Kontinuierliche Blutentnahme in der Kleintier-Positronen-Emissionstomographie/Computertomographie ermöglicht die Messung der arteriellen Eingabefunktion

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur kontinuierlichen Blutentnahme während der PET/CT-Bildgebung von Ratten zur Messung der arteriellen Eingangsfunktion (AIF) beschrieben. Gezeigt werden die Katheterisierung, die Kalibrierung und Einrichtung des Systems sowie die Datenanalyse der Blutradioaktivität. Die generierten Daten liefern Eingabeparameter für die nachfolgende biokinetische Modellierung.

Zusammenfassung

Für die quantitative Analyse und biokinetische Modellierung von Positronenemissionstomographie/Computertomographie (PET/CT)-Daten ist die Bestimmung der zeitlichen Blutzeitaktivitätskonzentration, auch bekannt als arterielle Inputfunktion (AIF), ein schlüsselfertiger Punkt, insbesondere für die Charakterisierung von Tierseuchenmodellen und die Einführung neu entwickelter Radiotracer. Das Wissen über die Verfügbarkeit von Radiotracer im Blut hilft, PET/CT-abgeleitete Daten der Gewebeaktivität zu interpretieren. Zu diesem Zweck ist eine Online-Blutentnahme während der PET/CT-Bildgebung ratsam, um den AIF zu messen. Im Gegensatz zu manueller Blutentnahme und bildabgeleiteten Ansätzen hat eine kontinuierliche Online-Blutentnahme mehrere Vorteile. Neben dem minimierten Blutverlust gibt es eine verbesserte Auflösung und eine überlegene Genauigkeit für die Blutaktivitätsmessung. Der Hauptnachteil der Online-Blutentnahme ist jedoch die kostspielige und zeitaufwändige Vorbereitung, um die Femoralgefäße des Tieres katheterisieren zu können. Hier beschreiben wir einen einfachen und vollständigen Workflow für Katheterisierung und kontinuierliche Blutentnahme bei der PET/CT-Bildgebung von Kleintieren und vergleichen ihn mit manueller Blutentnahme und einem bildabgeleiteten Ansatz. Anhand dieses hochstandardisierten Workflows wird die Bestimmung des Fluorodesoxyglucose ([¹⁸F]FDG) AIF demonstriert. Darüber hinaus kann dieses Verfahren auf jeden Radiotracer in Kombination mit verschiedenen Tiermodellen angewendet werden, um grundlegende Kenntnisse der Tracer-Kinetik und Modelleigenschaften zu schaffen. Dies ermöglicht eine genauere Beurteilung des Verhaltens von Arzneimitteln, sowohl für diagnostische als auch für therapeutische Ansätze in der präklinischen Forschung von onkologischen, neurodegenerativen und Myokarderkrankungen.

Einleitung

Positronen-Emissionstomographie/Computertomographie (PET/CT) ist eine Kernbildtechnologie, die die Visualisierung von Stoffwechselprozessen im Körper nach Injektion eines radioaktiv markierten Liganden, auch Tracer genannt, ermöglicht. Während der Liganden ein Molekül ist, das an einem Stoffwechselweg beteiligt ist oder auf Zelloberflächenproteine abzielt, ist das radioaktive Etikett ein positronenetierendes Radionuklid. Gammastrahlen werden indirekt durch den Positronenzerfall emittiert und ermöglichen den Nachweis seiner Verteilung im Organismus mit extrakorporalen PET-Detektoren. Auf diese Weise können verschiedene zelluläre Moleküle ins Visier genommen werden: Neurotransmitter-Rezeptoren und -Transporter, Stoffwechselprozesse wie Glykolyse oder mitochondriale Proteine wie das Translocator-Protein 18 kDa (TSPO), um aktivierte Gliazellen zu erkennen.

In der präklinischen Forschung ist PET/CT eine attraktive Methode, um biochemische Prozesse in vivo nicht-invasiv zu untersuchen und so Längsschnittstudien zu ermöglichen. PET/CT-Daten unterstützen die Analyse von Krankheitsmechanismen, die Bewertung der Merkmale und pharmakokinetischen Neuer Arzneimittel und die Validierung von aktuellen und neuartigen Radiotracern für die translationale Forschung.

Bei PET/CT-Analysen können drei Tracerzustände definiert werden (Beispiel des 2-Gewebe-Kompartimentmodells): Zunächst fließt der Tracer nach seiner Anwendung innerhalb des Blutes (Zustand 1; Conc._[Blut]). Zweitens gelangt es über das Kapillarbett in das Gewebe und kann sich dort entweder frei innerhalb des extrazellulären Raumes bewegen oder ist unspezifisch an verschiedene zelluläre oder extrazelluläre Strukturen gebunden (Zustand 2; Conc._[unspec]). Drittens kann der Tracer (mit oder ohne metabolisches Trapping) gezielt an sein Zielmolekül gebunden werden (Zustand 3, conc._[spec]). Alle diese dynamischen Prozesse zwischen den Fächern sind zum Teil bidirektional und die Diffusionsprozesse werden durch Ratenkonstanten (K1, k2, k3 und k4) beschrieben. Während die Konzentration des Tracers im Blut (d.h. Zustand 1) "Input" genannt wird, wird die Konzentration des unspezifisch und spezifisch gebundenen Tracers (d.h. Zustand 2 und Zustand 3) als "Output" bezeichnet und kann direkt aus dem PET-Bild abgeleitet werden. Diese physiologische Beziehung kann im 2-Gewebe-Fachmodell (Abbildung 1) dargestellt werden.

Abbildung 1 : Das Zwei-Gewebe-Teilmodell. Die physiologischen Bedingungen der drei verschiedenen Tracerzustände und die dynamischen Prozesse zwischen ihnen werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Im Idealfall ist Conc._[spec] proportional zur Konzentration seines Zielmoleküls. Der Ausgang der PET/CT-Messung ist jedoch die Summe von conc._[spec] und conc._[unspec]. Um conc._[spec] im Interessengebiet zu bestimmen, wird parallel die Conc._[unspec] eines Referenzbereichs ohne Zielprotein/Signalweg bestimmt. Durch die Verwendung geeigneter mathematischer Gleichungen kann man nun conc._[spec] berechnen, am häufigsten mit dem Kompartimentmodell (ein biokinetischer Modellierungsansatz). In vielen Fällen ist jedoch eine solche Referenzregion ohne Zielprotein nicht verfügbar^1,2. In diesen Fällen kann das Conc._[Blut] verwendet werden, um conc._[spec]zu bestimmen. Da das Conc._[Blut] aufgrund unterschiedlicher Leber- und Nierenclearance, Ausscheidung, Blutfluss, unterschiedlicher Hirn-Blut-Barriere-Penetration und krankheitsbedingter Faktoren^{variiert 3}, ist der aktuelle Goldstandard die Messung des conc._{[ Blut]} parallel zum PET/CT-Scan durch kontinuierliche Blutentnahme. Dadurch ergibt sich die arterielle Eingangsfunktion (AIF), die im Laufe der Zeit als conc._[Blut] definiert ist⁴. Bemerkenswert ist, dass die Durchführung einer kontinuierlichen Blutentnahme als technisch sehr anspruchsvoll angesehen wird, insbesondere bei Kleintieren wie Ratten oder Mäusen⁵.

Hier bieten wir ein einfaches und praktisches Protokoll, um kontinuierlich Blut von Ratten über einen arteriovenösen (a-v) Shunt zwischen der Femoralvene und der Arterie zu proben. Gekoppelt mit einem handelsüblichen Detektor-Pumpensystem sind wir in der Lage, bei dynamischen [¹⁸F]Fluorodeoxyglucose ([¹⁸F]FDG)-PET/CT-Scans bei Ratten einen kontinuierlichen Echtzeit-AIF zu erzeugen und mit alternativen Ansätzen zu vergleichen. Die PET/CT-Bildgebung wurde bei männlichen sprague dawley Ratten im Alter von 4 Monaten mit einem durchschnittlichen Gewicht von 462 g bei 33 g (mittlere Standardabweichung) mit einem multimodalen PET/CT-Scanner durchgeführt.

Da bei der Messreihe eine Vielzahl von Geräten verwendet wird (Dosiskalibrator, Online-Blutprobennehmer, PET/CT und Well-Counter), ist ein Qualitätskontrollverfahren, das als Kreuzkalibrierung bezeichnet wird, erforderlich, um die quantitative Genauigkeit aller Systeme zu überprüfen und Unterschiede zu kompensieren. Die Kreuzkalibrierung im Rahmen der Online-Blutentnahme bedeutet, dass die Zählrate für eine gegebene Aktivitätskonzentration, gemessen in korrigierten PET-Bildern, in die mit dem Twilit-System gemessene Konzentration für die gleiche Konzentration umgewandelt werden kann. Daher wurde ein Kreuzkalibrierungsverfahren zwischen PET/CT, Blutentnahmesystem und Brunnenzähler eingerichtet.

Diese hochstandardisierte Methodik bietet einen leistungsstarken Ansatz zur Quantifizierung metabolischer und zellulärer Prozesse in der präklinischen Kleintierforschung und ist eine elegante Möglichkeit, die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit des AIF zu verbessern. Der AIF kann dann verwendet werden, um den spezifisch gebundenen Tracer im Gewebe in präklinischen PET/CT-Daten mittels biokinetischer Modellierung zu quantifizieren.

Protokoll

Alle Tierbehandlungen und -experimente wurden vom Landestierforschungsausschuss Mecklenburg-Vorpommern genehmigt (LALLF M-V/7221.3-1.1-004/18, Zulassung: 03.04.2018). Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt.

HINWEIS: Die Tiere wurden unter Standardbedingungen (22 x 2 °C, 12 h Tag-Und-Nacht-Zyklus) mit Wasser und Nahrung ad libitum gehalten. Alle benötigten Geräte für die Vorbereitung des Shunt-Systems, das Betriebsverfahren und die tatsächlichen Messungen sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt.

1. Vorbereitung und chirurgischer Eingriff zur Katheterisierung des Tieres

1. Fasten Sie das Tier für mindestens 12 h mit freiem Zugang zu Wasser. Zur Anästhesie die Ratte in eine Induktionskammer geben und kontinuierlich mit Sauerstoff/Isofluran-Mischung füllen. Für die Initiierung verwenden 2,5-3,5% Isofluran und für die Wartung 1,5-3,0% (Durchflussrate von 1,2-1,5 L/min).
   HINWEIS: Fasten ist notwendig für Studien mit dem Tracer [¹⁸F]FDG, aber nicht für andere Tracer. Die Messung des Glukoseblutspiegels mit manuellen Blutentnahmen, die in Abschnitt 4 beschrieben sind, wird empfohlen, um stabile Werte zu gewährleisten oder bei der kinetischen Modellierung zu korrigieren.
2. Legen Sie die anästhesierte Ratte in dorsaler Position auf eine Heizmatte, unter dem chirurgischen Mikroskop und fügen Sie die Vetsalbe auf ihren Augen hinzu. Überwachen und halten Sie die Körpertemperatur der Ratte während des Experiments kontinuierlich (37 x 0,5 °C) mit einer rektalen Sonde.
3. Verkleben Sie die Beine der Ratte an der Arbeitsfläche, um die Beine in Position zu halten. Desinfizieren Sie die Einsatzstelle mit einem Schleimhautdesinfektionsmittel und rasieren Sie das Bein und den Schritt (Operationsseite) der Ratte. Mit einer endilösen Reinigung mit dem Desinfektionsmittel beenden.
4. Machen Sie einen Schnitt von etwa 20 mm mit chirurgischen Zangen und Schere an der Leistengegend der Ratte. Sezieren Sie die feinen Hautschichten und setzen Sie die Oberschenkelvene, Arterie und Nerven mit der Mikrozange aus. Legen Sie zwei feine Filamente unter jede Oberschenkelvene und Arterie.
5. Vene und Arterie mit jedem distalen Filament versiegeln und mit einer Bulldoggeklemme unter Spannung halten.
   Verwenden Sie die proximalen Nahtfilamente, um das Gefäß mit den Bulldoggenklemmen (ohne Knoten) zu spannen.
6. Blockieren Sie die Vene mit einer Aneurysmenklemme proximal, aber 2-3 mm distal aus der Naht mit der Bulldogge Klemme. Verwenden Sie Hornhautscheren, um einen kleinen Schnitt in die Vene (1/3 des Durchmessers) zu machen und austretendes Blut mit einem sterilen Baumwolltausch zu entfernen. Die Vene mit einer dumpfen Zange dedukulieren und offen halten. Setzen Sie den geschärften Katheter (Innendurchmesser [ID]: 0,58 mm, Außendurchmesser [OD]: 0,96 mm) in die Vene ein und schieben Sie ihn in proximale Richtung bis zum Aneurysmusclip.
7. Öffnen Sie den Aneurysmclip und schieben Sie den Katheter weiter in proximale Richtung (ca. 2-3 cm), wenn der Katheter richtig platziert ist, fließt Blut in den Katheter. Sichern Sie den Katheter mit der proximalen Naht, indem Sie zwei Knoten machen; Legen Sie bei Bedarf eine zusätzliche Naht um die Vene und den Katheter. Überprüfen Sie die Funktionalität des Katheters durch Spülen und Ansaugen mit einer Insulinspritze (30 G Nadel), gefüllt mit 100 l heparinisierter Salinelösung (50 Einheiten/ml).
8. Legen Sie den Katheter in die Arterie, indem Sie die Schritte 1.6 und 1.7 wiederholen.
9. Wenn beide Katheter richtig platziert sind, schließen Sie das Bein mit Nähten und tragen Sie das Tier zum PET/CT.
   HINWEIS: Seien Sie beim Transport des Tieres so vorsichtig wie möglich mit den Kathetern, da sonst eine Verschiebung des Katheters auftreten kann.

2. Einrichtung des Shunt-Systems

Abbildung 2 : Schema der Messeinrichtung. (A) Schematische Zeichnung der Messeinstellungen. (B) Foto des angeschlossenen Shunt-Systems mit dem Twilit-Detektor, peristaltischer Pumpe und verschiedenen Steckertypen. Der Zeitverlauf der Radioaktivität im Blut einer Ratte wird erkannt, während das Tier (1) im PET/CT (2) gescannt wird. Daher wird der arterielle (a) und venöse (b) Katheter über Adapterteile (Stecker orange, Steckerblau und Steckergrün) mit dem Detektorpumpensystem verbunden. Das arterielle Blut wird dann vom arteriellen Katheter durch den Detektor (3) zu einer peristaltischen Pumpe (4) und über den Venenkatheter zurück in den Körper gepumpt. Ein 3-Wege-Ventil (7) ist in das Rohrsystem integriert, um Tracer-Injektion, manuelle sedern und Spülen durchzuführen. Ein T-Stück (8) wird zusammengesetzt, um Aktivität zu injizieren. Der Detektor ist mit einem Computer verbunden, um die kontinuierlichen Blutdaten anzuzeigen, zu kalibrieren und zu korrigieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. 6 Teile der Feinbohrung Polythenrohre (FBPT) (ID: 0,58 mm, OD: 0,96 mm) mit einer Länge von c = 735 mm abschneiden; e = 100 mm; f = 171 mm, g = 875 mm; h = 90 mm und i = 75 mm (Abbildung 2). 8 Teile der Silikonpumpenrohre (schwarz/schwarz/schwarz, ID: 0,76 mm, OD: 2,48 mm) mit einer Länge von ca. 20 mm abschneiden.
2. Stellen Sie Dieskondensidierverbinder (von ID 2,5 mm bis ID 1,5 mm) an beiden Enden des Silikonpumpenrohrs d (gelb/blau/gelb, ID: 1,52 mm, OD: 3,20 mm) auf. Legen Sie einen präparierten 20 mm Teil der Silikonrohre (schwarz/schwarz/schwarz) am anderen Ende der verwendeten Reduktionsverbinder an (siehe Stecker blau in Abbildung 2).
3. Legen Sie das vorbereitete Teil c des FBPT in den montierten Steckverbinder blau auf das eine Ende des Silikonpumpenrohrs d (gelb/blau/gelb) und das vorbereitete Teil e des FBPT in den montierten anderen Ende. Legen Sie einen präparierten 20 mm Teil der Silikonrohre (schwarz/schwarz/schwarz) an die Enden von zwei T-Stücken 5 und 6 (Rohr T-Stecker ID: 1,5 mm; siehe Stecker grün in Abbildung 2).
4. Schließen Sie das freie Ende des Teils e des FBPT an die linke Seite des montierten Steckers grün (5) an und platzieren Sie das vorbereitete Teil f des FBPT an der gegenüberliegenden Seite des Steckers grün (5). Legen Sie das freie Ende des Teils f des FBPT in die linke Seite des montierten Steckers grün (6) und legen Sie das vorbereitete Teil g des FBPT an der gegenüberliegenden Seite des Steckers grün (6). Fügen Sie das vorbereitete Teil h des FBPT an das freie Ende des montierten Steckverbinders grün (5) und das vorbereitete Teil i des FBPT an das freie Ende des montierten Steckers grün (6) an.
5. Schließen Sie einen Kombistopper an eine hypodermische Nadel (G 23 x 1 1'4'/x 0,60 mm x 30 mm) an und fügen Sie ihn einem Dreiwegeventil hinzu. Legen Sie das vorbereitete Dreiwegeventil mit der Nadel in das freie Ende des Teils h des FBPT. Schließen Sie einen Kombistopper an eine hypodermische Nadel an und legen Sie die Nadel in das freie Ende des Teils i des FBPT.
   HINWEIS: Vor Beginn der Online-Blutentnahme siehe Abschnitt 5.
6. Setzen Sie die freien Enden von Teil c und g des FBPT in einen 100 ml Becher gefüllt mit 20 ml heparinisierter Salinelösung (50 Einheiten/ml). Starten Sie die peristaltische Pumpe mit einer Durchflussrate von 1,52 ml/min, so dass das Shunt-System vollständig mit der physiologischen Salzlösung gefüllt ist. Danach drei Scherenklemmen an den Enden von Teil c und g und in der Mitte von Teil i des FBPT setzen.
7. Lösen Sie die Scherenklemmen aus Teil c und g des FBPT. Schließen Sie den arteriellen Katheter a an das freie Ende von Teil c des FBPT an und verbinden Sie den Venenkatheter b mit dem freien Ende des Teils g des FBPT (siehe Stecker orange in Abbildung 2).

3. Bildaufnahme und -rekonstruktion

1. Legen Sie das Tier in kopfgefährdeter Position auf die Shuttle-Bettpalette (70 mm). Steuern Sie die Atmung der Ratte und halten Sie die Körpertemperatur bei 37 °C bei 0,5 °C mit einem Heizkissen und einer rektalen Sonde während der gesamten Bildaufnahme. Bewegen Sie das Shuttlebett zur Injektion in die verlängerte Bettposition (Vorerfassung) und verbinden Sie die eingelegten Katheter mit dem Shunt-System.
2. Halten Sie das Tier unter Anästhesie mit Isofluran (2,5% Isofluran in Sauerstoff, Durchflussrate 1,2-1,5 l/min) über einen Nasenkegel.
3. Starten Sie die peristaltische Pumpe mit einer Durchflussrate von 1,52 ml/min, um das Shunt-System mit dem Blut des Tieres zu füllen. Bewegen Sie das Shuttlebett in die Mitte des Sichtfeldes des PET-Erkennungsrings und starten Sie das Online-Blutentnahmesystem (siehe Abschnitt 5).
4. Starten Sie den PET/CT-Workflow unter Verwendung von Parametern, die in Abschnitt 3.5 nach 60 s beschrieben sind, und injizieren Sie anschließend eine Dosis von ca. 22 MBq [¹⁸F]FDG in einem Volumen von ca. 0,5 x 0,1 ml intravenös über das T-Stück. Spülen Sie das T-Stück anschließend mit ca. 150 l heparinisierter Salinelösung.
5. Erwerben Sie ein dynamisches PET über 60 min und einen CT-Scan am Ende der PET-Bildgebung.
   1. Für die PET-Emissionserfassung 3600 s (60 min) in der Acquire-Option nach Zeit einstellung. Wählen Sie F-18 als Studienisotop und verwenden Sie 350–650 keV als Energielevel und 3.438 ns als Zeitfenster.
   2. Wählen Sie bei der CT-Erfassung in der Akquisitionsoption den Dämpfungsscan aus. Wählen Sie im Feld Projektionseinstellungen 120 Projektion für eine halbe Gesamtrotationaus. Wählen Sie für Die Einstellungen für Sichtfeld (FOV) und Auflösung niedrige Vergrößerung und 4 x 4 als Bindung mit 275 mm axialer Scanlänge und 3328 px als transaxiale CCD-Größeaus. Legen Sie im Feld Belichtungseinstellungen 500 A für Strom,80 kV für Spannung und 180 ms für belichtungszeitfest.
   3. Für PET-Emissionshistogramm e.B. eine Serie von 20 Bildern (6 x 10 s, 8 x 30 s, 5 x 300 s und 1 x 1800 s) als dynamische Rahmen. Wählen Sie Subtrahieren als Verzögerungenaus. Wählen Sie im Feld erweiterte Einstellungen 128 als Sinogrammbreite, 3 als Spanne, 79 als Ringdifferenz und Totzeitkorrektur.
   4. Verwenden Sie für die PET-Rekonstruktion die zweidimensionale geordnete Teilmengenerwartungsmaximierung (2D-OSEM) mit einem Streusinogramm,4 Iterationen und Fourier für die Rebinning als Rekonstruktionsalgorithmus. Wählen Sie 128 x 128 als Matrixgröße und verwenden Sie 1 als Bildzoom, alle als Frames und alle als Segmente.

4. Verfahren der manuellen Blutentnahme

1. Führen Sie manuelle Blutentnahme 30 s, 60 s, 90 s, 600 s und 1800 s nach dem Start der bildgebenden Erfassung.
   HINWEIS: Eine Erhöhung der Anzahl der manuellen Blutentnahmen, insbesondere innerhalb der ersten Minute nach der Tracer-Injektion, wird nach Möglichkeit dringend empfohlen. Daher muss das Blutprobenvolumen auf 20-30 l pro Probe⁶reduziert werden.
   1. Öffnen Sie das erste Drei-Wege-Ventil und sammeln Sie 100 l arterielles Blut in eine kapillare Blutentnahme EDTA Tube 30 s nach Tracer-Injektion. Wiederholen Sie dies für die anderen Zeitpunkte. Bestimmen Sie das Gewicht des leeren Röhrchens und des mit Blut gefüllten Rohres.
   2. Messen Sie die Aktivität (Zählungen/Zeiteinheit) des Vollbluts für 180 s in einem Brunnenzähler, der später kreuzkalibriert wird, um Daten in kBq/mL zu erhalten. Zeichnen Sie die Startzeit der Brunnenzählermessung auf. Berechnen Sie die Aktivität des Vollbluts für jeden Zeitpunkt der manuellen Blutentnahme in kBq/mL, wenden Sie die Zerfallskorrektur an und übertragen Sie die Daten in einer Zeitaktivitätskurve.

5. Verfahren der Online-Blutentnahme

1. Legen Sie das Rohr mit der Rohrführung in den Detektor. Starten Sie die Blutproben-Software (z.B. PSAMPLE) und öffnen Sie die Erfassungsschnittstelle. Stellen Sie sicher, dass der Computer der Online-Blutentnahme einrichtung und des PET/CT ist zeitsynchronisiert.
2. Drücken Sie die Starttaste genau 60 s, bevor der Tracer injiziert wird, um genügend Daten für die Hintergrundkorrektur zu erfassen. Speichern Sie die Rohdaten über die Speichertaste in der PMOD-Datenbank nach der Messung.
3. Zur Korrektur und Kalibrierung der Online-Blutdaten wechseln Sie zur Korrekturschnittstelle. Aktivieren Sie die Zerfallskorrektur und wählen Sie 18 F. Definieren Sie die Startzeit der Bildaufnahme und aktivieren Sie die Schaltfläche Durchschnitt, um die Hintergrundkorrektur durchzuführen. Aktivieren Sie die Kalibrierung und geben Sie den zuvor ermittelten Kalibrierfaktor ein (siehe Abschnitt 7.1).
4. Speichern Sie die korrigierten und kalibrierten Blutdaten mit der Save TAC-Taste und wählen Sie die Datei blood.crv. Diese Datei kann dann als Vollbluteingangskurve in das kinetische Modellierungswerkzeug geladen werden und kinetische Modellierung kann durchgeführt werden. Entkoppeln Sie die Katheter vom zusätzlichen korporativen Shunt-System.
5. Lösen Sie das Tier vom PET/CT-Scanner und einschläfern Sie es mit Pentobarbital.
   HINWEIS: In diesem Experiment wurden die Tiere nach den Messungen eingeschläfert, da Gehirne für In-vitro-Analysen im experimentellen Design verwendet wurden. Mit diesem Setup sind wiederholte Messungen in Längsstudien auch umsetzbar⁷. Verwenden Sie ein komplett neues Röhrensystem für das nächste Tier.

6. Bild abgeleitete Eingabefunktion

1. Öffnen Sie das Werkzeug Sicherung auf PMOD. Laden Sie das PET-Bild als Eingang und den CT als Referenz. Klicken Sie bereits übereinstimmen.
2. Öffnen Sie das VOXel of Interest (VOI)-Tool. Platzieren Sie den Cursor innerhalb der aufsteigenden Aorta in der CT. Klicken Sie auf vordefinierte sphärische VOI. Definieren Sie einen Radius von genau 0,7 mm. Extrahieren Sie die Zeitaktivitätsinformationen mit der VOI-Statistiktaste und kopieren Sie die gemittelten Werte in die Zwischenablage.

7. Verfahren der Kreuzkalibrierung des Twilitsystems, PET/CT und WellCounter

1. Twilite-PET/CT-Kalibrierung
   HINWEIS: Der vorgestellte Workflow für die Kalibrierung des Twilits basiert teilweise auf den Verfahren, die im Referenzhandbuch des PSAMPLE-Moduls von PMOD beschrieben sind.
   1. Füllen Sie eine Spritze mit ca. 100 MBq [¹⁸F]FDG. Messen Sie die genaue Aktivität A_F mit einem kalibrierten Dosiskalibrator und dokumentieren Sie sie zusammen mit Datum und Uhrzeit der Messung und dem Volumen der vollständigen Spritze. Die aufgezeichnete Zeit ist der Bezugszeitpunkt für alle durchzuführenden Zerfallskorrekturen.
   2. Füllen Sie einen Becher mit 500 ml Leitungswasser. Das genaue Volumen wird durch das Wägeverfahren bestimmt. Messen Sie das Gewicht m_e des leeren Bechers mit einer geeigneten und kalibrierten Präzisionsskala (zumindest Genauigkeitsklasse II). Füllen Sie den Becher mit dem Leitungswasser und messen Sie das Gewicht m_f des vollen Bechers.
   3. Berechnen Sie das Volumen V_b des Bechers unter Verwendung der Differenz der Masse und der Dichte des Leitungswassers (r = 0,998 g/ml bei 20 °C):
      
   4. Injizieren Sie die [¹⁸F]FDG in das gefüllte Becherglas und füllen Sie die leere Spritze auf ihr ursprüngliches Volumen mit inaktivem Leitungswasser auf und messen Sie die Aktivität A_E der nachgefüllten Spritze im Dosiskalibrator. Die Aktivitätskonzentration c_b der Lösung im Becher wird durch gegeben, die ca. 200 kBq/ml betragen sollte.
   5. Füllen Sie ein 50 ml kegelförmiges Zentrifugenrohr mit der Lösung aus dem Becherglas (große Luftblasen vermeiden) und legen Sie es zentral in das Sichtfeld des PET/CT-Scanners. Füllen Sie einen Katheter, der dem Typ des PET/CT-Bildgebungsexperiments entspricht, und legen Sie ihn in die Rohrführung des Twilitsystems. Füllen Sie den Katheter mit der Tracerlösung aus dem Becher mit der Peristaltikpumpe.
   6. Beginnen Sie die Messung der Zeitaktivitätskurve, wie in Abschnitt 5 beschrieben, mit dem gleichen Parameter für die Integrationszeit und der Rebinning wie im Experiment, ohne eine Katheterführung innerhalb des Messkopfs. Dieser Schritt stellt die Erfassung ausreichender Daten für eine entsprechende Hintergrundkorrektur sicher. Nach 2 min, ohne die Datenerfassung des Twilitsystems zu stoppen, legen Sie die Katheterführung mit dem gefüllten Rohr in den Messkopf und setzen Sie die Datenerfassung ca. 5 min fort.
   7. Starten Sie parallel eine 10 min PET-Erfassung des 50 ml konischen Zentrifugenrohres, gefolgt von einer Standard-CT-Erfassung zur Dämpfungskorrektur. Rekonstruieren Sie ein statisches PET-Bild des 50 ml konischen Zentrifugenrohrs mit demselben PET-Rekonstruktionsalgorithmus und Parametern, die in Abschnitt 3 beschrieben sind. Verwenden Sie ein nachbearbeitungsbildnes Werkzeug (z. B. PVIEW) und platzieren Sie einen zylindrischen VOI, der ca. 70% des Volumens in den rekonstruierten PET-Bildern des 50 ml konischen Zentrifugenrohrs abdeckt. Extrahieren Sie die mittlere Aktivitätskonzentration c_PET in kBq/ml innerhalb des VOI.
   8. Kehren Sie zur Blutproben-Software zurück und verwenden Sie den Kalibrierungsmodus, um die erworbene TAC für Zerfall, Verzweigungsfraktion und Hintergrund zu korrigieren. Fügen Sie alle notwendigen Informationen für Nuklid, Aktivitätskonzentration und die Startzeit der PET-Erfassung hinzu. Intern extrahiert die Software die mit dem Twilitsystem gemessene Zählrate (CR_twilite) und berechnet den Kreuzkalibrierungsfaktor für PET- und Twilit-System (CF_{PET/twilite):}
      
      HINWEIS: Es ist wichtig, dass das gleiche Isotop sowohl für Kalibrierungs- als auch für PET/CT-Experimente verwendet wird, da die Verzweigungsfraktion zwischen den verschiedenen Isotopen variiert, was bei der PET-Rekonstruktion korrigiert wird. Dieses Verfahren muss regelmäßig im Hinblick auf die Qualitätskontrolle wiederholt werden, wenn wichtige Komponenten des Systems geändert werden (z.B. Rohre, Erfassungs- und Rekonstruktionsparameter) und nach Reparaturarbeiten.
2. PET/CT-Well-Zählerkalibrierung
   1. Um den Kalibrierfaktor _{CF-Gutzähler} des Brunnenzählers zu berechnen, verwenden Sie die gleiche Aktivitätslösung, die im Becher für die Kalibrierung des Twilitsystems hergestellt wurde. Warten Sie ca. 6 h, um die Reduzierung der spezifischen Aktivität durch Zerfall zu ermöglichen, um totzeitliche Effekte des Szintillationsdetektors des Brunnenzählers zu minimieren. Deckeln Sie das Becherglas, um Verdunstung zu vermeiden.
   2. Berechnen Sie die genaue Zeitdifferenz zum Referenzzeitpunkt und bestimmen Sie die tatsächliche Aktivitätskonzentration c_b(t₊) der Lösung des Bechers, indem Sie die ursprüngliche Aktivitätskonzentration korrigieren. Pipette vordefinierte Volumina (_V-Probe), die mit dem Volumen der in den Experimenten gemessenen Blutproben (z. B. 200 l) identisch sind, aus dem Becher in fünf Sicherverschlussröhrchen. Messen Sie die Aktivität jedes der fünf Rohre mit dem Brunnenzähler für 180 s.
      ANMERKUNG: Wenn der Variationskoeffizient für eine einzelne Messung größer als 1 % ist, sollte die Messzeit erhöht werden. Zeichnen Sie die gemessene Zählrate in Anzahl pro Minute [cpm] für jedes Rohr und die Messstartzeit auf. Führen Sie eine Zerfallskorrektur durch.
   3. Berechnen Sie den Kalibrierfaktor CF_gut-zähler für jede Messung, indem Sie die zerfallskorrigierte Zählrate CR gut_durch die zerfallskorrigierte Aktivitätskonzentration des Bechers dividieren c_Becher(t+):
      
   4. Durchschnittlich die fünf Kalibrierfaktoren, um den mittleren Kalibrierfaktor zu erhalten.

Ergebnisse

Die Einrichtung des Shunt-Systems wird in Abbildung 2dargestellt. Repräsentative Ergebnisse der kontinuierlichen Blutentnahmedaten im Vergleich zu manuellen Blutentnahmedaten bei drei Wildtypratten über einen Zeitraum von 30 min sind in Abbildung 3A,Cdargestellt. Zu Beginn der kontinuierlichen Blutentnahme ist ein anfänglicher Höhepunkt (maximale Radioaktivitätskonzentration) bei 5 s nach der Tracer-Injektion zu sehen. Danach nimmt die Aktivität im Blut rapide ab und erreicht ein Plateau in ca. 15 min. In den manuellen Blutentnahmedaten ist der erkannte Peak kleiner und das Plateau ist nicht leicht zu definieren (Abbildung 3A,C). Der Vergleich der kontinuierlichen Blutentnahme mit den bildabgeleiteten Daten ist in Abbildung 3B,Ddargestellt. In den bildabgeleiteten Daten sind der Gipfel und der Ausgangspunkt des Plateaus deutlich sichtbar, dennoch ist das Maximum des Peaks kleiner als die kontinuierlichen Blutentnahmedaten für alle Tiere (Abbildung3B,D).

Ein suboptimales Ergebnis der kontinuierlichen Blutentnahme mit unserem Setup ist in Abbildung 3E,Fdargestellt. Zu Beginn der kontinuierlichen Blutentnahme war aufgrund der Blutgerinnung keine Datenerfassung innerhalb der ersten 3,5 min möglich. Durch trennen des Rohrsystems am Stecker orange und schwimmend mit heparinisierter Saline-Lösung wurde der Durchfluss im Rohrsystem neu gestartet und die Messung fortgesetzt. Ein Peak ist bei ca. 4 min zu sehen, der nicht das Maximum der Radioaktivität im Blut aufzeichnet (Abbildung 3E,F). Manuelle Blutentnahmen (Abbildung 3E) und bildabgeleitete Analysen (Abbildung 3F) waren noch möglich und mit den richtigen Ergebnissen vergleichbar.

Abbildung 3 : Repräsentative Ergebnisse einer kontinuierlichen Blutentnahme im Vergleich zur manuellen Blutentnahme. Typische arterielle Eingabefunktionen, die aus kontinuierlicher Blutentnahme im Vergleich zur manuellen Blutentnahme (linke Spalte) und einer kontinuierlichen Blutentnahme im Vergleich zum bildabgeleiteten Ansatz (rechte Spalte) abgeleitet werden, werden gezeigt. Die Panels A-D zeigen die Ergebnisse der korrekten Umsetzung des Protokolls bei zwei verschiedenen Tieren. Die Panels E und F veranschaulichen ein suboptimales Ergebnis der Messung. Alle angezeigten Daten wurden für den Kreuzkalibrierungsfaktor und den Hintergrund korrigiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Die vorgestellten Ergebnisse stammen aus einem größeren Projekt zur neuronalen Aktivität in einem transgenen Tiermodell der Huntington-Krankheit im Vergleich zu Wildtypratten. Insgesamt wurden 30 transgene und wildtypisierte Ratten katheterisiert und parallel zu [¹⁸F]FDG-PET/CT manuell und online blutentnahme. Drei AIF von Wildtypratten werden hier gezeigt, um die Bandbreite der möglichen Ergebnisse des Protokolls zu demonstrieren. Die Ergebnisse des gesamtumfassenden Projekts über Veränderungen der neuronalen Aktivität in einem Tiermodell der Huntington-Krankheit werden an anderer Stelle veröffentlicht.

Die hier beschriebene Methode ermöglicht eine schnelle und genaue kontinuierliche Blutentnahme in einer großen Kohorte und bietet einen lückenlosen AIF für die kinetische Modellierung dynamischer PET/CT-Daten bei Kleintieren. Eine externe Durchblutung wird erzeugt, um die tatsächliche Zeitaktivität im Blut der Tiere zu erkennen; dadurch ein Blutverlust vermieden wird. Der chirurgische Eingriff basiert auf Jespersen et al.⁸ und wurde modifiziert, um den Bedarf an arterieller Blutentnahme während der PET/CT-Messungen zu decken. Das Shunt-System wurde von Weber et al.⁹validiert. Mit dem hier verwendeten Setup läuft ein externes Blutvolumen von ca. 1,1 ml durch das Detektor-Pumpensystem. Eine Ratte im Alter von 4 Monaten hat ein Gesamtblutvolumen von etwa 30 ml. Der Durchmesser der Femoralvene und der Arterie beträgt ca. 0,45-0,6 mm¹⁰ und muss ein wenig ausgehungert sein, um den verwendeten Katheter einzufügen.

Der AIF kann auch mittels sporadischer manueller Blutentnahme gemessen oder aus frühen Zeitpunkten der PET-Bilder selbst rekonstruiert werden (bildabgeleitet). Beide Ansätze wurden mit den hier vorgestellten Daten durchgeführt und mit der kontinuierlichen Blutentnahme verglichen.

Im Vergleich zur manuellen Blutentnahme wird bei Online-Blutentnahme eine deutlich höhere zeitliche Auflösung (hier: 1800 Datenpunkte pro 30 min) möglich. Manuelle Blutentnahmen (hier: 5 Datenpunkte pro 30 min) sind auf das Blutvolumen des Kleintieres beschränkt, da diese Proben nicht in den Kreislauf des Tieres zurückgepumpt werden. Darüber hinaus ist ein maximales Intervall von 10-15 s technisch umsetzbar und wichtige Informationen für die kinetische Modellierung fehlen. Dies lässt sich auch in den dargestellten Daten ablesen, da ein Unterschied in der festgestellten Höchstmenge an kontinuierlicher und manueller Blutentnahme offensichtlich ist (Abbildung 3A,C,E). Bei der Online-Blutentnahme war der nachgewiesene Peak höher als bei der bildabgeleiteten Eingangsfunktion der aufsteigenden Aorta¹¹ (Abbildung 3B,D,F). Die von Imaged abgeleitete Eingabefunktion ist auf die räumliche Auflösung von PET-Scannern beschränkt, was zu Partmasseneffekten¹² führt und von den rekonstruierten Zeitrahmen beeinflusst wird.

Ein allgemeiner Vorteil dieses kontinuierlichen Blutentnahmeverfahrens besteht darin, dass der Tracer über den Katheter aufgetragen werden kann, der weniger anfällig für Störungen ist als eine Injektion über die seitliche Schwanzvene. Beachten Sie, dass der Tracer in einem moderaten Volumen aufgetragen werden sollte, um zu verhindern, dass der Tracer am Anfang des Rohrsystems verbleibt. Um sicherzustellen, dass keine Aktivität im totstehenden Volumen des T-Stücks verbleibt, wird es anschließend mit einer heparinisierten Salinelösung gespült. Darüber hinaus wird der Einsatz einer Infusionspumpe empfohlen, da sie die Einstellung der Geschwindigkeit der Tracer-Injektion ermöglicht und zu einer koordinierteren Erfassung der maximalen Radioaktivitätsspitze mit manueller Blutentnahme¹³beitragen kann.

Es gibt einige mögliche Schwierigkeiten, die während der Protokollverarbeitung auftreten können und durch die folgende Fehlerbehebung behoben werden können. Eine suboptimale Position der Katheter kann zu einer unvollständigen Ausführung des Protokolls führen, so dass sie genau mit der proximalen Naht fixiert werden und der Katheter 2-3 cm proximal in das Gefäß geschoben wird. Darüber hinaus kann Fibrin-Klebstoff verwendet werden. Auch die Bildung von Thromben kann die Katheter verstopfen. Dies kann durch Erhöhung der Heparinkonzentration und nachfolgende Spülung der Katheter oder des Rohrsystems gehandhabt werden. Ein solches suboptimales Ergebnis durch Verstopfung der Katheter wird in den Ergebnissen angezeigt, der maximale Peak wird verfehlt (Abbildung 3E). Ein weiterer kritischer Punkt in Bezug auf Tierschutz und Wohlbefinden ist die Länge des extrakorporalen Blutflusses. Es wird daher vorgeschlagen, die Länge des Rohrsystems auf ein Minimum zu reduzieren.

Bei der Blutentnahme sind drei Korrekturen des resultierenden AIF zu berücksichtigen. Erstens, Plasmakorrektur. Tracer gleichgewichtieren zwischen Plasma und Blutzellen, vor allem Erythrozyten. Je nachdem, wie schnell diese Diffusionsprozesse sind, ist der verfügbare Tracer hauptsächlich im Plasma vorhanden. Bei einigen Tracern muss das Verhältnis von Plasma zu Vollblut berücksichtigt werden, z. B. lipophiler. In diesen Fällen muss die Plasmaaktivität bestimmt werden. Wenn [¹⁸F]FDG verwendet wird, besteht keine Notwendigkeit, das Blut zu zentrifugieren, um die Plasmaaktivität zu bestimmen, da es sehr schnell zwischen Plasma und roten Blutkörperchen ausgleicht und die Verfügbarkeit von [¹⁸F]FDG im Plasma ähnlich der im Vollblut ist. Zweitens, metabolitenkorrektur. Viele Tracer werden im Vollblut metabolisiert und einige dieser Metaboliten sind noch radioaktiv¹⁴gekennzeichnet. Dieser Anteil ist im AIF vorhanden, steht aber nicht für die Gewebeaufnahme zur Verfügung. Bei einigen Tracern müssen Metaboliten im Vollblut oder Plasma bestimmt und der AIF korrigiert werden. Drittens, dispersionskorrektur. Die Streuung wird durch mehrere Faktoren verursacht, darunter a) die systematische Zeitverschiebung zwischen den Ankunftszeiten des Tracers im Gewebe im Verhältnis zur peripheren Probenahmestelle (Verzögerungskorrektur) und b) und die Verschmierung der Form des AIF als Tracertransport innerhalb des Rohrsystems wird durch seine erste Auftragsverzögerung (PT₁) Kinetik beeinflusst. Es wurden mehrere Korrekturen vorgeschlagen, die auf der Dekonvolution basieren, hauptsächlich auf der Grundlage des Modells von Iida et al.¹⁵, aber die meisten von ihnen sind anfällig für Lärm. Munk et al.¹⁶haben eine Korrekturmethode vorgeschlagen, die die Dekonvolution umgeht und daher weniger lärmanfällig ist. Für jede Kombination von Schläuchen und Tracer müssen die notwendigen Messungen durchgeführt werden, um die Korrekturparameter abzuschätzen. Die Dispersionskorrektur sollte vor der Zeitverzögerungskorrektur¹⁷erfolgen. Allerdings sind hauptsächlich schnelle Gewebeperfusionsprozesse von der Dispersion betroffen und es hat sich auch gezeigt, dass für die Modellierung von^[18F]FDG-Studien eine Dispersionskorrektur nicht unbedingt notwendig ist¹⁸. Daher wurde in den vorgestellten Beispielen die Dispersionskorrektur des AIF nicht angewandt.

Eine ordnungsgemäße Kalibrierung des Dosierkalibrators vor Ort und seine regelmäßige Qualitätskontrolle ist Voraussetzung für die hier vorgestellten Kreuzkalibrierungsverfahren. Wenn jedoch die dem Tier verabreichte Aktivität mit dem gleichen Dosiskalibrator gemessen wird, wird jede Abweichung in der Genauigkeit aufgehoben, sofern die Abweichung konstant ist und das vollständige Kreuzkalibrierungsverfahren, einschließlich Nuklilid-spezifische Korrekturen (z. B. für unterschiedliche Halbwertszeit oder unterschiedliche verzweigtes Verhältnis). Mit einem solchen Kalibrierungsverfahren zur Harmonisierung von PET/CT-Systemen, die in der menschlichen Gesundheitsversorgung und Forschung eingesetzt werden, konnte eine Genauigkeit von mindestens 5-10% erreicht werden^19,20.

Die kalibrierten und korrigierten AIF, die durch die erfolgreiche Umsetzung dieses Protokolls generiert werden, ermöglichen die Quantifizierung von PET/CT-Daten zur Charakterisierung von Tierseuchenmodellen, das Testen neuer Therapieoptionen, die Etablierung neuer Tracer und die vorhandenen Tracer in eine andere Art. Anscheinend liefert die kontinuierliche Blutentnahme bei [¹⁸]FDG-PET/CT bei Ratten die zuverlässigsten Informationen für die Berechnung des Inputs in der biokinetischen Modellierung. Unter Berücksichtigung des individuellen Stoffwechsels, insbesondere der Leberclearance, ist eine genauere Beurteilung der relevanten pathologischen oder therapeutischen Wirkungen möglich. Mit diesem praktikablen Protokoll ist eine höhere Effizienz der präklinischen PET/CT-Datenanalyse einfach umsetzbar.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Sugery für arteriovenöse Shunt
Anästhesiestation	Groppler
Aneurysma-Clips	Aesculap	FT190T	5 mm, Schließkraft 70 g
Bulldog-Klemme	Aesculap		35 mm
Präparierschere BC165	Aesculap	490-866	stumpf, für
Hautvorbereitung Heizmatte
Insulinspritze	Braun		30G
Nadelhalter	medicon	11.62.18	mikrochirurgische
Zange für Aneurysmaklemmen	Aesculap	FT 470T	Yasargil
Portex Polyethylenschlauch mit feiner Bohrung	Smith Medical	800/100/200	ID 0,58 mm, OD 0,96 mm; PE50 äquivalentes
Schlauch-Operationsmikroskop mit Kamera	Leica		M50 + MC120 HD
Nahtfilamente 6.0			6.0, Polypropylen-Nahtfilamente
3.0			3.0, resorbierbar, geflochten
zwei anatomische Pinzetten	Hammacher Soling	HSC601-11	Mikrochirurgie, 45°;
Gefäß- oder Hornhautschere	Geuder	G19605	Schere für die Mikrochirurgie
PET/CT Bildgebung
Dosiskalibrator ISOMED 2010	nivia instruments GmbH		für die Tracerportionierung
Inveon PET/CT	Siemens
Tracer (z.B. 18F-FDG)
manuel Blutentnahme
	KABE Labortechnik GmbH		GK 150 EDTA 200 µ l
Reagenzgläser	SARSTEDT		5 ml, 75 x 12 mm, PS
Well-Zähler CAPTUS 700t	Capintec		manuelle Messung der Blutaktivität
automatische Blutentnahme
; 18 G (1,3 mm x 32 mm)	BD	3932269	Luer-Anschlüsse (passend für T-Verbindungen)
Blutsampler Twilite Two	Swisstrace GmbH
Kombistopfen	Braun	4495101
Heparin			50U/ml für die Schlauchspülung vor dem Experiment und Aspiration während der Katheterchirurgie
Injektionsnadel			G23 x 1 1/4" / 0,6 x 30 mm
mikroprozessorgesteuerte Schlauchpumpe	Ismatec/Cole-Parmer	ISM596	12 Rollen, 2 Kanäle
PSAMPLE Modul	PMOD
Reduzieranschlüsse	Ismatec/Cole-Parmer	ISM569A	von ID 2,5 mm bis ID 1,5 mm
Silikon Pumpschläuche	Ismatec/Cole-Parmer	070535-17-ND /SC0065N	für Rollenpumpe (gelb/blau/gelb ID 1,52 mm, WT 0,84 mm, AD 3,2 mm)
Silikon Pumpschläuche - Adapter Schlauch	Ismatec/Cole-Parmer	SC 0107	schwarz/schwarz/schwarz ID 0,76 mm, WT 0,86 mm, AD: 2,48 mm
T-Stück oder T-Anschlüsse	Ismatec/Cole-Parmer	ISM 693A	ID 2,5 mm