Methodenartikel

Trennung von Rattenepidermis und Dermis mit Thermolysin zum Nachweis ortsspezifischer entzündlicher mRNA und Proteine

DOI:

10.3791/59708

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29. September 2021

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1Department of Anatomy and Cell Biology, Oklahoma State University Center for Health Sciences, 2Institute for Shock Physics, Washington State University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier wird ein Protokoll zur Trennung von Epidermis und Dermis vorgestellt, um die Produktion von Entzündungsmediatoren zu bewerten. Nach einer Entzündung wird die Hinterpfotenepidermis der Ratte durch Thermolysin bei 4 °C von der Dermis getrennt. Die Epidermis wird dann für die mRNA-Analyse mittels RT-PCR und die Proteinbewertung durch Western Blot und Immunhistochemie verwendet.

Zusammenfassung

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Einfach anzuwendende und kostengünstige Techniken sind erforderlich, um die ortsspezifische Produktion von Entzündungsmediatoren und Neurotrophinen bei Hautverletzungen, Entzündungen und / oder Sensibilisierungen zu bestimmen. Ziel dieser Studie ist es, ein epidermal-dermales Trennungsprotokoll mit Thermolysin, einer Proteinase, die bei 4 °C aktiv ist, zu beschreiben. Um dieses Verfahren zu veranschaulichen, werden Sprague Dawley-Ratten betäubt und rechte Hinterpfoten mit Carrageen injiziert. Sechs und zwölf Stunden nach der Injektion werden Ratten mit Entzündungen und naive Ratten eingeschläfert, und ein Stück Hinterpfote, glabrous Haut wird in kalte Dulbeccos Modified Eagle Medium gelegt. Die Epidermis wird dann an der Basalmembran durch Thermolysin in PBS mit Calciumchlorid von der Dermis getrennt. Als nächstes wird die Dermis durch eine Mikrodissektionszette gesichert und die Epidermis sanft weggeteist. Toluidinblaue Färbungen von Gewebeschnitten zeigen, dass die Epidermis sauber von der Dermis an der Basalmembran getrennt ist. Alle Keratinozytenzellschichten bleiben intakt, und die epidermalen Rete-Grate zusammen mit Vertiefungen von dermalen Papillen werden deutlich beobachtet. Qualitative und Echtzeit-RT-PCR wird verwendet, um den Nervenwachstumsfaktor und die Interleukin-6-Expressionsniveaus zu bestimmen. Western Blotting und Immunhistochemie werden schließlich durchgeführt, um Mengen an Nervenwachstumsfaktor zu erkennen. Dieser Bericht zeigt, dass die kalte Thermolysinverdauung eine wirksame Methode ist, um Epidermis von Dermis zu trennen, um mRNA- und Proteinveränderungen während einer Entzündung zu bewerten.

Einleitung

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Die Beurteilung von Entzündungsmediatoren und neurotrophen Faktoren aus der Haut kann aufgrund der Heterogenität der Zelltypen in der entzündeten Dermis und Epidermis eingeschränkt sein1,2,3. Mehrere Enzyme, chemische, thermische oder mechanische Techniken, die die Trennung der beiden Schichten oder die Durchführung der Zelldissoziation zur Bewertung beinhalten, wurden kürzlich überprüft4. Säure, Alkali, neutrales Salz und Hitze können die Epidermis schnell von der Dermis trennen, aber zelluläre und extrazelluläre Schwellungen treten häufig auf

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Protokoll

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Dieses Protokoll folgt den Tierpflegerichtlinien des Oklahoma State University Center for Health Sciences IACUC (#2016-03).

1. Carrageen-induzierte Entzündung (C-II)

  1. Männliche und/oder weibliche Sprague Dawley-Ratten (200–250 g; 8–9 Wochen alt) mit Isofluran (oder injizierbarem Anästhetikum) betäuben.
  2. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Hornhaut berühren und die linke Hinterpfote leicht einklemmen. Wenn das Tier angemessen betäubt wird, wird keine Hornhaut- oder Pfotenreaktion beobachtet.
  3. Subkutan injizieren Sie die rechte glabrous, hintere Pfote mit 100 μL 1% (w/v) λ-Carrageen, verdünnt in pho....

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Ergebnisse

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Carrageen-Injektion in die Hinterpfote der Ratte verursachte klassische Entzündungssymptome wie Rötung und Ödeme16,17. Die Schwellung der Hinterpfote wurde mit mechanischen Bremssättelngemessen 20. Ein Basiswert der Dicke der Pfote wurde für jede Ratte vor der Carrageenbehandlung erhalten und erneut nach 6 h und 12 h gemessen. Die Pfotendicke war im Vergleich zu den Ausgangswerten signifikant erhöht (Abbildung 1

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Diskussion

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Die Studie ergab, dass die Epidermis der glabrousen Hinterpfote der Ratte leicht von der Dermis mit Thermolysin (0,5 mG / ml) in PBS mit 1 mM Calciumchlorid bei 4 °C für 2,5 h getrennt werden konnte. Die histologische Auswertung ergab, dass die Epidermis an der Basalmembran von der Dermis getrennt war und dass die epidermalen Rete-Grate intakt waren. Thermolysin ist eine extrazelluläre Metalloendopeptidase, die von Gram-positivem (Geo)Bacillus thermoproteolyticus24produziert wird.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Angaben.

Danksagungen

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Die Finanzierung dieser Forschung wurde von den National Institutes of Health NIH-AR047410 (KEM) bereitgestellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
λ-CarrageenMillipore Sigma22049Subkutane Injektion von Carrageen induziert Entzündungen
7500 Schnelles Echtzeit-PCR-SystemThermo Fisher Scientific4351107Für die RT-PCR-Analyse
Calciumchlorid (CaCl2), wasserfreiesMillipore Sigma499609Verhindert die Autolyse von Thermolysin
Kristalleinbett wässriges EinbettmediumMillipore SigmaC0612Wässriges Eindeckmedium nach Toluidinblau-Färbung
Esel Anti-Maus Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA-31570Sekundärantikörper für Immunhistochemie
Esel Anti-Kaninchen IgG, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-21206Sekundärantikörper für Immunhistochemie
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermo Fisher Scientific11966-025Zur Aufrechterhaltung der Gewebeintegrität
EthylendiamintetraessigsäureMillipore SigmaE6758Stoppt die Thermolysin-Reaktion
Moloney Maus-Leukämievirus (M-MLV) Reverse TranskriptasePromegaM1701Für die komplementäre DNA-Synthese
Anti-NGF-Antikörper (E-12)Santa Cruz Biotechnologysc-365944Für Neurotrophin Immunhistochemie
ProLong Gold Antifade EindeckmittelThermo Fisher ScientificP36930Zur Verzögerung der Immunfluoreszenzlöschung
Kaninchen Anti-PGP 9.5Cedarlane LabsCL7756APFür die intraepidermale Nervenfärbung
SAS Sprague Dawley RatteCharles RiverStamm Code 400Tier für Entzündungsstudien verwendet
Shandon M-1 EinbettungsmatrixThermo Fisher Scientific1310TSGewebeeinbettungsmatrix für die Tinktorial- und Immunhistochemie
SimpliAmp ThermocyclerThermo Fisher ScientificA24811Für die RT-PCR-Analyse
SYBR Select MasterMix Thermo Fisher Scientific4472908Für die RT-PCR-Analyse
ThermolysinMillipore SigmaT7902Aus Geobacillus stearothermophilus
Toluidine BlueMillipore Sigma89640Für die Tinktorialfärbung für die Hellfeldmikroskopie
TRIzol ReagenzThermo Fisher Scientific15596026Für die Gesamt-RNA-Extraktion für RTPCR
Maus

Referenzen

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  1. Choi, J. E., Di Nardo, A. Skin neurogenic inflammation. Seminars in Immunopathology. 40 (3), 249-259 (2018).
  2. Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. The role of neurotrophins in inflammation and allergy. Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).
  3. Schäkel, K., S....

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Schlagwörter

Epidermal Dermal SeparationThermolysin DigestionSkin Inflammation ModelNerve Growth FactorInterleukin 6 ExpressionWestern BlottingImmunohistochemistryToluidine Blue StainingCarrageenan Induced InflammationSprague Dawley Rats

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