussionen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Wachstumsmedium1.000x
Vimatin-Stammlösung, die zur Herstellung von ACM verwendet wird, Zusammensetzung siehe Stanislas et al., 2017. Nach dem Autoklavieren und vor dem Ausgießen zu ACM hinzufügen.
1-N-Naphthylphthalamsäure (NPA)Sigma-Aldrich/Merck132-66-1zu Arabidopsis medium, 10 μm geben. Nach dem Autoklavieren vor dem Aufgießen zugeben.
Agar-AgarSigma-Aldrich/Merck9002-18-0zu Arabidopsis Medium hinzufügen, 1% w/v.
AgaroseMerck Millipore9012-36-6zur Herstellung von festem ACM, 0,8 % w/v.
Arabidopsis MediumDuchefa BiochimieDU0742.0025Für die In-vitro-Arabidopsis-Kultur, 11,82 g/L.
Calciumnitrat-TetrahydratSigma-Aldrich/Merck13477-34-4zu Arabidopsis Medium hinzufügen, 2 mM.
MURASHIGE & SKOOG MEDIUMDuchefa BiochimieM0221.0025Basalsalzmischung, zur Herstellung von ACM, 2,2 g/ L.
N6-Benzyladenin (BAP)Sigma-Aldrich/Merck1214-39-7zur Herstellung von ACM, 555 nM. Nach dem Autoklavieren und vor dem Ausgießen zu ACM hinzufügen.
OryzalinSigma-Aldrich/Merck19044-88-3zur Behandlung von Oryzalin, 10 μ g/ml.
Pflanzenkonservierungsmischung (PPM)Pflanzenzelltechnologiezur Herstellung von ACM, 0,1 % v/v. Nach dem Autoklavieren vor dem Gießen zu ACM hinzufügen.
KaliumhydroxidDuchefa Biochimie1310-58-3zur Herstellung von Arabidopsis-Medium und ACM, beide pH 5,8.
SaccharoseDuchefa Biochimie57-50-1zur Herstellung von ACM, 1 % w/v.
Tools for AFM
BioScope Catalyst BioAFMBrukerDas in diesem Protokoll verwendete Rasterthermometer für die Turgordruckmessung.
Nanowizard III + CellHesionJPK (Bruker)Das Rasterkraftmikroskop zur Messung mechanischer Eigenschaften.
PatafixUHUD1620
Referenz für elasitische StrukturNanoIdea2Z00026
Reprorubber-Thin PourFlexbar16135biokompatibler Klebstoff.
Sphärische AFM-SpitzenNanoandmoreSD-SPHERE-NCH-S-10Spitzen zur Messung mechanischer Eigenschaften.

Referenzen

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  2. Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).
  3. Dumais, J. Can mechanics control pattern formation in plants? Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).
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