Methodenartikel

Anwendung der Biolayer-Interferometrie (BLI) zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen bei der Transkription

DOI:

10.3791/59687

⸱

26. Juli 2019

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Robert Wood Johnson Medical School, Rutgers University, 2Graduate Program in Physiology and Integrative Biology, School of Graduate Studies, Rutgers University, 3Department of Plant Biology, School of Environmental and Biological, Rutgers University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wechselwirkungen von Transkriptionsfaktoren (TFs) mit der RNA-Polymerase werden in der Regel mit Pulldown-Assays untersucht. Wir wenden eine Biolayer Interferometry (BLI) Technologie an, um die Wechselwirkung von GrgA mit der Chlamydien-RNA-Polymerase zu charakterisieren. Im Vergleich zu Pulldown-Assays erkennt BLI Echtzeit-Assoziation und Dissoziation, bietet eine höhere Empfindlichkeit und ist sehr quantitativ.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein Transkriptionsfaktor (TF) ist ein Protein, das die Genexpression reguliert, indem es mit der RNA-Polymerase, einem anderen TF und/oder Schablonen-DNA interagiert. GrgA ist ein neuartiger Transkriptionsaktivator, der speziell im obligaten intrazellulären bakteriellen Erreger Chlamydien gefunden wurde. Protein-Pulldown-Assays mit Affinitätsperlen haben gezeigt, dass GrgA zwei Faktoren bindet, nämlich66 und28, die verschiedene Sätze von Promotoren für Gene erkennen, deren Produkte in Entwicklungsstadien unterschiedlich benötigt werden. Wir haben BLI verwendet, um die Interaktionen zu bestätigen und weiter zu charakterisieren. BLI zeigt mehrere Vorteile gegenüber Pulldown: 1) Es zeigt Echtzeit-Assoziation und Dissoziation zwischen Bindungspartnern, 2) Es erzeugt quantitative kinetische Parameter, und 3) Es kann Bindungen erkennen, die Pulldown-Assays oft nicht erkennen. Diese Eigenschaften haben es uns ermöglicht, die physiologischen Rollen von GrgA bei der Genexpressionsregulation in Chlamydienund mögliche detaillierte Wechselwirkungsmechanismen abzuleiten. Wir stellen uns vor, dass diese relativ erschwingliche Technologie äußerst nützlich für das Studium der Transkription und anderer biologischer Prozesse sein kann.

Einleitung

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Die Transkription, die RNA-Moleküle unter Verwendung von DNA als Vorlage produziert, ist der allererste Schritt der Genexpression. Die bakterielle RNA-Synthese beginnt nach der Bindung des RNA-Polymerase(RNAP)-Holoenzyms an einen Zielpromotor1,2. Das RNAP-Holoenzym (RNAPholo) besteht aus einem katalytischen Multi-Subunit-Kern (RNAPcore) und einem Faktor , der für die Erkennung der Promotorsequenz erforderlich ist. Transkriptionsaktivatoren und Repressoren, kollektiv tFs, regulieren die Genexpression durch die Bindungskomponenten des RNAPcore, Faktoren und/oder DNA. Je nach Organismus kann ein erheblicher Teil seines Genoms TFs gewidmet werden, die die Transkription als Reaktion auf physiologische Bedürfnisse und Umwelthinweise regulieren3.

Chlamydien ist ein obligat intrazelluläres Bakterium verantwortlich für eine Vielzahl von Krankheiten bei Menschen und Tieren4,5,6,7,8. Zum Beispiel ist Chlamydia trachomatis wohl die Nummer eins sexuell übertragbarer Erreger beim Menschen weltweit und eine der Hauptursachen für Erblindung in einigen unterentwickelten Ländern4,5. Chlamydien hat einen einzigartigen Entwicklungszyklus gekennzeichnet durch zwei abwechselnde zelluläre Formen, die als Elementarkörper (EB) und Retikulatkörper (RB)9bezeichnet werden. Während EBs in einer extrazellulären Umgebung überleben können, sind sie nicht in der Lage, sich zu vermehren. EBs gelangen durch Endozytose in Wirtszellen und differenzieren sich innerhalb weniger Stunden nach der Inokulation in größere RBs in einer Vakuole im Wirtszytoplasma. Nicht mehr infektiös, RBs vermehren sich durch binäre Spaltung. Gegen 20 h beginnen sie sich wieder zu den EBs zu differenzieren, die die Wirtszellen um 30-70 h verlassen.

Das Fortschreiten des Chlamydien-Entwicklungszyklus wird durch Transkription reguliert. Während während des Midzyklus, in dem sich RBs aktiv replizieren, eine Übermehrheit der fast 1.000 Chlamydiengene exprimiert wird, wird nur eine kleine Anzahl von Genen unmittelbar nach dem Eintritt von EBs in die Wirtszellen transkribiert, um die Umwandlung von EBs in RBs, und ein weiterer kleiner Satz von Genen werden transkribiert oder zunehmend transkribiert, um die Differenzierung von RBs in EBs10,11zu ermöglichen.

Das Chlamydien-Genom kodiert drei Faktoren, nämlich66,28 und54. 66, was der Haushaltsführung von E. coli und anderen Bakterien entspricht, ist für die Erkennung von Promotoren von Frühen- und Midcycle-Genen sowie einiger später Gene verantwortlich, währendfür die transkription bestimmter später Gene. Es ist bekannt, dassmehrere Gene sowohl einen -66-abhängigen Promotor als auch einen 28-abhängigen Promotor12tragen.

Trotz eines komplizierten Entwicklungszyklus wurde nur eine geringe Anzahl von TFs in Chlamydiengefunden 13. GrgA (früher als hypothetisches Protein CT504 in C. trachomatis serovar D und CTL0766 in C. trachomatis L2) ist ein Chlamydien-spezifischerTF, der ursprünglich als Aktivator von66-abhängigen Genen14anerkannt wurde. Affinity Pulldown-Assays haben gezeigt, dass GrgA ihre Transkription aktiviert, indem sie sowohl66 € als auch DNA bindet. Interessanterweise wurde später festgestellt, dass GrgA auch mit28, und aktiviert Transkription von28-abhängigen Promotoren in vitro15. Um zu untersuchen, ob GrgA ähnliche oder unterschiedliche Affinitäten für66 und28€ hat, haben wir auf die Verwendung von BLI zurückgegriffen. BLI-Assays haben gezeigt, dass GrgA mit einer 30-fach höheren Affinität als mit28000 Personen interagiert, was darauf hindeutet, dass GrgA unterschiedliche Rollen in der -66-abhängigen Transkription und der28-abhängigenTranskription spielen kann. 15.

BLI erkennt das Interferenzmuster von weißem Licht, das von einer Schicht immobilisierten Proteins an der Spitze eines Biosensors reflektiert wird, und vergleicht es mit dem einer internen Referenzschicht16. Durch die Analyse dieser beiden Interferenzmuster kann BLI wertvolle und Echtzeitinformationen über die Menge an Protein liefern, die an die Spitze des Biosensors gebunden ist. Das Protein, das bis zur Spitze des Biosensors immobilisiert ist, wird als Liganden bezeichnet und in der Regel mit Hilfe eines gemeinsamen Antikörpers oder Epitop-Tags (z. B. einem Poly-His- oder Biotin-Tag) immobilisiert, das eine Affinität zu einem assoziierten Teilchen (wie NTA oder Streptavidin) auf der Spitze des Biosensors. Die Bindung eines Sekundärproteins, das als Analyt bezeichnet wird, mit dem Liganden an der Spitze des Biosensors führt zu Veränderungen in der Deckkraft des Biosensors und führt somit zu Veränderungen der Interferenzmuster. Bei wiederholter Konzentration verschiedener Konzentrationen des Analyten kann BLI nicht nur qualitative, sondern auch quantitative Informationen über die Affinität zwischen Liganden und Analyt16liefern.

Nach bestem Wissen und Gewissen waren wir die ersten, die BLI einsetzten, um Protein-Protein-Wechselwirkungen in der Transkription15zu charakterisieren. In dieser Publikation zeigen wir, dass ein GrgA-Fragment, das zuvor für die Bindung von28€ erforderlich war, die Bindung tatsächlich vermittelt. Dieses Manuskript konzentriert sich auf Schritte der BLI-Assays und die Generierung von BLI-Diagrammen und Parametern der Bindungskinetik. Methoden zur Herstellung (und Reinigung) von Liganden und Analyten werden hier nicht behandelt.

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Protokoll

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1. Herstellung von Proteinen

  1. Verwenden Sie einen Dialysebeutel (mit einer entsprechenden Cut-off-Größe), um jedes Protein, das für BLI-Assays verwendet werden soll (einschließlich des Mitbezeichenten Liganden und des Analyten), gegen 1.000 Volumina des BLI-Puffers (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM MgCl2) zu dialysieren. , 0,1 mM DTT, pH 8,0, vorgekühlt auf 4 °C) bei 4 °C für 4 h.
    HINWEIS: BLI-Assays erfordern, dass der Liganden in Konzentrationen vorhanden ist, die die Bindungsstellen am Biosensor und dem Analyten sättigen, um hoch gereinigt zu werden, so dass die Molkonzentrationen des Analyten, die mit dem Liganden reagieren, bekannt sind. Methoden zur Expression und Reinigung von His- und Strep-markierten Proteinen werden hier nicht behandelt, können aber in früheren Publikationen14,15gefunden werden. Obwohl dieses System nicht erfordert, dass der Liganden in hochgereinigter Form ist, ist es wichtig, auch ungereinigte Liganden in den BLI-Puffer zu dialysieren, um Verschiebungen in Weißlicht-Interferenzmustern zu minimieren, die durch Pufferänderungen während des Assays verursacht werden.
  2. Wechseln Sie zu einem frischen BLI-Puffer und setzen Sie die Dialyse für weitere 4 h fort.

2. Biosensor-Hydratation und Assay-Einrichtung

  1. Ungefähr 10 min vor Beginn eines Assays, Pipette 200 l des BLI-Puffers in ein PCR-Rohr.
  2. Entfernen Sie einen Ni-NTA-Biosensor aus der Originalverpackung, indem Sie den breiten Teil des Biosensors mit einer handgeliebten Hand halten.
  3. Legen Sie den Biosensor über die PCR-Röhre, so dass nur die Glasspitze des Biosensors in den BLI-Puffer eingetaucht ist.
  4. Halten Sie die Biosensorspitze mindestens 10 min unter Wasser, um eine vollständige Hydratation zu gewährleisten.
    1. Stellen Sie sicher, dass die Glasspitze des Ni-NTA-Biosensors während des obigen Schritts nichts anderes als den BLI-Puffer berührt.
      HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet einen Ni-NTA-Biosensor in Verbindung mit einem Mithis-tags agged Ligand. Bei Bedarf kann ein SA-Streptavidin-Biosensor stattdessen in Verbindung mit einem biotinylierten Liganden verwendet werden, wenn: (i) sowohl der Liganden als auch der Analyt ein His-Tag tragen oder (ii) keiner von ihnen.
  5. Schalten Sie die BLItz-Maschine ein.
  6. Stellen Sie sicher, dass das Gerät über einen USB-Datenausgangsanschluss auf der Rückseite des Geräts mit dem Computer verbunden ist.
  7. Öffnen Sie auf dem Computer die zugehörige Software (z. B. BLItz Pro) und klicken Sie auf Advanced Kinetics auf der linken Seite des Bildschirms.
  8. Geben Sie in der Software alle entsprechenden Informationen über das Experiment (einschließlich Desatonname, Beschreibung, Beispiel-ID und Proteinkonzentration) unter den jeweiligen Überschriften ein.
  9. Klicken Sie auf Biosensor Type und wählen Sie Ni-NTA aus dem Dropdown-Menü.
    1. Überprüfen Sie unter der Überschrift Ausführungseinstellungen, ob der Shaker auf Aktivierenfestgelegt ist.
    2. Überprüfen Sie unter der Überschrift Schritttypliste, ob 5 Elemente aufgeführt sind: Anfangsbasislinie, Laden, Baseline, Zuordnung und Dissoziation.
      HINWEIS: Die Dauer jedes Schritts kann bei Bedarf von der Standardeinstellung geändert werden. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, verwenden Sie mindestens 30 s für Initial Baseline und Baseline. und 120 s für Vereinigung und Dissoziation. Die Dauer des Ladeschritts (von 120 bis 240 s) hängt von der Konzentration des Liganden und der Affinität des His-Epitop-Tags auf dem Liganden zum Ni-NTA-Biosensor ab.
  10. Entfernen Sie den hydratisierten Ni-NTA-Biosensor aus dem PCR-Rohr und befestigen Sie ihn an der Biosensorhalterung an der Maschine, indem Sie den breiten Teil des Biosensors auf die Halterung schieben.
    HINWEIS: Lassen Sie den Biosensor während des Experiments nicht austrocknen.
  11. Legen Sie ein 0,5 ml schwarzes Mikrozentrifugenrohr in den Rohrhalter der Maschine und die Pipette 400 l des BLI-Puffers hinein.
  12. Stellen Sie sicher, dass der Schieberegler der Maschine so positioniert ist, dass sich der Rohrhalter vor dem schwarzen Pfeil auf der Maschine befindet.
  13. Schließen Sie die Abdeckung der Maschine so, dass die Biosensorspitze in den Puffer im Mikrozentrifugenrohr eingetaucht wird.
  14. Klicken Sie auf Weiter in der Software, um mit der Aufnahme der Initial Baseline zu beginnen.

3. Verladen von Liganden auf Biosensor

  1. Öffnen Sie nach Abschluss der Aufnahme der Initial Baseline die Abdeckung der Maschine.
  2. Bewegen Sie den Schieberegler so nach rechts, dass sich der Fallhalter (anstelle des Rohrhalters) vor dem schwarzen Pfeil befindet.
  3. Pipette 4 l eines dialysierten Zintands (ab Schritt 1.1) auf den Fallhalter und schließen Sie die Abdeckung der Maschine.
    HINWEIS: Die optimale Konzentration des zu verwendenden Liganden kann für jedes Protein variieren. Eine Konzentration zwischen 1,0 und 2,0 mg/ml ist in der Regel ausreichend, um die NTA an der Spitze des Biosensors in 240 s zu sättigen.
  4. Klicken Sie in der Software auf Weiter, um mit dem Laden zu beginnen.

4. Zusätzliche Liganden wegwaschen

  1. Nachdem der Ladeschritt die Aufnahme beendet hat, öffnen Sie die Abdeckung der Maschine.
  2. Bewegen Sie den Schieberegler so nach links, dass sich der Rohrhalter wieder vor dem schwarzen Pfeil befindet.
  3. Schließen Sie den Deckel der Maschine und stellen Sie sicher, dass die Biosensorspitze in den BLI-Puffer des Rohres im Rohrhalter eingetaucht ist.
  4. Klicken Sie erneut auf weiter in der Software, um mit der Aufnahme der Baseline zu beginnen.

5. Assoziation von Analyten zu Ligand

  1. Nachdem der Baseline-Schritt die Aufnahme abgeschlossen hat, öffnen Sie die Abdeckung der Maschine.
  2. Entfernen Sie den Tropfenhalter und reinigen Sie ihn, indem Sie ein Protein auspfeifen und mit doppelt-deionisiertem Wasser (ddH2O) für insgesamt 5 Mal ausspülen.
    1. Verwenden Sie ein Tuch, um die Oberfläche des Tropfenhalters nach dem Waschen zu reinigen.
  3. Ersetzen Sie den Fallhalter wieder auf die Maschine.
  4. Bewegen Sie den Schieberegler auf der Maschine so nach rechts, dass sich der Fallhalter wieder vor dem schwarzen Pfeil befindet.
  5. Pipette 4 l eines Dialysed-Analyten (ab Schritt 1.1) auf den Fallhalter und schließen Sie die Abdeckung der Maschine.
  6. Klicken Sie in der Software auf Weiter, um die Zuordnung zu starten.

6. Dissoziation des Analyten von Ligand

  1. Nachdem der Assoziationsschritt die Aufnahme beendet hat, öffnen Sie die Abdeckung der Maschine.
  2. Bewegen Sie den Schieberegler auf der Maschine so nach rechts, dass sich der Rohrhalter wieder vor dem schwarzen Pfeil befindet.
  3. Klicken Sie in der Software auf Weiter, um mit der Dissoziation zu beginnen.
  4. Nachdem der Dissoziationsschritt die Aufnahme beendet hat, öffnen Sie die Abdeckung der Maschine.
  5. Entfernen Sie den Fallhalter und den Rohrhalter.
  6. Spülen Sie beide mit ddH2O gründlich ab, um jedes Protein wegzuwaschen.
  7. Entfernen Sie den Biosensor und entsorgen Sie ihn sicher.

7. Sichwiederholende Wechselwirkungen mit unterschiedlichen Konzentrationen

  1. Wiederholen Sie die Schritte 2-7 für dasselbe Ligand-Analyt-Paar mit unterschiedlichen Analytkonzentrationen.
    HINWEIS: Die Konzentration des Analyten muss möglicherweise über mehrere Durchläufe angepasst werden, bevor optimale Ergebnisse erzielt werden können. Unserer Erfahrung nach ist ein Verhältnis von 1:5:10 an Analytkonzentrationen, beginnend mit 75 nM, in der Regel ausreichend.

8. Analysieren der Daten mit der Software

  1. Sobald alle Durchläufe abgeschlossen sind, speichern Sie die Daten in der Software, indem Sie auf Datei klicken und dann Experiment speichern wie auf der linken Seite des Bildschirms.
  2. Wählen Sie unter der Überschrift Daten ausführen die Option Schrittkorrektur und Anpassung (1:1) aus, und klicken Sie auf Analysieren, um kinetische Daten zu generieren.
  3. Um die quantitativen Daten in ein Arbeitsblatt zu extrahieren und Diagramme zu generieren, klicken Sie auf In CSV exportieren und speichern Sie die aufgezeichneten Daten als CSV-Datei. Öffnen Sie die CSV-Datei mit Tabellenkalkulationssoftware.
    1. Um die Zuordnungs- und Dissoziationskintik am effektivsten anzuzeigen, entfernen Sie alle Plotpunkte vor dem Baseline-Schritt, und normalisieren Sie alle nachfolgenden Plotpunkte aus dem endgültigen Basiswert.

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Ergebnisse

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Durch BLI-Assays haben wir zuvor festgestellt, dass die Bindung von GrgA an 28 Dollar von einem 28 Aminosäure-Mittelbereich (Rückstände 138-165) von GrgA15abhängt. Dementsprechend hatte ein GrgA-Löschkonstrukt ohne diese Region (NH-GrgA-138-165) im Vergleich zu N-terminally His-tagged Full-Length GrgA (NH-GrgA) eine verringerte Assoziationsrate und eine erhöhte Dissoziationsrate, was zu einem 3-millionenfachen Verlust der Gesamt- Affinität (Tabelle 1). Hier zeigen wir, ...

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Diskussion

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Protein-Protein-Wechselwirkungen sind entscheidend für die Regulierung der Transkription und anderer biologischer Prozesse. Sie werden am häufigsten durch Pulldown-Assays untersucht. Obwohl Pulldown-Assays relativ einfach durchzuführen sind, sind sie schlecht quantitativ und können schwache, aber biologisch sinnvolle Wechselwirkungen möglicherweise nicht erkennen. Im Vergleich dazu bietet BLI durch die Erkennung von Echtzeitassoziation und Dissoziation zwischen einem Liganden und einem Analyten Assoziations- und Dissozia...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (Grants AI122034 und AI140167) und der New Jersey Health Foundation (Grant- PC 20-18) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BLItz-MaschineForteBio45-5000
Dialyseschlauch ZellulosemembranMilliporeSigmaD9652
Dip and Read Ni-NTA Biosensor-TablettForteBio18-5101Gebrauchsfertige Ni-NTA-Biosensoren für Poly-His-markierte Proteine
TropfenhalterForteBio45-5004
PCR-Röhrchen (0,2 mL)Thomas Scientific
Mikrozentrifugenröhrchen (schwarz)Thermo Fisher Scientific03-391-166
KimwipesThermo Fisher Scientific06-666A
DTTThermo Fisher ScientificR0861
EDTAMilliporeSigmaE6758
MgCl2MilliporeSigmaM8266
NaClMilliporeSigmaS9888
Tris-HClGoldBioT095100
CLS6571

Referenzen

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Schlagwörter

TranskriptionsfaktorChlamydiaGrgASigma Faktorenkinetische ParameterNickel NTA BiosensorEchtzeit Assoziations und Dissoziationsanalyse

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