Summary
Wij beschrijven procedures voor de verwerking van pasgeboren rat hersenweefsel te verkrijgen hoge-resolutie elektronen micrografen voor Morphometric analyse van de synaptische blaasje distributie bij zenuw terminals. De met deze methoden verkregen micrografen kunnen ook gebruikt worden om de morfologie van een aantal andere cellulaire componenten en hun dimensionale structurele relaties te bestuderen.
Abstract
Ons laboratorium en vele anderen hebben de hoge oplossende kracht van transmissie elektronenmicroscopie benut om de morfologie en ruimtelijke ordening van synaptische blaasjes te bestuderen. Voor het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige elektronen micrografen die de mate van morfologische details die nodig zijn voor de kwantitatieve analyse van pre-synaptische blaasje distributie kan opleveren, is een optimale specimen voorbereiding van cruciaal belang. Chemische fixatie is de eerste stap in het proces van het specimen voorbereiding, en van het allergrootste belang voor het behoud van fijne fijnstructuur. Vasculaire fixatie met een glutaraldehyde-formaldehydeoplossing, gevolgd door de behandeling van vibratome specimens met osmium tetroxide, stabiliseert het maximum aantal moleculen, met name eiwitten en lipiden, en resulteert in een superieure instandhouding van fijnstructuur. Weefsel wordt vervolgens verwerkt met counterstaining, sequentiële uitdroging en hars-inbedding. En bloc kleuring met uranyl acetaat (dat wil zeggen, kleuring van vibratome weefsel voor hars inbedding) verbetert endogene contrast en stabiliseert cel componenten tegen extractie tijdens het monster verwerking. Contrast kan verder worden verhoogd door het toepassen van uranyl acetaat als een post-vlek op ultradunne secties. Dubbel-kleuring van ultradunne secties met lood citraat na uranyl acetaat behandeling verbetert ook de beeldresolutie, door het intensiveren van elektronen-opaciteit van nucleïnezuur-bevattende structuren door middel van selectieve binding van lood tot uranyl acetaat. Transmission Electron microscopie is een krachtig hulpmiddel voor de karakterisering van de morfologische Details van synaptische blaasjes en kwantificering van hun grootte en ruimtelijke organisatie in de Terminal Bouton. Echter, omdat het gebruik maakt van vaste weefsels, transmissie elektronenmicroscopie kan alleen indirect informatie over levende of evoluerende processen. Daarom moeten andere technieken worden overwogen wanneer de belangrijkste doelstelling is het bestuderen van dynamische of functionele aspecten van de synaptische blaasje handel en exocytose.
Introduction
We beschrijven methoden voor de bereiding van pasgeboren rat hersenweefsel te verkrijgen van hoge kwaliteit elektronen micrografen voor diepgaande Morphometric analyse van de synaptische blaasje ruimtelijke verdeling bij zenuw terminals1,2. De High-contrast-micrografen die kunnen worden verkregen door de verwerking van specimens naar aanleiding van deze methoden kan ook worden gebruikt om de gedetailleerde morfologie van een aantal cellulaire componenten en hun dimensionale structurele relaties te bestuderen3,4.
De Transmission Electron Microscoop (TEM) is een krachtig instrument om de morfologie van organellen en andere cellulaire structuren kwantitatief te bestuderen. Vanaf dit decennium, zijn er geen andere methodes van onderzoek die de zelfde graad van resolutie van lipide membranen en organellen zonder immuun-tagging, met uitzondering van cryofixation door hoge druk het bevriezen kunnen verstrekken. Echter, bevriezing substitutie technieken zijn niet op grote schaal gebruikt, en normaalgesproken dure apparatuur en lange voorbereiding tijden.
Om gebruik te kunnen maken van de hoge oplossings kracht van TEM is een optimale specimen voorbereiding van het allergrootste belang. De belangrijkste doelstellingen van specimen voorbereiding zijn weefselstructuur met minimum wijziging van de het leven staat te bewaren, specimen contrast te verbeteren, en het weefsel tegen extractie van cellulaire componenten tijdens verwerking en blootstelling aan het elektron te stabiliseren Beam. Talrijke protocollen voor de voorbereiding van de TEM-weefsels zijn door de jaren heen geïntroduceerd en geperfectioneerd door verschillende laboratoria. Velen van hen hebben zich geconcentreerd op methoden voor een optimale visualisatie van synaptische blaasjes5,6,7,8,9,10,11. Onder een aantal gevestigde, goudstandaard methoden die momenteel in gebruik zijn, kozen we voor de procedures voor chemische fixatie, post fixatie, en bloc kleuring, sequentiële uitdroging, hars inbedding en post kleuring die gericht zijn op het behoud van optimale weefselstructuur en uitstekende beeldcontrast te bereiken. Van de nota, het behoud van fijne fijnstructuur kan bijzonder uitdagend zijn bij het werken met pasgeboren rat hersenweefsel. In feite is het centrale zenuwstelsel van zeer jonge dieren wordt gekenmerkt door een hoger watergehalte dan de volwassen hersenen, meer prominente uitbreiding van de extracellulaire ruimten, en losser verbindingen tussen de cellen12. Dit maakt pasgeboren rat hersenweefsel diep gevoelig voor veranderingen in osmolariteit, en prachtig vatbaar voor artefactuele krimp en/of zwelling bij verwerking door middel van sequentiële oplossingen van verschillende tonicity12. Daarom werkten onze methodes oplossingen voor specimen verwerking die van osmolariteit zo dicht mogelijk aan dat van Rat pasgeboren hersenen zijn. Ons doel was om hoge kwaliteit, hoge-resolutie elektronenmicroscopie beelden voor kwantitatieve beoordeling van de synaptische blaasje ruimtelijke verdeling bij zenuw terminals te verkrijgen. Concreet wilden we het aantal blaasjes meten in de zenuw Terminal, de afstand van synaptische blaasjes uit de pre-synaptische plasmamembraan, het aantal blaasjes gedokt op de pre-synaptische membraan, de grootte van synaptische blaasjes en de Inter-blaasje afstanden1.
Bevredigende chemische fixatie is een voorwaarde voor het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige elektronen micrografen die de morfologische details die nodig zijn om synaptische blaasje morfologie en ruimtelijke organisatie te bestuderen kan bieden. Hoewel er verschillende wijzen van fixatie bestaan, fixatie van hersenweefsel door vasculaire bloeding is beslist superieur aan andere methoden. Aangezien fixatie via vasculaire bloeding onmiddellijk na de arrestatie van de systemische circulatie begint, verkort het interval tussen ontzuuring van het hersenweefsel en cross-linking van eiwitten met Fixatieven, wat resulteert in minimale veranderingen in de cel Structuur. Bovendien verwezenlijkt het snelle en eenvormige penetratie, wegens de snelle stroom van fixatief van het vasculaire bed aan de extracellulaire en cellulaire compartimenten12,13,14. Primaire fixatie met glutaraldehyde, gevolgd door secundaire fixatie (post-fixatie) met osmium tetroxide, levert een uitstekende bewaring van de fijne structuur15,16,17. Een mengsel van glutaraldehyde en Paraformaldehyde heeft het extra voordeel van snellere penetratie in weefsel12.
Aangezien de biologische weefsels niet voldoende stijf zijn om in dunne secties zonder de steun van een hars matrijs worden gesneden, moeten zij in een middel vóór dunne sectie worden ingebed. Water-onmengbare epoxyharsen worden vaak gebruikt als een inbedding medium in TEM. Wanneer dit type van matrijs wordt gebruikt, moet het vrije water van het specimen met een organisch oplosmiddel vóór hars infiltratie worden vervangen. Water wordt verwijderd door het passeren van het specimen door middel van een reeks van oplossingen van stijgende concentraties van ethanol en/of aceton12. In dit protocol, zijn de specimens eerste vlak ingebed tussen flexibele aclar bladen, dan ingebed in een capsule. Het uiteindelijke resultaat is weefsel gelegen op het puntje van een cilindrische hars blok, die de ideale geometrie te zijn minst beïnvloed door trillingen die zich voordoen tijdens microtome sectie.
De kleuring met zware metalen om endogene weefsel contrast te verbeteren is een ander belangrijk aspect van specimen voorbereiding. Beeldcontrast in TEM is te wijten aan elektronen verstrooiing door de atomen in het weefsel. Echter, biologische materialen bestaan grotendeels uit een laag atoomgewicht moleculen (dwz koolstof, waterstof, zuurstof en stikstof). Daarom vereist de generatie van voldoende verstrooiend contrast de opneming van hoge atoomgewicht atomen in de cellulaire componenten van het weefsel. Dit wordt bereikt door het bevlekken van het specimen met zware metalen12,18,19. Osmium tetroxide, uranium en lood, die sterk aan lipiden binden, zijn de gemeenschappelijkste zware metalen die als elektronen vlekken worden gebruikt.
Osmium (atoomnummer 76) is een van de dichtste metalen in het bestaan. Het is zowel een fixatief en een vlek, hoewel de primaire rol in TEM is als een betrouwbare fixatief12. Onder verschillende fixatie protocollen in gebruik, de methode van dubbele fixatie met glutaraldehyde gevolgd door osmium is het meest effectief in het verminderen van de extractie van cel bestanddelen tijdens het monster voorbereiding. Deze twee Fixatieven worden gebruikt om het maximum aantal verschillende types van molecules, vooral proteïnen en lipiden te stabiliseren, en resulteren in het superieure behoud van weefsel fijnstructuur12,14,15, 16 , 17.
Uranium (atoomnummer 92) is het zwaarste metaal dat gebruikt wordt als elektron vlek, meestal in de vorm van uranyl acetaat. Evenzo om osmium, het fungeert als een vlek en fixatief, hoewel de primaire rol in tem is als een vlek20,21. De nucleïnezuur-bevattende en membranous structuren zijn sterk en bij voorkeur bevlekt met uranyl zouten in aldehyde-vaste weefsels22,23. Behandeling van weefsels met uranyl acetaat na osmication en voor uitdroging resulteert in stabilisatie van membranous en nucleïnezuur-bevattende structuren, evenals een verhoogd contrast, en vergunningen identificatie van een aantal structurele details die niet zou gemakkelijk worden gedetecteerd in specimens gekleurd met osmium alleen12,24,25. Men denkt dat uranyl acetaat de fijne structuur kan stabiliseren door met verminderde osmium te combineren die op lipide membranen tijdens osmication24is gedeponeerd. Maximaal contrast wordt bereikt wanneer uranyl acetaat wordt toegepast voordat inbedding en als een post-vlek in dunne secties12.
Lood (atoomnummer 82) is de meest voorkomende vlek gebruikt voor TEM en is voornamelijk werkzaam voor post-kleuring van dunne secties. Loodzouten hebben een hoge elektronen opaciteit en tonen affiniteit voor een breed scala van cellulaire structuren, met inbegrip van membranen, nucleaire en cytoplasma eiwitten, nucleïnezuren en glycogeen26,27. Wanneer de dubbele kleuring methode wordt gebruikt (dat wil zeggen, kleuring met uranyl acetaat wordt gevolgd door een behandeling met lood), de laatste fungeert als een ontwikkelaar van uranyl acetaat kleuring. Bijvoorbeeld, lood post-kleuring van Chromatin vast met glutaraldehyde verhoogt uranyl acetaat opname met een factor van drie28,29,30,31,32. Lood verbetert ook de kleuring bijbrengen door andere metalen, zoals osmium. Men denkt dat loodzouten vlek de membranen van osmium weefsels door aan de polaire groep fosfatiden in aanwezigheid van verminderde osmium33te bevestigen. Een potentieel nadeel van kleuring met zowel uranyl acetaat en lood, vooral voor langdurige duur, is dat veel verschillende structurele elementen zijn gelijkmatig gekleurd en niet-specifiek, en kan dus niet gemakkelijk worden onderscheiden van elkaar12 .
De recente introductie van alternatieve lichtbronnen, zoals in optische super-resolution Photo-activated localization microscopie, heeft een significant verbeterde Lichtmicroscopie resolutie34. Omdat de Lichtmicroscopie echter gebaseerd is op Histochemical en immuun-cytochemische methoden om individueel gelabelde eiwitten of enzymen te visualiseren, blijft de kracht van TEM om alle structurele elementen in één keer weer te geven ongeëvenaard voor een grondige studie van de morfologie en dimensionale relaties van weefsel structuren. In het bijzonder, kan geen andere techniek de morfologische Details verstrekken noodzakelijk om Morphometric analyse van synaptische blaasje distributie bij pre-synaptische zenuw boutons uit te voeren. Niettemin, is het belangrijk om op te merken dat de elektronen micro grafieken de structuur van het weefsel na het organisme overlijdt vangen, en daarom kunnen zij informatie betreffende de dynamica van pre-synaptische blaasje handel en exocytose niet verstrekken. Vandaar, zouden andere hulpmiddelen, zoals de kleurstof van de FM-levende weergave en flard-klem elektrofysiologisch, moeten worden overwogen wanneer het belangrijkste doel is om dynamische en/of functionele aspecten van synaptische blaasje handel en exocytose te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle studies werden goedgekeurd door de Institutional Animal zorg en het gebruik Comite aan de Universiteit van Virginia (Charlottesville, VA) en uitgevoerd in overeenstemming met de nationale instituten van gezondheidsrichtlijnen.
1. fixatie door vasculaire doorbloeding
Opmerking: Een algemene beschrijving van de methode voor rat Brain vasculaire transfusie is al gedetailleerd in dit blad13 en valt buiten het bestek van dit protocol. Echter, de volgende stappen zijn specifiek voor de bereiding van pasgeboren rat hersenweefsel te verkrijgen van hoge kwaliteit elektronen micrografen voor kwantitatieve analyse van synaptische blaasjes distributie bij pre-synaptic terminals.
-
Bereid 4% Paraformaldehyde
- Plaats 800 mL van 0,1 M fosfaat buffer (PB) in een glazen bekerglas van 2 L op een roer plaat onder een rook kap. Hitte aan ongeveer 60 °C zonder de buffer te koken.
- Voeg 40 g van Paraformaldehyde poeder. Continu roeren
- Terwijl het meten van pH, Voeg kleine dalingen van 10 N NaOH toe tot de oplossing ontruimt. De uiteindelijke pH moet 7,2-7.4 zijn.
- Voeg de resterende 0,1 M PB toe aan een eindvolume van 1 L. Laat afkoelen, filter met een 0,45 μm membraan en op te slaan bij 4 ° c 's nachts.
Opmerking: Bereid verse Paraformaldehyde op de dag vóór de infusie.
Let op: Inhalatie van aldehyde dampen kan leiden tot nasale symptomen en luchtweg irritatie. Contact met de huid veroorzaakt dermatitis. Aldehyden moeten worden behandeld in een rook-kap tijdens het dragen van handschoenen, een beschermende jurk en een veiligheidsbril
-
Bereid Tyrode oplossing
- Plaats 1 L gedestilleerd water in een glazen beker op een roer plaat. Voeg NaCl (8 g), KCl (0,15 g), CaCl2 (0,1 g), MgCl2 (0,006 g), nah2po4 (0,055 g), NaHCO3 (1 g) en dextrose (1 g) in het bekerglas toe.
- Roer continu en meet de pH. Houd pH tussen 7,2 en 7,4.
Opmerking: Tyrode oplossing is ook commercieel beschikbaar.
- Meng 4% Paraformaldehyde met glutaraldehyde bij een eindconcentratie van 2%. Voeg 40 mL elektronenmicroscopie-grade 50% glutaraldehyde toe aan 1 L van 4% Paraformaldehyde. Meng goed in een roer plaat
Opmerking: Ongeveer 100 mL van de Paraformaldehyde-glutaraldehyde fixatieve oplossing is nodig om het lichaam van een pasgeboren rat te perfuse. Daarom kunnen ten minste 10 pasgeboren ratten worden doorbloede met 1 liter fixatief. Meng Paraformaldehyde en glutaraldehyde niet tot onmiddellijk voor gebruik. Breng alle oplossingen naar kamertemperatuur voor de doorbloeding. - Zodra de toegang tot de linker ventrikel is opgedaan (Zie hele dierlijke doorbloeding protocol13), spoel het vasculaire systeem met Tyrode oplossing voor 30 s bij een bloeddruk van 120 mmHg.
Opmerking: Het succes van de doorbloeding hangt deels af van de volledige uitsluiting van het vaat bed. - Spoel met Paraformaldehyde-glutaraldehyde oplossing met dezelfde druk voor 10 min.
Opmerking: Onderhoud van constante bloeddruk is essentieel om de invoering van artefacten te voorkomen. Bovendien moet de temperatuur van de perfusaat niet lager zijn dan de lichaamstemperatuur van de rat om te voorkomen dat vasoconstrictie - Verwijder de vaste hersenen van de schedel en plaats in verse Paraformaldehyde-glutaraldehyde fixatief bij 4 °C 's nachts.
Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken.
2. Brain snijden
- Embed de vaste hersenen in 4% agarose en lijm de hersenen-agarose blok op een vibratome stadium
Opmerking: Andere laboratoria hebben verkregen van goede kwaliteit secties door het bereiken van een stabiel blok op de vibratome zonder agar-ondersteuning - Sectie segmenten van 50 μm dikte. Stel de microtome op lage frequentie en snelheid.
Opmerking: De secties kunnen in 0,1 M PB met 0,05% natrium azide bij 4 °C voor verscheidene jaren worden opgeslagen. - Plaats de secties in 0,1 M PB in een Petri schaaltje, onderzoekt de secties onder een dissectie Microscoop en selecteer specimens voor inbedding
Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken.
3. spoelen
Opmerking: Het is belangrijk om het specimen na bevestiging met aldehyden en vóór post-bevestiging met osmium te spoelen, aangezien de residuele Fixatieven osmium precipitaten kunnen veroorzaken
- Pipetteer 0,1 M PB in een korte, breed-mond glazen flacon met dop. Plaats één specimen per flacon. Volledig te dekken het specimen, zodat het niet droog.
Opmerking: Houd specimens in dezelfde flacon van deze stap door alle oplossingen veranderingen van fixatie, uitdroging en infiltratie, totdat ze klaar zijn voor platte inbedding. - Spoel het specimen af in 0,1 M PB voor 3 min x 2, verwijder dan PB met een micropipet.
Opmerking: Aangezien de hersenen van de pasgeboren rat is diep gevoelig voor veranderingen in osmolariteit12,35,36,37, het uitvoeren van de wasbeurten in hetzelfde voertuig als die welke worden gebruikt in het fixatief mengsel
4. post-fixatie met osmium
-
Voorbereiding van osmium tetroxide (4)
Opmerking: Het lab van deze auteur maakt gebruik van4 4% in een waterige oplossing in glas ampullen (5 ml4 4% in H2O). Andere Labs hebben gebruikt4 kristallen met succes. Er zijn echter enkele uren nodig om de4 kristallen in een voertuig op te lossen.- Neem 5 mL (één ampul) van 4% 4%/H2O, open het en plaats het in een bruine glazen fles
Opmerking: De4 is een sterk oxiderend middel en is gemakkelijk te verminderen door blootstelling aan licht. Reductie kan worden vermeden tijdens de voorbereiding door het plaatsen van4 in een bruine glazen fles - Voeg 5 mL van 0,2 M PB toe. Dit levert 10 mL 2%4/0,1 M PB op.
Opmerking: Aangezien de hersenen van de pasgeboren rat is diep gevoelig voor veranderingen in osmolariteit, gebruik maken van dezelfde buffer voor te bereiden aldehyde Fixatieven en de4 -oplossing,35,36,37 - Voeg extra 10 mL van 0,1 M PB toe. Dit levert een definitieve oplossing op van 20 mL 1%4 in 0,1 m PB.
- Gebruik een spuit van 20 mL uitgerust met een lange naald om 1%4 te trekken en plaats deze in een bruine glazen fles of een scint flacon bedekt met aluminiumfolie.
Let op: De4 is zeer vluchtig en de dampen zijn giftig voor neus, ogen en keel. Alle werkzaamheden moeten worden uitgevoerd in een rook-kap met behulp van handschoenen en beschermende kleding, en geen lichaamsdeel moet worden blootgesteld aan de4. Behandeling en afvalverwerking moet worden gedaan volgens de richtlijnen van uw instelling. Bewaar de ongebruikte4 in een strak afgesloten bruin glazen fles met Teflon liner op de glazen stop, wikkel de fles in dubbele aluminiumfolie en op te slaan in een dessicator. In de aanwezigheid van lekkende dampen, kan4 verkleuren interne oppervlakken en de inhoud van de koelkast. Onder de hierboven vermelde opslagomstandigheden is de oplossing van de4-3 maanden stabiel. Wanneer oplossingen worden geoxideerd tijdens de opslag, ze grijs, in welk geval ze moeten worden verwijderd.
- Neem 5 mL (één ampul) van 4% 4%/H2O, open het en plaats het in een bruine glazen fles
- Voeg 1% van de4 in 0,1 M PB in het monster flacon toe en laat het 1 h. extract van de4 na 1 h met een micropipet.
Opmerking: Voor het aanbrengen van4 op de sectie, is het van cruciaal belang te ontvouwen en plat het specimen. Vermijd de toepassing direct op de top van het specimen, in plaats daarvan gebruik maken van de flacon muren om zachtjes druppelen4 tot de onderkant van de flacon. Het specimen wordt bruin en stijf kort na de toepassing van de4 . Handvat voorzichtig van nu af aan weefselbeschadiging te voorkomen
5. spoelen
Opmerking: Het is belangrijk om het monster te spoelen na de post-fixatie met de4 en voor uitdroging, omdat residuele Fixatieven kan reageren met uitdroging agenten37.
- Spoel met 0,1 M PB voor 3 min x 3.
Opmerking: Aangezien de hersenen van de pasgeboren rat is diep gevoelig voor veranderingen in osmolariteit, het uitvoeren van de wasbeurten in hetzelfde voertuig als die welke worden gebruikt in het fixatief mengsel12,35,36,37. - Plaats de osmium oplossing en de eerste twee PB spoelen in4 afval en vervreemden het volgens de richtlijnen van uw instelling.
6. sequentiële uitdroging en kleuring met uranyl acetaat
Opmerking: Deze auteur laboratorium maakt gebruik van water-onmengbare epoxyharsen voor inbedding. Wanneer epoxyharsen worden gebruikt, moet het vrije water van alle specimen worden vervangen door een organisch oplosmiddel vóór infiltratie door het inbedmiddel. Water wordt verwijderd door het passeren van het specimen door middel van een reeks van oplossingen van stijgende concentraties van ethanol en aceton12.
-
Voorbereiding van uranyl acetaat (UA)
- Plaats een 200 mL volumetrische glazen kolf met 100 mL EtOH 70% op een roer plaat.
- Voeg 4 g UA toe aan de kolf. Wikkel in aluminiumfolie (UA precipitaten bij blootstelling aan licht) en roer continu.
Opmerking: UA lost langzaam en onvolledig op in 70% EtOH. Laat onopgeloste kristallen te vestigen voordat u de oplossing. UA-oplossing moet worden gefilterd met een filter van 0,45 μm voor gebruik. UA kan van tevoren worden voorbereid en bewaard in een bruine fles verpakt in aluminiumfolie bij 4 ° c voor maanden.
Let op: UA is licht radioactief en zeer giftig. De inhalatie van UA poeder kan leiden tot aandoeningen van de bovenste luchtwegen en de ziekte van de longen, lever en nieren. UA is gevaarlijk wanneer het wordt ingenomen of wanneer het komt in direct contact met de huid en de slijmvliezen. Al het werk moet worden uitgevoerd in een rook-kap met behulp van handschoenen en beschermende kleding. Behandeling en afvalverwerking moet worden gedaan volgens de richtlijnen van uw instelling.
- Uitdrogen in 50% EtOH voor 1 min. Verwijder 50% EtOH voordat u UA toevoegt.
-
Voeg 4% UA in 70% EtOH. Laat zitten voor 1 uur of 's nachts. Als overnachting, plaats in de koelkast op 4 °C.
Opmerking: dop flacon om EtOH verdamping te voorkomen en te dekken met aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen. Het protocol kan hier worden onderbroken.- Verwijdering van UA-afval en de twee volgende spoelen volgens de richtlijnen van uw instelling
- Uitdrogen in 70% EtOH voor 1 min.
- Uitdrogen in 90% EtOH voor 5 min.
- Uitdrogen in 100% EtOH voor 5 min x 2.
- Spoel het specimen in aceton voor 2 min x 3.
7. infiltratie en inbedding
Opmerking: Weefsels zijn niet voldoende stijf te worden gesneden in dunne secties zonder de extra steun van een hars matrix. Daarom moet infiltratie en inbedding voorafgaan aan de sectie12.
-
Bereiding van EPON hars
- Gebruik een 60 mL sonde spuit. Verwijder de spuit plunjer en de dop van de spuit met een veiligheids naald.
- Plaats de spuit met de open zijde omhoog en voeg het volume van elk ingrediënt van de hars mix stapsgewijs. Voeg 22 mL embed-812 (hars) toe. Voeg NIKITO (verharder) toe aan een totaal volume van 37 mL. Voeg NMA (verharder) toe aan een totaal volume van 50,5 mL. Voeg 525 l van DMP-30 (Accelerator) toe met een pipet. Verplaats de plunjer van de pipet zeer langzaam als DMP is zeer kleverig.
Opmerking: het is belangrijk om de inbedding reagentia toe te voegen in de aangegeven volgorde. Het gaspedaal (DMP-30) moet het laatst worden toegevoegd. Voor het verkrijgen van een genezen blok dat de gewenste kenmerken heeft, is het van cruciaal belang om het exacte bedrag van de verharder en het gaspedaal te gebruiken. Vers bereide inbedding mengsels hebben de voorkeur. - Zet de plunjer terug en plaats de spuit op een tuimelschakelaar met continu schudden voor ten minste 30 min. kleur zal veranderen van geel naar oranje.
Opmerking: Alle ingrediënten moeten zeer grondig worden gemengd. Als dit niet het geval is, resulteert dit in een ongelijke bevruchting van het weefsel specimen en een blok van oneffen hardheid
- Meng 1 deel van EPON hars met 1 volume aceton in een scint flacon en schud om te mengen. Breng de 1:1 EPON: aceton mengsel op het weefsel na het verwijderen van de laatste aceton spoeling. Blijven vallen om aceton verdamping te voorkomen. Verwijder de 1:1 mengsel van hars en aceton na 2-4 h of houden 's nachts.
Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken. - Vervang het mengsel van hars en aceton met volledige hars. Laat zitten voor 4 uur of 's nachts. Zet alle EPON afval in een collectie container onder de motorkap te worden polymeer en verwijderd van later.
Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken.
8. platte inbedding
Opmerking: De specimens zijn vlak-ingebed tussen twee aclar films in een sandwich-als manier.
- Snijd twee rechthoekige stukken van duidelijke aclar blad. Veeg de films schoon met EtOH 70%. Trim de vellen, zodat er ten minste 1,5 cm van weefsel-vrij plastic aan elke kant van de sectie. De aclar blad op de top moet dezelfde breedte als de bodem, en de hoogte moet ongeveer twee derde van de bodemplaat.
- Langzaam kantelen van de flacon met het specimen en voorzichtig til het weefsel van de bodem van de flacon.
- Gebruik een micro flexibele spatel en een fijne borstel om voorzichtig te verplaatsen van de sectie langs de flacon muren en de overdracht op de aclar vel.
Opmerking: Behandel secties met voorzichtigheid om specimen schade te vermijden. - Plaats het aclar vel op de bovenzijde van het specimen.
Opmerking: Zorg ervoor dat er genoeg hars tussen de twee platen aan de sandwich afdichting - Duw voorzichtig alle gevangen luchtbellen zonder directe druk op de sectie. Veeg de overtollige EPON.
Opmerking: De eliminatie van luchtbellen is belangrijk, omdat hun aanwezigheid maakt visualisatie van het specimen moeilijk en verzwakt de stabiliteit van de hars obligaties. - Label de vellen met een solvent resistente pen en plaats in de oven op 60 ͦC voor 2-3 dagen om polymeriseren.
Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken.
9. capsule inbedding
Opmerking: Ultramicrotomes worden geleverd met klemmen om cilindrische blokken te houden die van het inbedden van exemplaren in capsules worden verkregen. Cilindrische blokken hebben de ideale geometrie om het minst te worden beïnvloed door trillingen die zich voordoen tijdens het segmenteren.
- Open voorzichtig de sandwiched aclar films. Het specimen zal zich houden aan een van de twee aclar vellen.
- Gebruik een solventbestendige pen om de zijkant van het aclar blad met de sectie te markeren. Mark in de buurt van het weefsel.
Opmerking: Het is van cruciaal belang om deze stap uit te voeren voordat ponsen uit het weefsel van belang. - Gebruik een disc punch om een cirkel monster van de sectie te verkrijgen. De pen merk moet deel uitmaken van de geperforeerde weefsel.
- Bereid de dop van een inbedding capsule kant op een capsulehouder. Plaats een druppel hars op de dop.
- Plaats de geperforeerde schijf in de dop met het weefsel gedeelte naar boven. Het pen teken zal glanzen wanneer het licht op het specimen wordt geschenen.
- Plaats een capsule in de dop en gebruik fijne pincet te voegen etikettering. Rol en lager een gedrukt 2 cm lang stuk papier in de capsule. Maak het etiket te passen aan de kromming van de zijwanden van de capsule. Wacht tot de polymerisatie volledig is, zodat het etiket permanent in de hars wordt ingebed.
- Giet de inbedding hars in de capsule en vul tot aan de rand van de capsule.
- Duw het weefsel specimen neer aan de bodem van de capsule met behulp van een gerichte houten stok en plaats in de oven bij 60 °C voor 2-3 dagen.
Opmerking: Zorg ervoor dat het weefsel niet te hard druk, in plaats daarvan laat het losjes liggen, zodat een dun laagje van de inbedding medium aanwezig is tussen het weefsel en de capsule oppervlak. Het protocol kan hier worden onderbroken.
10. trimmen van het gezicht van het blok
Opmerking: Kleine afmetingen en de juiste vorm van het blok gezicht zijn voorwaarden voor bevredigende segmentering. Daarom, trimmen van het specimen blok is een noodzaak.
- Gebruik een scherpe één-rand scheermesje. Reinig onmiddellijk voor gebruik met aceton.
- Monteer de capsule blok in een blok houder en plaats de blok houder op het podium van een stereomicroscoop.
Opmerking: Het trimmen procedure moet worden uitgevoerd onder Microscoop verrekijker en schuine verlichting. - Verwijder het aclar vel van de punt van de capsule met behulp van een scheermesje. De aclar blad verschijnt als een glanzende laag onder het licht van de ontleden Scope.
- Houd het scheermesje op een hoek van 45 graden en maak bezuinigingen van vier zijden van de capsule te blokkeren.
Opmerking: Betere controle van de trimmen wordt bereikt als het mes wordt gehouden met beide handen. - Maak korte bezuinigingen, zodat het blok de vorm van een korte piramide met wand hoeken van ongeveer 45 ° neemt.
Opmerking: Het specimen gezicht wordt gesteund veel beter als de kanten die tot het leiden kort worden gehouden. Als de blok tip is te dun en lang, zal het trillen tijdens dunne doorsnede. Idealiter moet het gebied van belang worden gecentreerd in het blok gezicht. - Trim het uiteinde van de capsule om overtollig weefsel te ontdoen en alleen het gebied van belang te behouden.
Opmerking: Geen enkel deel van de sectie zou zonder weefsel moeten zijn, aangezien de variaties in de dichtheid van het blok gezicht een belangrijke oorzaak van moeilijkheid in het delen zijn. Idealiter moet de oppervlakte van de capsule gezicht niet meer dan 1 mm2. - Trim de capsule gezicht in de vorm van een scale trapezium. Omdat in een scale trapezium geen kant gelijk is, deze vorm is het beste om het gebied van belang te oriënteren ten opzichte van de rest van het specimen.
Opmerking: Tijdens het segmenteren wordt het trapeziumvormige gezicht veel beter ondersteund dan dat van een andere vorm.
11. microtome afdeling
Opmerking: De meerderheid van biologische specimens is te dik in hun natuurlijke staat om door een elektronenstraal worden doordrongen. Daarom moet het materiaal in dunne secties worden gesneden die door de elektronenstraal kunnen worden doordrongen.
- Snijd dunne secties (zilver interferentie kleur, 600-900 Å) op een ultramicrotome op vlakken evenwijdig aan de oppervlakte.
- Plaats de secties op rasters. Deze auteur Lab maakt gebruik van koperen roosters van 3,05 mm in de buitenste diameter.
Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken.
12. post-bevlekt met uranyl acetaat
- Bereid 2% UA in gedistilleerd water. Plaats een 200 mL volumetrische glazen kolf met 100 mL gedestilleerd water op een roer plaat. Voeg 2 g UA toe aan de kolf. Wikkel in aluminiumfolie (UA precipitaten bij blootstelling aan licht) en roer continu.
Opmerking: Voor meer informatie over de voorbereiding van UA, zie paragraaf 6 van dit protocol. - Plaats een aantal individuele druppels van 2% UA op een schone lei van tandheelkundige in een Petri schaaltje.
- Float het rooster met het specimen (sectie zijde naar beneden) op een druppel UA voor 25 min.
Opmerking: Float elk raster op een aparte druppel van UA. - Houd het rooster aan de rand met een tang en spoel tweemaal onder een zachte straal van gekookt gedistilleerd water bij kamertemperatuur van een plastic fles wassen.
Opmerking: Sta niet toe dat het rooster te drogen voordat kleuring met lood.
13. post-bevlekt met lood
- Bereid een CO2-vrije kamer (co2 in de lucht is de primaire bron van lood neerslag). Plaats een stuk filtreerpapier geweekt met 1 N NaOH in een Petri schaaltje. Plaats een klein vel van schone tandheelkundige Wax op de top van het filterpapier en plaats verschillende NaOH pellets aan de ene kant van de schotel. Bedek de schotel.
Opmerking: Bereid deze Setup voordat de roosters zijn gekleurd met UA, zodat de sfeer in de kamer is vrij van CO2 en klaar voor lood kleuring tegen de tijd dat UA kleuring is voltooid. - Maak 4% NaOH. Voeg 0,2 g NaOH tot 5 mL gedestilleerd water toe.
- Bereid de Triple lead oplossing van SATO voor. Ter voorbereiding van 10 mL, Voeg 0,1 g van lood nitraat, 0,1 g van lood citraat, 0,1 g van loodacetaat en 0,2 g van natrium citraat in een glazen fles. Voeg 8,2 mL gedestilleerd water en schud krachtig voor 5 min. Bewerk voor 30 s, voeg dan 1,8 mL vers gemaakt 4% NaOH.
- Plaats enkele druppels van SATO voorsprong op de wax in de Petri schaal.
- Plaats het rooster gekleurd met UA (sectie zijde naar beneden) op de daling van lood.
Opmerking: Elk rooster moet worden gedreven op een aparte druppel lood. Elke druppel moet klein genoeg zijn om het net te zweven op de top van de koepel van de druppel in plaats van glijden naar beneden op de zijkanten. - Bedek de schotel en laat vlek voor 5 min.
- Houd het rooster aan de rand met een tang en grondig te wassen onder een zachte straal van gekookt gedistilleerd water bij kamertemperatuur van een plastic fles wassen.
- Dep droog het raster op filtreerpapier en sla het raster op.
Opmerking: Zorg ervoor dat de sectie niet in direct contact komt met het filtreerpapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Algemene criteria die meestal worden aanvaard als indicatie van een bevredigende of gebrekkige bewaring van specimen voor TEM zijn vastgesteld. Deze criteria worden geïllustreerd in vier geselecteerde elektronen micrografen (twee voorbeelden van optimale voorbereiding, twee voorbeelden van gebrekkige voorbereiding) die werden verkregen door het behandelen van jonge rat hersenweefsel volgens de methoden beschreven in dit protocol.
In het algemeen, een goede kwaliteit elektronen Micrograph verschijnt als een ordelijk, duidelijk en algemeen grijs beeld. In een bevredigend voorbereid specimen, moeten de ruimten tussen membranen met korrelig materiaal worden gevuld, en zouden niet moeten leeg zijn. Evenzo zijn er geen lege ruimtes te vinden in de cytoplasma grondstof of in organellen (Vergelijk Figuur 1a en Figuur 2a met Figuur 3 en Figuur 4). Toch is het belangrijk op te merken dat het centrale zenuwstelsel van zeer jonge dieren toont een zekere mate van uitbreiding van de extracellulaire ruimten in vergelijking met de volwassen hersenen, met losser verbindingen tussen cellen en een algehele witter, minder elektron-dichte verschijning. Membranen moeten continu zijn, zonder vervorming of breuk (Figuur 1a en Figuur 2a). De stroma van mitochondria moet verschijnen uniform en dicht, zonder lege ruimtes. Cristae moet intact en niet gezwollen, en de mitochondriale buitenste dubbele membraan moet worden ononderbroken (Vergelijk Figuur 1a met Figuur 3). Om Morphometric analyse van pre-synaptische blaasje organisatie te vergemakkelijken, moeten de pre-en post-synaptische membranen intact zijn en hoofdzakelijk parallel met elkaar (Zie Figuur 1). Synaptische blaasjes moeten traceerbaar en gebonden zijn door een ononderbroken enkel membraan (Zie Figuur 2).
Belangrijk, zelfs wanneer de beste praktijken worden gevolgd, de behandeling van het specimen met Fixatieven, vlekken en harsen introduceert artefacten. Aangezien artefacten niet kunnen worden geëlimineerd, is het van cruciaal belang om te begrijpen welk proces hen ontstaat, zodat het uiterlijk van het specimen kan worden geïnterpreteerd met betrekking tot de behandeling die het onderging12. Een voorbeeld van een artefact-onder verschillende die kunnen worden gegenereerd tijdens het monster voorbereiding voor TEM-is een myeline figuur, een membranous lamellaire opneming die lijkt op myeline scheden. Hoewel myeline cijfers te zien zijn in pathologische voorwaarden12, zijn ze meestal het gevolg van extractie van membraanlipiden tijdens fixatie met aldehyden (Zie Figuur 4).
Figuur 1: elektronen micro grafiek representatief voor een bevredigende bewaring van de cel structuur (voorbeeld 1). (A) neuronale celmembranen zijn gelaagd en zonder pauzes. Het cytoplasma is fijn korrelig en zonder lege ruimtes. Mitochondriën zijn niet gezwollen noch gekrompen. Hun buitenste dubbele membraan is geconserveerd, en interne cristae zijn intact. (B) detail van paneel A, voorbeeldig een methode voor het meten van de afstand van synaptische blaasjes uit de pre-synaptische membraan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: elektronen micro grafiek representatief voor een bevredigende bewaring van de cel structuur (voorbeeld 2). (A) synaptische blaasjes zijn verschillend en gevoerd door een ongebroken enkel membraan. Om Morphometric analyse van synaptische blaasje distributie toe te staan, moeten de pre-synaptische en post-synaptische membranen parallel zijn en hun gehandhaafde continuïteit. (B) detail van paneel A, voorbeeldig het tellen van synaptische blaasjes binnen de pre-synaptische Terminal. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: elektronen micro grafiek vertegenwoordiger van gebrekkige bewaring van weefselstructuur (voorbeeld 1). Let op de vervorming en breuk van neuronale celmembranen en de aanwezigheid van aanzienlijk vergrote extracellulaire ruimten (gemarkeerd met *). Mitochondriën verschijnen opgezwollen en hebben gezwollen cristae (gemarkeerd met pijl). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: elektronen micro grafiek vertegenwoordiger van gebrekkige bewaring van weefselstructuur (voorbeeld 2). Let op de aanwezigheid van grote witte lege ruimten in het cytoplasma (gemerkt met ǂ), in plaats van fijn granulaire cytoplasma substantie. Extracellulaire ruimten verschijnen vergroot. Een artefactuele membranous krans (myeline figuur), waarschijnlijk als gevolg van de mobilisatie van lipiden tijdens de fixatie met glutaraldehyde, is gemarkeerd met de afkorting MF. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De behandeling van weefselsecties tijdens specimen voorbereiding voor TEM vereist een aanzienlijke graad van finesse, concentratie en geduld. Bij het gebruik van een micropipet om oplossingen toe te voegen en te verwijderen, kunnen specimens door oppervlaktespanning in de pipet worden gezogen, zodat er grote zorg moet worden besteed aan het vermijden van weefselbeschadiging door de pipet. Ook bepaalde stappen van de uitdroging sequentie kan zo snel als 1 minuut, vandaar de exploitant moet snel werken om ervoor te zorgen dat de volgende uitdroging stap is gestart op tijd en het specimen niet droog of rimpel. Een procedure die speciale aandacht vereist is post-fixatie met osmium. De secties worden stijf na behandeling met osmium en kunnen gemakkelijk worden beschadigd. Voor het toevoegen van osmium, is het noodzakelijk dat de secties zijn afgevlakt aan de onderkant van de flacon, anders elke plooi zal resulteren in weefsel breuk. De behandeling van osmicated weefsel is bijzonder uitdagend wanneer het overbrengen van secties op aclar films voor het vlakke inbedden. Speciale zorg is nodig bij het optillen van het specimen van de bodem van de flacon om versnippering te voorkomen, en bij het duwen luchtbellen uit de film sandwich. Hoewel het belangrijk is om te duwen elke gevangen lucht, omdat het visualisatie van het specimen moeilijk maakt en verzwakt de stabiliteit van de hars obligaties, directe druk op osmicated weefsel kan gemakkelijk schade toebrengen. Een andere stap die extra zorg vereist is de voorbereiding van de hars mengsel voor specimen infiltratie en inbedding. EPON, de meest gebruikte inbedding hars, kan worden verhard met de toevoeging van een verharder en een versneller. Het is noodzakelijk om het exacte bedrag van verharder en versneller te gebruiken om een genezen blok met de gewenste kenmerken te verkrijgen. Zowel gravimetrische als volumetrische methoden zijn beschreven voor het meten van viskeuze harsen. Hoewel gravimetrische methoden zijn traditioneel beschouwd als nauwkeuriger12, heeft deze auteur laboratorium had goed succes met volumetrische modi (dat wil zeggen, het toevoegen van het volume van elk ingrediënt van de hars mix stapsgewijs door middel van een sonde spuit) . Nadat de hars componenten zorgvuldig zijn gemeten, moeten zij zeer grondig worden gemengd om eenvormige impregneren te bereiken, aangezien zij verschillende viscositeiten en tarieven van polymerisatie bezitten. Het niet volledig mengen zal resulteren in een blok van oneffen hardheid dat niet geschikt is voor dunne doorsnedes.
Gemarkeerde veranderingen in de tonica van de oplossingen die worden gebruikt om secties van jonge rat hersenen proces kan leiden tot krimp en/of zwelling van de extracellulaire ruimte en cellulaire componenten12,35,36,37 . Tijdens de fixatie worden de beste resultaten verkregen wanneer de osmotische druk van de perfusaat zo gelijkaardig mogelijk wordt gehouden aan die van het onderzochte weefsel. Rat Brain osmolaliteit is ongeveer 330 mOsm. Een 2% glutaraldehyde in 0,1 M PB oplossing is slechts lichtjes hypertone (400-450 mOsm) en minimaliseert uitbreiding van extravascular ruimte12. Met name, membranen blijven gevoelig voor veranderingen in de osmotische druk van de spoelen en uitdroging oplossingen na fixatie met aldehyden. Daarom is het ook belangrijk om de verschillen tussen de osmolariteit van de fixatief en de oplossingen te minimaliseren die later worden gebruikt12,35,36,37. Om deze reden, hetzelfde voertuig (0,1 M PB, benaderende osmolariteit 440 mOsM) wordt gebruikt als een oplosmiddel voor alle oplossingen in dit protocol. Nochtans, zou men moeten opmerken dat verscheidene verschillende buffers met succes tijdens specimen voorbereiding voor TEM zijn gebruikt en geen enkele buffer universele superioriteit over anderen kan eisen. Wanneer buffers van lagere tonica de voorkeur hebben, hebben andere laboratoria ervoor gekozen om de osmolariteit met elektrolyten of niet-elektrolyten12te verhogen.
Verscheidene stappen in dit protocol vereisen het gebruik van chemische producten die giftig kunnen zijn wanneer niet behoorlijk behandeld. Het belang van het werken onder een rook kap en het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren van aldehyden, osmium, uranium en loodverbindingen kan niet worden overschat. Terwijl geautomatiseerde contrasterende systemen kunnen helpen verzachten een deel van het risico en zijn commercieel beschikbaar, kunnen ze vrij duur en kan niet betaalbaar zijn door laboratoria die niet routinematig gebruik maken van TEM. Hoewel het elektronenmicroscoop laboratorium potentieel een gevaarlijke plaats kan zijn, is de specimen verwerking voor TEM globaal veilig wanneer uitgevoerd strikt.
Onlangs heeft de invoering van super-resolutie Lichtmicroscopie toegenomen optische imaging oplossend vermogen tot ongeveer 15 nm34. Echter, wanneer het doel is het uitvoeren van Morphometric analyse van de synaptische blaasje ruimtelijke organisatie bij pre-synaptic terminals, geen techniek biedt dezelfde mate van morfologische detail. Belangrijk is, TEM wordt beperkt door de noodzaak voor het monster om dood te zijn voordat het kan worden verwerkt en gevisualiseerd. Daarom, wanneer de studiedoel is om te onderzoeken dynamische of functionele aspecten van de synaptische blaasje handel en exocytose, andere instrumenten dan TEM moet worden overwogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit manuscript werd gesteund door NIH/NIGMS K08 123321 (aan N.L.) en door fondsen van het ministerie van Anesthesiologie bij de Universiteit van Virginia. De auteurs willen bedanken alev Erisir (afdeling biologie, Universiteit van Virginia, Charlottesville, VA) voor een uitstekende opleiding en technische bijstand met TEM, en voor haar waardevolle manuscript kritiek. De auteurs danken ook de geavanceerde elektronenmicroscopie faciliteit bij de Universiteit van Virginia voor technische hulp met specimen en post-bevlekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19170 | acqueous |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, acqueous |
| Aclar 33 C embedding film | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | 7.8 mil thickness, size 8"x10" |
| BEEM capsule holder | Electron Microscopy Sciences | 69916 | holds size "00" capsules |
| BEEM embedding capsules | Electron Microscopy Sciences | 70021 | "size 00, flat (cut bottom)" |
| Butler block trimmer | Electron Microscopy Sciences | 69945-01 | |
| Camel hair paint brush | Electron Microscopy Sciences | 65576-01 | |
| Disc punch | Electron Microscopy Sciences | 77850-09 | |
| Embed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Lead acetate | Electron Microscopy Sciences | 17600 | |
| Lead citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
| Lead nitrate | Electron microscopy Sciences | 17900 | |
| Leica UC7 ultracut microtome | Leica | ||
| Micro scale | Electron Microscopy Sciences | 62091-23 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | EM grade, granular |
| Precision Thelco laboratory oven | Thelco | 51221159 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark pen | Electron Microscopy Sciences | 72109-01 | |
| Tyrode solution | Electron Microscopy Sciences | 11760-05 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | powder |
References
- Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum. Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).
- Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. General anesthesia causes long-lasting disturbances in the ultrastructural properties of developing synapses in young rats. Neurotoxicity Research. 17 (2), 179-188 (2010).
- Sanchez, V., et al. General anesthesia causes long-term impairment of mitochondrial morphogenesis and synaptic transmission in developing rat brain. Anesthesiology. 115 (5), 992-1002 (2011).
- Boscolo, A., et al. The abolishment of anesthesia-induced cognitive impairment by timely protection of mitochondria in the developing rat brain: the importance of free oxygen radicals and mitochondria integrity. Neurobiology of Disease. 45 (3), 1031-1041 (2012).
- Aghajanian, G. K., Bloom, F. E. The formation of synaptic junctions in developing rat brain: a quantitative electron microscopy study. Brain Research. 6 (4), 716-727 (1967).
- Akert, K., Sandri, C. Significance of the Maillet method for cytochemical studies of synapses. Golgi centennial symposium; Perspectives in Neurobiology. Santini, M. , Raven Press. NY. 387-399 (1975).
- Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. Cytochemistry of synapses: selective staining for electron microscopy. Science. 154 (3756), 1575-1577 (1966).
- Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. Fine structural and cytochemical analysis of the staining of synaptic junctions with phosphotungstic acid. Journal of Ultrastructure Research. 22 (5-6), 361-375 (1968).
- Burry, R. W., Lasher, R. S. A quantitative electron microscopy study of synapse formation in dispersed cell cultures of rat cerebellum stained either by O-UL or by E-PTA. Brain Research. 147 (1), 1-15 (1978).
- Pellegrino de Iraldi, A., Suburo, A. M. Electron staining of synaptic vesicles using the Champy-Maillet technique. Journal of Microscopy. 91 (2), 99-103 (1970).
- Pfenninger, K. H. The cytochemistry of synaptic densities. I. An analysis of the bismuth iodide impregnation method. Journal of Ultrastructural Research. 34 (1), 103-122 (1971).
- Hayat, M. A. Chemical fixation. Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications. Hayat, M. A. , Cambridge University Press. 4-84 (2000).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visual Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hayat, M. A. Fixation for electron microscopy. Hayat, M. A. , Academic Press. San Diego. (1981).
- Behrman, E. J., et al. The chemistry of osmium tetroxide fixation. The science of biological specimen preparation for microscopy and microanalysis. Revel, J. P., et al. , Scanning Electron microscopy Inc, AMF. O’Hare, Chicago. 1-5 (1983).
- Nielson, A. J., Griffith, W. P. Reactions of osmium tetroxide with protein side chains and unsaturated lipids. Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions. (6), 1084-1088 (1979).
- Nielson, A. J., Griffith, W. P. Tissue fixation by osmium tetroxide. A possible role for proteins. Journal of Hystochemistry & Cytochemistry. 27 (5), 997-999 (1979).
- Hanker, J. S., Deb, C., Wasserkrug, H. L., Seligman, A. M. Staining tissue for light and electron microscopy by bridging metals with multidentate ligands. Science. 152 (3729), 1631-1634 (1966).
- Zobel, C. R., Beer, M. The use of heavy metal salts as electron stains. International Review of Cytology. 18, 363-400 (1965).
- Silva, M. T., Guerra, F. C., Magalhaes, M. M. The fixative action of uranyl acetate in electron microscopy. Experientia. 24 (10), 1074 (1968).
- Terzakis, J. A. Uranyl acetate, a stain and a fixative. Journal of Ultrastructural Research. 22 (1-2), 168-184 (1968).
- Feldman, I., Jones, J., Cross, R. Chelation of uranyl ions by adenine nucleotides. Journal of the American Chemical Society. 89 (1), 49-53 (1967).
- Shah, D. O. Interaction of uranyl ions with phospholipid and cholesterol monolayer. Journal of Colloid and Interface Science. 29 (2), 210-215 (1969).
- Daems, W. T., Persijn, J. P. Section staining with heavy metals of osmium-fixed and formol-fixed mouse liver tissue. Journal. Royal Microscopical Society. 81 (pts 3&4), 199-201 (1963).
- Lombardi, L., Prenna, G., Okolicsanyi, L., Gautier, A. Electron staining with uranyl acetate: possible role of free amino groups. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 19 (3), 161-168 (1971).
- Cattini, P. A., Davies, H. G. Kinetics of lead citrate staining of thin sections for electron microscopy. Stain Technology. 58 (1), 29-40 (1983).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
- Cattini, P. A., Davies, H. G. Observations on the kinetics of uranyl acetate and phosphotungstic acid staining of chromatin in thin sections for electron microscopy. Stain Technology. 59 (5), 291-304 (1984).
- Derksen, J. W., Meekes, H. Selective staining of nucleic acid containing structures by uranyl acetate-lead citrate. Micron and Microscopica Acta. 15 (1), 55-58 (1984).
- Frasca, J. M., Parks, V. R. A routine technique for double-staining ultrathin sections using uranyl and lead salts. Journal of Cell Biology. 25 (1), 157-161 (1965).
- Hanaichi, T., Sato, T., Iwamoto, T., Malavasi-Yamashiro, J., Hoshino, M., Mizuno, N. A stable lead by modification of Sato’s method. Journal of Electron Microscopy. 35 (3), 304-306 (1986).
- Sato, T. A modified method for lead staining of thin sections. Journal of Electron Microscopy. 17 (2), 158-159 (1968).
- Lever, J. D. A method of staining tissues with lead for electron microscopy. Nature. , 810-811 (1960).
- Derek, G., et al. Self organization of the Escherichia Coli chemotaxis network imaged with super-resolution light microscopy. Public Library of Science Biology. 7 (6), e1000137 (2009).
- Richards, J. G. Ultrastructural histochemistry of nervous tissue. Techniques in Neuroanatomical Research. Heyn, C., Forssmann, W. G. , Springer. Berlin. 277-292 (1981).
- Wood, R. L., Luft, J. H. The influence of the buffer system on fixation with osmium tetroxide. Journal of Ultrastructural Research. 12 (1-2), 22-45 (1965).
- Louw, J., Williams, K., Harper, I. S., Walfe-Coote, S. A. Electron dense artifactual deposits in tissue sections: the role of ethanol, uranyl acetate and phosphate buffer. Stain Technology. 65 (5), 243-250 (1990).
