Mikromanipulation von zirkulierenden Tumorzellen für die nachgelagerte Molekulare Analyse und die metastasierende Potenzialbewertung

Die klinische Manifestation von Metastasen in entfernten Organen stellt die letzte Stufe des Fortschritts an Krebs dar und macht mehr als 90% der krebserregenden Todesfälle aus. Der Übergang von lokalisierter zu metastasiger Krankheit ist ein mehrstufiger Prozess, der oft durch zirkulierende Tumorzellen (CTCs)2,3,4^vermitteltwird. Diese Zellen werden aus dem Primärtumor in die Blutzirkulation vergossen und in entfernte Organe transportiert, wo sie metastasierende Läsionen^5,6ausstoßen und herstellen können. Obwohl feste Tumoren eine relativ hohe Anzahl von CTCs freisetzen können, sind die meisten CTCs dazu bestimmt, zu sterben, aufgrund hoher Scherkräfte im Umlauf, anoikis-vermittelter Zelltod, Immunangriffen oder eingeschränkter Fähigkeiten, sich an eine fremde Mikroumgebung^zuanpassen 7. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, Werkzeuge zu entwickeln, die die Trennung der molekularen Merkmale der CTCs ermöglichen, die mit Metastasisis-Säen-Fähigkeit ausgestattet sind. Neuere präklinische und klinische Studien deuten darauf hin,^dass das Vorhandensein und die Menge einzelner CTCs und CTC-Cluster mit einem schlechteren Ergebnis bei Patienten^mitverschiedenen Arten von soliden Tumoren verbunden ist 8^,9,10 ^{, 11 , 12 , 13 , 14} . CTC-Cluster sind Gruppen von zwei oder mehr CTCs, die während des Umlaufs miteinander verbunden sind und bei der Bildung von Metastasen effizienter sind als einzelne CTCs^3,15,16. Zellen innerhalb eines Clusters halten eine starke Zellzellhaftung durch Desmosomen und Fesseln, die helfen können, Anoikis 17^,18zu überwinden. Vor kurzem haben wir festgestellt, dass die Clusterbildung von CTCs mit der Hypomethylation von Bindungsstellen für Stemis-und Proliferationsbedingte Transkriptionsfaktoren verbunden ist, was zu einer erhöhten Fähigkeitführt, Metastasen 19 erfolgreich zu initiieren. Die CTC-Cluster-Dissoziation führt zu einer Umgestaltung der wichtigsten Bindungsstellen und damit zur Unterdrückung ihres metastasierenden Potenzials¹⁹. Zusätzlich zu den Clustern von Krebszellen können CTCs auch mit der weißen Blutkörperchen (meist Neutrophilen) assoziiert werden, um einen hohen Proliferationsgrad im Kreislaufzu erhalten und ihre metastasierende Fähigkeit zu erhöhen 20. Die Biologie der CTCs wird jedoch nur teilweise verstanden und es bleiben einige Fragen offen, darunter die zugrunde liegenden molekularen Merkmale und Schwachstellen einzelner und zusammengestellter Zellen.

In den letzten Jahren wurden mehrere Strategien entwickelt, die zellflächliche Ausdrucksmuster sowie physikalische Eigenschaften von CTCs für ihre Isolation^21,22^,23,24ausnutzen^{. 25}. Antigen-abhängige Isolationsmethoden basieren meist auf der Expression der Zelloberfläche Epithelial Cell Adquil on Molecule (EpCAM)²⁶. Die am häufigsten verwendete und (derzeit) einzige von der FDA zugelassene Plattform für CTC-Aufzählung ist das CellSucher-System, das auf einem zweistufigen Verfahren zur Isolierung von CTCs²¹basiert. Im ersten Schritt werden Plasmakomponenten durch Zentrifugation entfernt, während CTCs mit magnetischen Ferrofluiden erfasst werden, die mit Anti-PCAM-Antikörpern gekoppelt sind. Im zweiten Schritt wird die CTC-angereicherte Lösung für nukleare (DAPI-positive) Zellen gebeizt, die Zytokeratin (CK)^8,18,19ausdrücken, während weiße Blutkörperchen (WBCs) mit Hilfe der Pen-Leukozyten-Marker CD45. Schließlich werden die gefangenen Zellen auf einer integrierten Screening-Plattform platziert und CTCs werden durch den Ausdruck von EpCAM, CKs und DAPI identifiziert, während sie für CD45 negativ sind. Obwohl dies als der Goldstandard für CTC-Aufzählung angesehen wird, ist die nachgelagerte molekulare Analyse mit dieser Technologie aufgrund der inhärenten Einschränkungen in der CTC-Rettung eine Herausforderung. Darüber hinaus kann CellSearch aufgrund seines Isolationsverfahrens die Anreicherung von CTCs mit höheren EpCAM-Werten im Vergleich zu CTCs mit niedrigerem EpCAM-Ausdruck ^{begünstigen, was zum Beispiel auf die Heterogenität von Krebs oder die Downregulation von Epithelmarkern zurückzuführen ist. 28,29}. Um diese Grenzen zu überwinden, haben sich antigen-unabhängige Technologien zur Bereicherung von CTCs herausgebildet. Zum Beispiel integriert der CTC-iChip die hydrodynamische Trennung von nukleaten Zellen, einschließlich CTCs und WBCs von den verbleibenden Blutbestandteilen, gefolgt von einer immunomagnetischen Erschöpfung von antikörpergetaggten WBCs, die die Reinigung von nicht getaggten und lebensfähigen CTCs in Lösung²⁵. Darüber hinaus führte die Tatsache, dass die meisten CTCs etwas größer sind als rote Blutkörperchen (RBCs) oder WBCs, zur Entwicklung von standardisierten CTC-Anreicherungstechnologien 23^{, 30 (} z.B. das Parsortix-System (ANGLE)), das eine Die mikrofluidi-basierte Technologie, die einen Verengungskanal über die Trennkassette umfasst, führt die Zellen zu einem Endraum von 10, 8, 6,5 oder 4,5 μm (je nach Erwartungsdurchmesser der Zielkrebszellen sind unterschiedliche Größen verfügbar). Die meisten Blutkörperchen durchdringen den schmalen Spalt, während die CTCs aufgrund ihrer Größe (aber auch aufgrund ihrer geringeren Verformbarkeit) in die Falle geraten und deshalb in der Kassette aufbewahrt werden. Die Umkehrung der Strömungsrichtung ermöglicht die Freisetzung von gefangenen CTCs, die sich in einem lebensfähigen Zustand befinden und für die nachgelagerte Analyse geeignet sind. Unabhängig vom gewählten Protokoll für die CTC-Isolierung ergeben jedoch immer noch typische Verfahren nach der Anreicherung KZKCs, die mit einer relativ kleinen Anzahl von RBCs und WBCs vermischt werden, was die Analyse von reinen Einzel-oder MassenCTCs schwierig macht. Um dieses Problem anzugehen, haben wir einen Workflow etabliert, der TCC-Manipulationen ohne mögliche Voreingenommenheit durch Blutzellenverunreinigungen ermöglicht. Die Zugabe von Immunfärbung im Vorfeld, mit variablen Antikörper-Kombinationen, unterscheidet CTCs von Blutkörperchen und ermöglicht sogar, CTC-Untergruppen mit unterschiedlichen Oberflächenmarker-Expressionsprofilen zu identifizieren. Dieses hochgradig anpassbare Verfahren kann dann mit spezifischen nachgelagerten Anwendungen weiter kombiniert werden.

Hier beschreiben wir einen Workflow, der von einem CTC-angereicherten Produkt ausgeht (das mit jeder beliebigen CTC-Anreicherungstechnologie gewonnen wird) und mehrere Ansätze kombiniert, um Einblicke in die CTC-Biologie bei Einzellen-Auflösung zu gewinnen. Kurz gesagt, unser Workflow ermöglicht die Identifizierung von einzelnen CTCs, CTC-Clustern und CTC-WBC-Clustern durch Live-Immunfärbung, gefolgt von Einzeller-Mikromanipulation und nachgelagerter Analyse mit Ex-vivo-Kulturierungsprotokollen, Einzelzelle Sequenzierung, und in vivo metastasis Assays.

Alle Eingriffe, bei denen es um Blutproben von Patienten ging, wurden nach untermächtigter Einwilligung der Teilnehmer durchgeführt. Die Verfahren wurden nach den Protokollen EKNZ BASEC 2016-00067 und EK 321/10 durchgeführt, die vom Ethik-und Institutionellen Prüfungsausschuss (Ethikkomitee Nordwest-/Zentralschweiz [EKNZ]) und gemäß der Deklaration von Helsinki genehmigt wurden.

Alle Verfahren, die Tiere betreffen, wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen und kantonalen Richtlinien durchgeführt (genehmigtes Mausprotokoll #2781, Kantonales Veterinäramt Basel-Stadt).

1. Patientenprobenvorbereitung

1. Vor dem Start, stellen Sie sicher, mit aseptischen Lösungen und Materialien zu arbeiten, um Sterilität während des gesamten Verfahrens zu erhalten.
2. Ziehen Sie 7,5 ml peripheres Blut von einem Brustkrebspatientinnen in ein 10 mL EDTA-Blutteschlut zurück.
3. Inkubieren Sie die bluthaltigen Röhren für kurze Zeit (bis 1 h) bei Raumtemperatur (RT) auf einem Schaukelschütteln bei 40 Schwingungen pro Minute (osz/min).
4. Bereichern Sie für einzelne CTCs und CTC-Cluster mit einer CTC-Isolierungsmethode der Wahl^{21,22, 23,}25^. Release CTCs in einer 1x DPBS-Lösung.
   Hinweis: Je nach gewählter CTC-Anreicherungstechnologie könnten verbliebene weiße Blutkörperchen und rote Blutkörperchen vorhanden sein. Passen Sie den Freisetzungsdruck an, um die CTC-Clusterstrukturen zu erhalten.
5. Gehen Sie sofort zum nächsten Schritt in Abschnitt 3.

2. Vorbereitung der Stichprobe

1. Vor dem Start, bereiten Sie eine 1 mL Insulinspritze mit einer 25G-Nadel, 5 mM EDTA gefilterte Lösung, und 2 mL EDTA-Blutsammlung.
2. Stellen Sie sicher, dass Sie mit aseptischen Lösungen und Materialien arbeiten, um die Sterilität während des gesamten Verfahrens zu erhalten.
3. Die Spritze mit 5 mM EDTA-Lösung vorwaschen.
4. Die Spritze mit 100 μL von 5 mM EDTA aufladen und Blasen entfernen.
5. Die Maus mit 80% CO₂ /20% O₂ Gasinhalation anfechten und sofort zum nächsten Schritt gehen.
   Hinweis: Eine Alternative zur CO₂ -Inhalationsmethode ist die Isooflurane-Anästhesie (3 vol% Iofluran und Sauerstoff (Trägergas) mit einer Durchflussrate von 600 mL/min), gefolgt von Gebärmutterhalskrebs oder einer Überdosierinjektion der ketamine/xylazine-Lösung. Die spezifische Euthanasie-Methode kann je nach zugelassenem Mausprotokoll variieren.
6. Bestätigen Sie den Tod des Tieres durch das Fehlen von Atemaktivität, fehlenden Hornhautreflex und Urinieren ohne äußere Reize.
7. Führen Sie eine Herzpunktion durch, indem Sie die Nadel der EDTA-vorgeladenen Spritze mit einem 30 °-Winkel vorsichtig in den Brustkorb vom Brustkorb in Richtung Herz einführen.
   NOTE: Für unerfahrene Experimentatoren empfiehlt es sich, die Brusthöhle erst zu öffnen, bevor die Herzpunktion durchgeführt wird, um das Herz besser zu visualisieren.
8. Retrieve bis zu 1 ml Blut. Ohne den Kolben freizusetzen, ziehen Sie die Spritze aus der Tierkiste heraus, entfernen Sie die Nadel sicher, öffnen Sie den Deckel des 2 ml EDTA-Blutentnahmeres und geben Sie das Blut direkt im Inneren ab. Schließen Sie den Deckel und kehren Sie die Röhre 10x.
9. Inkubieren Sie die bluthaltigen Röhren für einen kurzen Zeitraum (bis zu 1 h) bei RT auf einem Schaukelschütteln bei 40 osz/min.
   CAUTION: Die Nadel muss in scharfsicherer biologischer Gefahrenentsorgung entsorgt werden.
   Hinweis: Mehrere Punktionen können das gesamte Blutvolumen erhöhen. Verwenden Sie separate Spritzen mit EDTA für verschiedene Auszüge vorgeladen, um saugendes Gerinnungsblut in der vorherigen Nadel zu vermeiden.
10. Bereichern Sie für einzelne CTCs und CTC-Cluster mit CTC-Isolationsmethode der Wahl^{21,22, 23,}25^. Release CTCs in einer 1x DPBS-Lösung.
    Hinweis: Je nach gewählter CTC-Anreicherungstechnologie könnten verbliebene weiße Blutkörperchen und rote Blutkörperchen vorhanden sein. Passen Sie den Freisetzungsdruck an, um die CTC-Clusterstrukturen zu erhalten.
11. Gehen Sie sofort zum nächsten Schritt in Abschnitt 3.
    Achtung: Für alle folgenden Verfahren, stellen Sie sicher, dass unfestes und frisch isoliertes Blut verwendet wird.

3. CTCs leben Immunfärbung

1. Zentrifuge CTC-angereicherte Zellaufhängung mit 72 x g für 4 min.
   Hinweis: 72 x g entspricht 800 U/min, wenn der Rotor einen Durchmesser von 100 mm hat.
2. Das Pellet in 1% BSE-Lösung in 1x DPBS umbauen und 2 μg/mL antimenschlichen EpCAM-AF488-Antikörper und 1 hinzufügen. μg/mL von antimenschlichen CD45-BV605-Antikörper oder 2 μg/mL Anti-Maus-CD45-BV605 Antikörper in einem Gesamtvolumen von 500 μL.
   Hinweis: Für Brustkrebs patientenabgeleitete CTCs, antimenschliche EGFR-FITC und menschenfeindliche HER2-AF488 können zusätzlich zu Anti-PCAM und Anti-CD45 hinzugefügt werden. Dies ermöglicht es, die CTCs besser zu identifizieren, die niedrigere EpCAM-Levels ausdrücken.
3. 30 Minuten bei RT einwirken und vor Licht schützen.
4. Waschen Sie die KZKS-Aufhängung mit 1 ml von 1% BSA in 1x DPBS-Lösung und Zentrifugation bei 72 x g für 4 min.
5. Resuspend gefärbte Zellen in 2 mL von 1% BSA in 1x DPBS-Lösung und übertragen das Gesamtvolumen in 1 Brunnen einer 6-Wells ultraniedrigen Befestigungsplatte.
6. Inkubieren Sie die Platte für 10-15 min bei 4 ° C, die vor Licht geschützt ist, um eine Sedimentation von CTCs und Restblutzellen zu ermöglichen.

4. Mikromanipulation von CTCs und Einzeller-Kommissionierung

Hinweis: Vor dem Start sollten Sie sich bewusst sein, dass der Mikromanipulator bis zu 45 Minuten für den kompletten Aufbau benötigt. Nach dem Aufbau benötigt das Verfahren zur CTC-Identifizierung und Mikromanipulation bis zu 2 Minuten pro Zelle (oder Cluster).

1. Achten Sie darauf, dass die CTC-Kommissionierung innerhalb von 2 Stunden ab dem Ende der Färbung beendet wird.
2. Starten Sie die Mikromanipulationssoftware und schalten Sie den Mikromanipulator ein. Schließen Sie den Mikromanipulator an den Computer an und initialisieren Sie den Roboterarm sowie die Mikroskop-Stufe , indem Sie auf die Connect-Taste drücken, gefolgt von Int-Gerät.
3. Schließen Sie den Schutzschrank nach jeder Manipulation der Maschine, um sie über den Computer manövrieren zu können.
4. Reinigen Sie die Oberflächen von Staub und Verschmutzungen, indem Sie Ethanol sprühen und die Innenflächen des Schrankes abwischen. Eine saubere Umwelt wird die Sterilität des Prozesses gewährleisten.
5. Installieren Sie eine neue Glaskapillare auf dem Roboterarm. Für die Einzeller-Kommissionierung verwenden Sie 20-30 μm-Kapillare, während 30-50 μm für die CTC-Clusterpickierung vorzuziehen ist.
6. Entfernen Sie alle Blasen, die in den Schläuchen vorhanden sind, indem Sie das Öl des Systems abgeben oder saugen.
   CAUTION: Glaskapillare ist scharf und zerbrechlich. Mit Vorsicht vorgehen.
7. Füllen Sie den Sterilisationsbehälter 1 mit 70% Ethanol, den Sterilisationsbehälter 2 mit sterilen, nukleasfreien H_{2 O und}den Pufferbehälter mit sterilen 1x DPBS.
   CAUTION: Schließen Sie die Deckel der Tanks nicht, da die Kapillare während der nächsten Schritte frei auf die Tanks zugreifen müssen.
8. Die Kapillare zweimal mit 70% Ethanol Sterilisieren.
9. Den Sterilisationsbehälter 1 durch Tank 2 ersetzen und Kapillaren in H_{2 O mindestens}dreimal mit der Sterilisationsfunktion waschen.
10. Mit der Mikromanipulator-Software starten Sie ein neues Experiment und wählen Sie die Art des Kommissionierversuchs zwischen dem automatischen und dem manuellen Auswahlmodi.
    Hinweis: Wählen Sie die Art des Experiments, das auf dem Endpunkt der Manipulation basiert. Der manuelle Modus ermöglicht das Manövrieren eines Roboterarms, nachdem die Kapillare in die Zellaufhängung gelangt ist. Dieser Schritt ist notwendig, um TCC-Cluster in einzelne Zellen zu trennen. Es ist möglich, die Art der Kommissionierung während des Experiments zu ändern.
11. Konfigurieren Sie das Deck-Tablett, das die Position des Sterilisationsbehälters (Flüssigkeit 1), des Pufferbehälters (Flüssigkeit 2) und des Ablagerungsbehälters (Ziel 1 oder 2) angibt. Ziel 1 erlaubt es, sich in Teller zu legen, Ziel 2 erlaubt die Ablagerung in PCR-Rohre oder PCR-Platten.
12. Stellen Sie die Temperatur der flüssigen Tanks und der Ablagerung auf 4 ° C.
    Achtung: Der Kommissioniervorgang kann zeitaufwendig sein. Die Kühlung der Flüssigkeitsbehälter und der Ablagerung ist daher empfehlenswert
13. Positionieren Sie die ultraniedrige Befestigungsplatte mit der freigegebenen CTC-Lösung unter dem Mikroskop im Mikromanipulatorschrank. Den Deckel von der Platte nehmen und den Schrank schließen. Halten Sie die Platte bei RT für den Rest des Auf-und des Aufens während des Kommissioniervorgangs.
14. Wählen Sie manuell das Mikroskop-Objektiv für die Kommissionierung (10-20x) und die Belichtungszeit aller notwendigen Kanäle (Brightfield, FITC und TRITC-Kanäle) aus.
15. Wählen Sie gut den Navigator aus der Werkzeugleiste anzeigen, um die Art der Pickup-Platte (6-well-Platte) zu visualisieren und auszuwählen.
    Hinweis: Jede Platte oder jedes Brunnenformat kann nur vom Hersteller installiert werden.
16. Kalibrieraufholposition in der Mitte des Brunnens, der die CTCs-Lösung enthält, aber ohne Zellen in der Mitte des Sichtfeldes. Die Kalibrierung an den Kanten der Brunnen kann aufgrund der unebenen Brunnenoberfläche zu einer fehlerhaften Kalibrierung führen.
17. Verwenden Sie den Sensor, um den Boden der Platte mit der Kapillaren sanft zu berühren (Geschwindigkeit 0,01 mm/Schritt und 1% Geschwindigkeit).
18. Stellen Sie die Abholposition 0,05 mm über den Boden der Platte.
    Achtung: Achten Sie darauf, Deckel von Platten und Tanks zu öffnen und zu entfernen, bevor Sie fortfahren. Die Kapillare kann auf einem geschlossenen oder nicht entfernten Deckel zerbrechen.
    CAUTION: Wenn die Kapillare beim Kontakt mit Deckeln bricht, kann in der Umgebung oder in den Lösungen zerbrochenes Glas gefunden werden.
19. Wählen Sie den Zelltyp und die Kommissionierparameter aus. Die Kommissionierparameter können bei jedem Start eingerichtet und geladen werden. Für die Einzeller-Kommissionierung wählen Sie den manuellen Modus.
20. Im Rahmen der Einstellungen für die Auswahl :
    1. Stellen Sie das Luftspaltvolumen zwischen dem Systemöl und der Probe auf 1 μL fest.
    2. Stellen Sie das Pufferflüssitätsvolumen ein, das vor jeder Kommissionierung aufgenommen werden soll, auf 0,5 μL.
       Hinweis: Das Flüssigkeitsvolumen des Pufferflüssigkeit wird an das gesamte maximale Abholvolumen angepasst. Kleine Mengen haben keinen Einfluss auf die Kommissionierung oder die Einlagerung von Effizienz.
    3. Stellen Sie die Geschwindigkeit der Aspiration der Pufferflüssigkeit zwischen 1-6% ein.
    4. Stellen Sie die Wartezeit nach dem Streben des Puffers auf 1 s.
       Hinweis: Bei Bedarf kann die Möglichkeit genutzt werden, den Puffer aus dem Zielbrunnen statt aus dem Pufferflüssigkeitsbehälter aufzunehmen.
    5. Die Glaskapillaren und keine Sterilisation zwischen den Picks werden wiederverwendet.
       Hinweis: Die Sterilisation zwischen den Picks kann bei Bedarf manuell durchgeführt werden. Führen Sie mehrere Wäsche in H_{2 O zwischen}den Picks oder zwei Sterilisation in Ethanol, gefolgt von mehreren Waschen in H 2 O_.
21. Innerhalb der Picking-Einstellungen:
    1. Ändern Sie die Kameraeinstellungen während der Kommissionierung und Belichtungszeit unter dem Mikroskop auf 7.500 μs.
    2. Wählen Sie feste Kommissionierhöhe.
       Hinweis: Stattdessen könnte ein Werkzeugsensor oder ein Autofokus gewählt werden. Kleine Unvollkommenheiten der Platte können jedoch die Empfindlichkeit des Sensors oder den Autofokus stören, was zu einem Einschlag der Kapillare in die Platte führen kann.
    3. Setzen Sie die Aspirationsgeschwindigkeit der Kapillare , die die Quellplatte einreichten, auf 7-15%.
    4. Aktivieren Sie die interaktive Kommissionierung.
    5. Stellen Sie das Aspirationsvolumen in μL auf 0-0.05.
    6. Stellen Sie die Geschwindigkeit der Aspiration auf 5%.
    7. Stellen Sie die Wartezeit nach dem Streben in s bis 0-1 ein.
    8. Setzen Sie die Anzahl der ausgewählten Partikel pro Kapillare auf 1.
    9. Setzen Sie keine Mehrfachpickung an der gleichen Position und keine Kratzfunktionen . Die Aspirationseigenschaften müssen je nach Art des Experiments eingestellt werden (z.B. kann der automatische Kommissioniermodus größere Aspirationsmengen erfordern).
22. Innerhalb der Einlagereinstellungen :
    Hinweis: Die Einlagerungseinstellungen hängen strikt von der hinterlegten Plate/Tube ab.
    1. Für die Einzeller-Kommissionierung, definieren Sie die Geschwindigkeit der Kapillaren , die die Zielplatte auf 25%.
    2. Stellen Sie die Dosiergeschwindigkeit auf 6% fest.
    3. Setzen Sie die Wartezeit nach der Abgabe in s auf 0.
    4. Stellen Sie die Menge der Luftspalt , die im Ziel ausgegeben wird, auf 100% fest.
    5. Setzen Sie nach der Abgabe keine Spülung.
       Hinweis: Die Sterilisation kann nach der Ablagerung durchgeführt werden, um die Kapillare zu reinigen.
    6. Setzen Sie die maximale Menge an Partikeln pro Brunnen und die Anzahl der Ziele, um Partikel auf 1 zu verteilen.
    7. Kalibrierhöhe auf der Position A1 des Ziels 1 für die Platten oder auf der Position A1 des Ziels 2 für die Rohre. Legen Sie ein offenes Rohr oder eine Platte ohne Deckel für die Kalibrierung an und verwenden Sie den Sensor, um die Ablagerung sanft zu berühren (Geschwindigkeit 0,01 mm/Schritt und 1% Geschwindigkeit). Stellen Sie die Abladehöhe 1 mm über dem Boden der Platte ein.
23. Innerhalb der Einstellungen:
    1. Stellen Sie die Bühnengeschwindigkeit während der Kommissionierung auf 5-10% ein.
       Hinweis: Schnelle Bewegungen der Platte können zu einer Bewegung der Zellen in der Federung und zu Schwierigkeiten bei der Mehrfachzellenpflückung aufgrund einer Fehlpositionierung führen.
    2. Stellen Sie die Sterilisationseigenschaften mit Spülvolumen auf 1 μL, 3 Spülschleifen und 2 s Wartezeit pro Sterilisation um.
    3. Die Änderungen vor dem Schließen anwenden.
24. Navigieren Sie die Glaskapillare mit dem Joystick im Brunnen und legen Sie sie auf die einzelne Zelle von Interesse. Wählen Sie die Abnahme von Positionen in einem sicheren Abstand zum Brunnenrand (1 mm), da die Kapillare am Rand des Brunnens zerbrechen kann.
25. Fügen Sie Partikel manuell mit dem Knopf des Joysticks oder manuell aus dem Menü.
26. Wählen Sie aktivierte Partikel aus, um die Kommissionierung zu starten.
27. Die Kapillare wird 0,05 mm über der Unterseite der Platte und auf der gewählten Pickup-Position wegen der interaktiven Kommissionierung (manueller Modus) zu stoppen. Drehen Sie den Knopf des Joysticks im Uhrzeigersinn, um das Teilchen und die umgebende DPBS-Lösung manuell zu saugen. Die maximale Lautstärke ist nicht festgelegt, wenn der manuelle Modus eingeschaltet ist. Das in der Spritze zulässige maximale Volumen beträgt jedoch 25 μL.
28. Dispsen Sie die überschüssige DPBS-Lösung oder unerwünschte Partikel, indem Sie den Knopf des Joysticks gegen den Uhrzeigersinn sanft drehen. Zu viel Dosierung löst den Luftspalt der Spritze, die Blasen in Ihrer Lösung bildet und die Sichtbarkeit beeinträchtigt.
29. Drücken Sie als nächstes , um mit der Kaution fortzufahren.
30. Beobachten Sie die Kapillare, die in das abgelagernde PCR-Rohr oder die PCR-Platte eindringen, lösen Sie das Volumen aus und gehen Sie mit einer leeren Kapillare zurück in die Ausgangsposition.
    Hinweis: Wenn in der Kapillare noch Volumen übrig ist, gehen Sie mit der Sterilisation fort. Dann überprüfen Sie die Einstellungen, den Ölstand und die Ölhöhe, bevor Sie eine neue Kommissionierung durchführen.
31. Gehen Sie von Punkt 26 des Abschnitts 4 aus, um eine neue Einzeller-Kommissionierung zu starten. Bei der Kommissionierung kann es notwendig sein, die Kapillare zu ersetzen. Nach der Installation muss eine neue Kalibrierung der Pickup-Position durchgeführt werden. Wählen Sie am Ende der Kalibrierung die Funktion Kalibrierte Änderungen in Z-Höhe aus, um die Ablagenhöhe auf die neue Kapillarkalibrierung zu korrigieren und die Ablagenhöhe-Kalibrierung zu überspringen (Abschnitt 4.16).
    Hinweis: Die in Abschnitt 1-4 beschriebenen Schritte gelten für die meisten der CTC-Anreicherungs-und Isolationsmethoden. Hier berichten wir über optionale Schritte zur spezifischen CTC-Analyse.

5. Einzellen-Kommissionierung und Aussaat für Überlebens-und Proliferationsanalyse

1. Stellen Sie sicher, dass Sie mit aseptischen Lösungen und Materialien arbeiten, um die Sterilität während des gesamten Verfahrens zu erhalten.
2. Bereiten Sie eine 384 Brunnenplatte vor, um die ausgewählten einzelnen CTCs für die Kultivierung mit 20 μL CTC kulturierenden Medien³¹zu enthalten. Stellen Sie sicher, dass die CTCs nach der Manipulation in kleinen Mengen des Mediums gesät werden (z.B. 10-20 μL für eine 384 Brunnenplatte).
3. Drehen Sie die Lösung nach unten auf die Platte. 384 Brunnenplatte in das Ziel 1 legen und bei 4 ° C halten.
4. Führen Sie alle Schritte mit dem Mikromanipulator, der im Abschnitt 4 beschrieben ist, um den Mikromanipulator einzurichten und eine neue Kommissionierung zu starten.
   Hinweis: Mehrere Selektionen der einzelnen Zellen werden die Bildung einer Kommissionierliste verursachen. Die Partikel werden einzeln in aufeinanderfolgenden Brunnen gepflückt und abgelagert (siehe Abschnitt 4.22.6). Der interaktive Modus (manueller Modus) stoppt die Kapillare jedoch direkt vor dem Aspiration, so dass der Experimentator diesen kritischen Schritt steuern und eine erfolgreiche Kommissionierung gewährleisten kann. Schnelle Bewegungen der Platte können dazu führen, dass sich die Zellen in der Federung bewegen und Schwierigkeiten bei der mehrfachen Zellpflückung auftreten.
5. Nach der Einzahlung wiederholen Sie Schritt 4, um eine neue Kommissionierung zu starten.
6. Am Ende der Kommissionierung wird die Platte mit 72 x g für 4 min zentrifuge, um sicherzustellen, dass die gepflückten Zellen am Boden des Brunnens platziert werden.

6.CTC Clusterbrechen und Einzellen-Kommissionierung für die Sequenzierung

1. Stellen Sie sicher, dass Sie mit aseptischen Lösungen und Materialien arbeiten, um die Sterilität während des gesamten Verfahrens zu erhalten.
2. Bereiten Sie einzelne PCR-Rohre oder eine PCR-Platte vor, die die einzelnen Zellen des gebrochenen Clusters mit der gesamten 2,5 μL-Zell-Lysing-Lösung enthält, die 1 U/μL RNA-Inhibitor enthält.
3. Drehen Sie die Lösung schnell nach unten. Legen Sie die Ablagerbehälter in das Ziel 2 und halten Sie bei 4 ° C.
4. Führen Sie alle in Abschnitt 4 beschriebenen Schritte mit dem Mikromanipulator aus, um den Mikromanipulator einzurichten.
5. Starten Sie eine neue Kommissionierung. Die Kapillare wird 0,05 mm über der Unterseite der Platte und auf dem ausgewählten CTC-Cluster wegen der interaktiven Kommissionierung (manueller Modus) zu stoppen.
6. Drehen Sie den Knopf des Joysticks im Uhrzeigersinn, um den Cluster und die umgebende DPBS-Lösung manuell zu saugen. Dispsen Sie das abgesaugte Volumen inklusive CTC-Cluster, indem Sie den Knopf des Joysticks gegen den Uhrzeigersinn sanft drehen.
7. Wiederholen Sie die Aspirations/Entsorgung des TCC-Clusters, der in Schritt 6 beschrieben wird, bis die einzelnen Zellen, die den Cluster bilden, auseinanderbrechen.
   Hinweis: Zu viel Dosierung löst den Luftspalt der Spritze, die Blasen in Ihrer Lösung bildet und die Sichtbarkeit beeinträchtigt.
8. Folgen Sie der Position der einzelnen Zellen. Fügen Sie die Partikel manuell mit dem Knopf des Joysticks oder manuell aus dem Menü.
   Hinweis: Mehrere Selektionen der einzelnen Zellen werden die Bildung einer Kommissionierliste verursachen. Die Partikel werden einzeln in aufeinanderfolgenden PCR-Tupbes/Brunnen gepflückt und abgelagert (siehe Abschnitt 4.22.6). Der interaktive Modus (manueller Modus) stoppt die Kapillare jedoch direkt vor dem Aspiration, so dass der Experimentator diesen kritischen Schritt steuern und eine erfolgreiche Kommissionierung gewährleisten kann.
9. Wählen Sie aktivierte Partikel aus, um die Kommissionierung zu starten.
   Hinweis: Die Menge der Zell-Lysing-Lösung ermöglicht es einer einzelnen Zelle, vollständig zu lysiden. Eine lange Exposition des Lysidengehalts gegenüber dem Lysidenmittel kann jedoch DNA oder mRNA abbauen. Gehen Sie also sofort zum nächsten Schritt.
10. Schließen Sie sofort das Rohr mit der gepflückten Einzelzelle und übertragen Sie auf Trockeneis zum Einfrieren.
11. Drehen Sie schnell die Röhre und überprüfen Sie auf das Fehlen von Tropfen an den Seiten des Rohres, um eine ordnungsgemäße Lyse der abgelagerten Zelle zu gewährleisten.
12. Wiederholen Sie ab Schritt 5, um eine neue Kommissionierung zu starten.
    Hinweis: Die Mikroskop-Phase bewegt sich von einem hinzugefügten Teilchen zu einem anderen mit der Geschwindigkeit, die in Abschnitt 4.23.1 beschrieben wird. Die KZC-SFederung in der ultraniedrigen Befestigungsplatte kann sich bewegen, was zu einer fehlerhaften Kommissionierung aufgrund einer Fehlstellung führt.

7. CTCs Isolation für die Mauseinspritzung

1. Stellen Sie sicher, dass Sie mit aseptischen Lösungen und Materialien arbeiten, um die Sterilität während des gesamten Verfahrens zu erhalten.
2. Bereiten Sie ein PCR-Rohr mit 5 μL sterilen 1x DPBS vor.
3. Drehen Sie die Lösung schnell nach unten. Legen Sie die Ablagerbehälter in das Ziel 2 und halten Sie bei 4 ° C.
4. Innerhalb der Einlageneinstellungen wird eine Änderung im Schritt 4.22.6 angewendet: Setzen Sie die maximale Menge an Partikeln pro gut 1.000 und die Anzahl der Ziele , um Partikel auf 1 zu verteilen. Dieser Schritt sorgt dafür, dass die ausgewählten Zellen 1.000 Mal im selben Rohr abgelegt werden.
5. Verwenden Sie nur den interaktiven Modus (manueller Modus), um den Kommissionierschritt präzise zu steuern und die gewählte Lösung frei von Schadstoffzellen zu halten.
   Hinweis: Wenn mehr als 1.000 Zellen benötigt werden, erhöhen Sie die Anzahl der Ziele, um Partikel zu verteilen, um den Verlust von Proben nach 1.000 Zellen zu vermeiden.
6. Setzen Sie die Schritte des Abschnitts 4.26 fort, um eine neue Kommissionierung zu starten. Wiederholen Sie den Schritt 6, um mehrere Tonungen durchzuführen. Kommentieren Sie die Anzahl der Zellen, die bei jeder Kommissionierung gesammelt wurden, um die Anzahl der Zellen, die für die Maus-Injektion zur Verfügung stehen, zu verfolgen.
7. Am Ende der Kommissionierung, Zentrifuge die Röhre mit 72 x g für 4 min (siehe Abschnitt 3.1.) und Aspirat supernatant.
8. Die gesammelten CTCs in den Puffer der Wahl, geeignet für die Mauseinspritzung, wiederverwenden. Für die Säugetierfettpolsterinjektion sollten Sie die gesammelten CTCs in einem Verhältnis von 1 zu 1 von 1x DPBS wiederbeleben und die Kellermembran extrahieren und bis zur Injektion bei 4 ° C halten. Für die intravenöse Injektion können Sie die gesammelten CTCs nur in DPBS wiederverwenden.
   Hinweis: Das Volumen der Lösung hängt streng von der Anzahl der zu injizierenden CTCs ab. Es wird empfohlen, in das Säugetierfettpolster oder intravenös maximal 100 μL pro Maus einzuschleusen. Bei der Berechnung des Volumens sollten Sie immer das abgestorbene Volumen für die Manipulation und Spritladung berücksichtigen.

Der vorgestellte Workflow ermöglicht die Erstellung einzelner CTCs, entweder von einzelnen CTCs oder getrennt von CTC-Clustern. CTCs von Patienten oder tumortragenden Mäusen werden mit den verfügbaren CTC-Anreicherungsmethoden aus Vollblut angereichert und dann mit Antikörpern gegen krebserregende Marker (z.B. EpCAM, grün) und WBC-spezifische Marker (z.B. CD45, rot) (Abbildung 1A) gebeizt. ). Das gefärbte CTC-Produkt wird dann in die Mikromanipulationsstation übertragen, wo einzelne Zellen gepflückt, in PCR-Rohren oder Multiwell-Platten deponiert und für die nachgelagerte Analyse, einschließlich Einzeller-Sequenzierung, in der vitro-Kultur oder In vivo Assays (Abbildung 1B).

Die Zuverlässigkeit dieser Methode basiert auf einer korrekten Zielzellunterschiede bei der manuellen Zellauswahl. Die Live-Immunfärbung mit Anti-PCAM-Antikörpern visualisiert Krebszellen in der Suspendierung und ermöglicht eine genaue Unterscheidung von CD45-positiven Ereignissen (höchstwahrscheinlich WBCs) (Abbildung 2A). Wenn CellCelector richtig kalibriert und gewartet wird, bietet es eine gut kontrollierte Zellmanipulation. Die präzise CTC-Isolierung zeichnet sich durch das Streben nach nur dem gewünschten Zielohneumgebende Schadstoffzellen (RBCs oder WBCs) aus, wie auf den Bildern zu sehen ist, die vor und nach dem CTC-Cluster-Aspiration aufgenommen wurden (Abbildung 2B, C).

Wie bereits beschrieben, zeigen die CTC-Cluster einen metastasigeren Phenotyp im Vergleich zu den passenden einzelnen CTCs19. Doch ob das Vorhandensein benachbarter Zellen ausreicht, um die Proliferationsrate von Zellen innerhalb von Clustern zu erhöhen, ist unbekannt. Um dieser Frage zu begegnen, wurden 1009 einzelne CTC-Cluster und 1008 CTC-Cluster zwischen 2-17 Zellen (89,5% davon 2-5 Zellhaufen), die aus der CTC-abgeleiteten BR16-Zelllinie20 stammen, in einzelne Brunnen von 384-gut mikromanipuliert. Ultraniedrige Befestigungsplatten. Die Anzahl der lebenden Zellen in jedem Brunnen wurde manuell unter dem Mikroskop gezählt und wöchentlich aufgezeichnet. Alle Analysen wurden nach der Normalisierung der Zellzahl durchgeführt (d.h. der Drei-Zellen-Cluster wurde als drei einzelne Zellen analysiert). Erfolglose Kolonien waren durch den Mangel an lebenden Zellen im Brunnen am Ende des Experiments gekennzeichnet. Wie vermutet, zeigten die CTC-Cluster ein erhöhtes Überleben im Vergleich zu einzelnen CTCs und führten innerhalb von 56 Tagen nach der In-vitro-Kultivierung zu Zellkolonien (Abbildung 3A, 3B). Insbesondere zeigten die CTC-Cluster auch eine höhere Promillungsrate und erreichten damit höhere Endzellzahlen (Abbildung 3C), was darauf hindeutet, dass der direkte Kontakt mit anderen Tumorzellen sowohl auf ihre Lebensfähigkeit als auch auf ihre Proliferationsrate Einfluss hat.

Schließlich stellen wir einzellere RNA-Sequenzierungsdaten von KZCs zur Verfügung, die direkt von Brustkrebspatientinnen isoliert sind. Insbesondere zeigen wir eine T-Distributive stochastic Neighbor Embedding (tSNE) von einzelnen Zellen, die entweder aus einzelnen CTCs, CTC-Clustern oder CTC-WBC-Clustern (Abbildung4) abgeleitet werden. Dieser Ansatz ermöglicht die Identifizierung von Zellen mit ähnlichem Genexpressionsprofil sowie die Unterscheidung von Zellpopulationen, die sich aufgrund der Expression bestimmter Gene unterscheiden.

Bild 1 . Schematische Darstellung des experimentellen Arbeitsablaufs. A) CTCs werden aus dem Blut von Krebspatienten oder Mauskrebsmodellen gewonnen, mit Hilfe verfügbarer Methoden angereichert und mit Antikörpern gekennzeichnet, um Tumorzellen (grün) aus weißen Blutkörperchen (rot) zu unterscheiden. B) Die präzise Mikromanipulation von KZCs ermöglicht mehrere Verfahren und Anwendungen, wie z.B. Einzelleistungen, CTC-Kultur oder in vivo-Transplantationsexperimenten . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Bild 2 . Repräsentative Bilder von CTCs vor und nach der Mikromanipulation. A) repräsentative Bilder von CTCs, die von einem CZC-abgeleiteten Fremdengramm (NSG-CDX-BR16) abgeleitet und mit Antikörpern Anti-EpCAM (grün) und Anti-CD45 (rot) befleckt sind, um die Visualisierung von CTCs und weißen Blutkörperchen zu ermöglichen. Vergrößerung 40x wird angezeigt. (B, C) Die Mikromanipulation ermöglicht die genaue Trennung von CTCs von unerwünschten Zellen, wie sie in den Bildern vor (links) und nach (rechts) Zell-Aspirationsverfahren dargestellt wird. Vergrößerung 10x. Gezeigt werden das größere Sichtfeld (B) bzw. das engere Sichtfeld ( C) . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 

Bild 3 . Überlebens-und Proliferationsanalyse einzelner CTCs und CTC-Cluster. Einzelne Zellen aus einzelnen CTCs oder CTC-Clustern aus kultivierten CTC-abgeleiteten BR16-Zellen wurden in 384-Brunnenplatten mikromanipuliert. (A) Kaplan-Meier-Handlung, die die Überlebenswahrscheinlichkeit von gesäten Einzelzellen gegenüber Zellhaufen zeigt. P& lt;0.0001 nach paarweiser Log-Rank-Test. B) Balkendiagramm, das den Anteil der Kolonien darstellt, die am Ende des Experiments aus lebenden Zellen bestanden (Tag 56). P& lt;0.0001 by chi-square-Test. (C) Heatmaps zur Visualisierung der normalisierten Zellnummernverteilung im Laufe des Experiments (Tag 0,8,32,56). Jeder Block stellt eine Startzelle dar, und die Hitzekarte zeigt die Anzahl der Zellen pro Brunnen zu einem bestimmten Zeitpunkt an. d = Tag. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Bild 4 . Einzelleistungen RNA-Sequenzierung. Visualisierung von CTC-RNA-Expressionsdaten mit T-Distributions-ochastic Neighbor Embedding (tSNE). Jeder Punkt stellt eine einzelne Zelle dar, die von einem einzelnen CTC, einem CTC-Cluster oder einem CTC-WBC-Cluster abgeleitet wird. Die Farben der Punkte entsprechen der Spenderausweise. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

N.A. und B.M.S. sind als Erfinder in Patentanmeldungen gelistet, die sich auf zirkulierende Tumorzellen und die Behandlung von Krebs beziehen. N.A. ist bezahlter Berater für Pharma-und Versicherungsunternehmen mit Interesse an flüssiger Biopsie.