Verwendung von Zebrafisch-Lamellen, um die pathologischen Folgen von hämorrhagischen Stroke zu studieren

Die intrakerebrale Blutung (ICH) ist die schwerste Unterart des Schlaganfalls, der mit einem spontanen Bruch des Gehirns und einer Blutung in das Parenchyma einhergeht, das zu Hirnschäden, körperlicher Behinderung und oft Tod 1 führt. Trotz der hohen Sterblichkeits-und Morbiditätsrate, die mit ICH^{2 verbunden}ist, fehlt es immer noch an Verständnis für die zugrunde liegende Ätiologie und die Pathologie nach der Blutung. Daher gibt es keine spezifischen Behandlungen, um ICH zu verhindern oder die Ergebnisse der Patienten zu verbessern. Der größte Teil unseres Verständnisses von Krankheitsbiologie stammt aus präklinischen Nagetiermodellen desICH³, jedoch haben Studien in diesen Modellen bisher kein erfolgreiches therapeutisches Therapeutikum in die Klinik^4,5übersetzt. Dieses Versagen kann zum Teil auf einige Einschränkungen dieser präklinischen Modelle zurückzuführen sein, einschließlich der Unfähigkeit, die spontane Natur der menschlichen Krankheit leicht zu rekapitulieren, und die Notwendigkeit einer invasiven Chirurgie, um die Modelle bei Säugetieren 6 zu erzeugen. Darüber hinaus stellen Nagetiere praktische Probleme bei der Beobachtung des schnellen Auftretens von zellulären Reaktionen auf ICH in intaktem Gewebe dar. Angesichts des Mangels an Übersetzungen durch Nagetiermodelle ist die Entwicklung alternativer Modelle des spontanen ICH unerlässlich, wenn wir diese praktischen Probleme überwinden und dabei helfen wollen, neue Drogenziele zu identifizieren.

Die molekularen Mechanismen der Gefäßentwicklung sind unter Wirbeltieren, darunter Zebrafische (Danio rerio)⁷, gut erhalten. Als solche wird die Annahme dieses Modellorganismus zu einer immer nützlicheren mechanistischen Strategie für die Untersuchung von zerebrovaskulären Erkrankungen 8. Es wurden eine Reihe von Zebrafisch-Modellen entwickelt, die Phenotypen rekapitulieren, die mit Schlaganfall-bedingten Zuständen^{9,10,11, 12 in}Verbindung stehen. Der Einsatz von Zebrafisch-Larven zur Untersuchung von Krankheitserregern bietet sowohl praktische als auch wissenschaftliche Vorteile gegenüber Säugetiermodellen 8. Dazu gehören hohe Reproduktionsraten, eine rasante Entwicklung und eine Larventransparenz, die eine intravitale Bildgebung ohne die invasiven Einschränkungen von Nagetierenermöglicht. Die Kopplung dieser Vorteile mit der breiten Palette von transgenen Reporterlinien, die in der Zebrafisch-Forschunggemeinde zur Verfügung stehen, ist ein leistungsfähiger Ansatz in vivo , um die Krankheitsbiologie zu studieren, die noch nicht für die Untersuchung der pathologischen Folgen von ICH.

Die Verletzungsreaktion auf Blut im Gehirn ist biphasic 13; Die primäre Beleidigung verursacht neuronale Todesfälle und Zellnekrosen, die dann eine sekundäre Welle von Schäden auslösen, die durch angeborene Immunaktivierung ausgelöst wird. Die zweite Phase der Hirnverletzung, insbesondere die neuroinflammatorische Komponente, gilt als realistisches Ziel für die zukünftige medikamentöse Behandlung 13. In Zebrafisch-Larven wurden zuvor^{zuvor 14,}15^{,16, 17, 18,19}spontane und zerebartige Blutungen beschrieben. Zwei solcher Modelle sind der Einsatz von atorvastatin (ATV) bei 24 h Post-Befruchtung (hpf), um den HMGCR-Weg und die Cholesterin-Biosynthese¹⁴zu hemmen, und ein Blasenkopf (BBh) Mutant, das eine hypomorphe Mutation im Arhgef7 -Gen ausdrückt, Und hemmt in der Folge die Aktin-Umgestaltung für enge endovaskuläre Knotenpunkte^18. Diese Modelle weisen bei Beginn der Zirkulation einen spontanen zerebral-spezifischen Blutgefäßbruch auf (~ 33 hpf). In jüngster Zeit haben wir diese Modelle weiter charakterisiert, um zu zeigen, dass Schlüsselaspekte der Gehirnverletzungsreaktion zwischen Menschen und Zebrafisch-Larven 20 konserviert werden. Diese Studie zeigt die Methodik, die erforderlich ist, um spontane Hirnblutungen in Zebrafisch-Larven zu erhalten und zu visualisieren und wie man Gehirnverletzungen quantifiziert, und Bewegungsstörungen und neuroentzündliche Phenotypen, die sich auf den menschlichen Zustand beziehen. Diese Daten und Techniken unterstützen den Einsatz dieser Modellart als wertvolles Komplementärsystem für die präklinische ICH-Forschung.

Zebrafische wurden an der University of Manchester Biological Services Unit zu Standardbedingungen aufgezogen und gewartet^,wie zuvor beschrieben 21. Die adulte Zebrafischhaltung wurde von der University of Manchester Animal Welfare and Ethical Review Board genehmigt. Alle Experimente wurden nach den Vorschriften des britischen Innenministeriums durchgeführt (PPL:P132EB6D7).

NOTE: Transgene Linien, die in dieser Studie verwendet werden, umfassen makrophage-spezifische Linie mpeg1 :MCherry (im eigenen Haus gebaut wie^zuvorbeschrieben 22), neutrophil-spezifische mpo :GFP²³,erythroid-spezifische gata1: dsRed²⁴ und ubiq:secAnnexinV-mVenus, ein Reporter für Zelltod (in Haus²⁵neu abgeleitet) aufwilden, nacre (mitfa^w2/w2) und mutant (bbh^m292). Abbildung 1 zeigt die experimentelle Zeitachse.

Bild 1 : Grafik der experimentellen Zeitleiste zur Charakterisierung von Gehirnverletzungen, Bewegungsapparat und neuroinflammatorischen Ergebnissen. ICH, intracerebral hemorrhage; BBh, blehead. Die Abbildung wurde von Crilly et al.²⁰ mit Genehmigung unter einer Creative Commons-Lizenz reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 

1. Tag 0: Eierproduktion und-kollektion

1. Sammeln Sie befruchtete Embryonen aus natürlichem Laichen in Zuchtkästen, die aus 1 männlichen und 1-2 weiblichen erwachsenen Zebrafischen hergestellt werden.
   NOTE: Für das atorvastatin-Protokoll können alle Wildtype/transgene Tiere verwendet werden, wobei sich die Blutungen leicht zwischen den Stämmen unterscheiden.
2. 100 Embryonen bei 28 ° C im Standard-E3-Embryomedium pro Petrischale einwürgen und nach denStandardrichtlinien 26 Stadium.
3. Bei ca. 6 Stunden Nachdüngung (hpf) mit einer Pasteur-Pipette die abgestorbenen und unbefruchteten Embryonen aus der Schüssel entfernen.

2. Tag 1: Atorvastatin Behandlung bei 24 hpf

1. Dechorionate Embryonen für die atorischen Behandlung mit scharfen ultradünnen Abschnittskreps²⁷. Die für Experimente erforderlichen Zahlen können entsprechend angepasst werden.
2. Fügen Sie 30 ml E3 Embryo Medium zu zwei sauberen Petri Geschirr. Verwenden Sie ein Gericht für 100 Embryonen.
   Achtung: Wenn Platten für die Zellkultur ausgelegt sind, bleiben dechorionierte Zebrafische in diesem frühen Stadium oft am Boden. Um dies zu vermeiden, spülen Sie die Platten vor dem Gebrauch gründlich in sauberem Wasser ab.
3. 60 μL Embryonenwasser von der Aufbereitungsplatte entfernen und 60 μL von 0,5 mM atorvastatin (ATV) hinzufügen. Bei einer Lagerkonzentration von 0,5 mM führt die obige Verdünnung zu einer Endkonzentration von 1 μM, was zu ~ 20% der Larven ohne Blutungen (ICH-) und ~ 80% der Larven führt. Verwenden Sie die andere Platte für unbehandelte Kontrollen
   Hinweis: Atorvastatin wird in destilliertem Wasser (3 mg bis 10 ml) gelöst, um eine 0,5 mM-Lagerlösung zu bilden. Inkubieren Sie über Nacht bei Raumtemperatur in der Dunkelheit mit Rührung, da Lösungsansatlähmung einige Zeit in Anspruch nimmt. Eine vollständige Lösung kann bis zu 1 Woche dauern. Verwenden Sie DMSO nicht. Die Lösung wird auf-20°C alitiert und gespeichert. Tauwetter nicht einfrieren.
4. Mit einer Pasteur-Pipette 100 Embryonen in möglichst wenig Wasser auf die Aufbereitungsplatten übertragen.
5. Inkubieren Sie die Platten bei 28 ° C.
   Hinweis: ICH wird zwischen 33 und 48 hpf auftreten. Atorvastatin muss nicht entfernt werden, da Inkubation länger als 24 h keine weiteren Entwicklungsprobleme verursacht.

3. Tag 2: Trennung von ICH-und ICH + Populationen bei 50 hpf

1. Separate ICH + Fisch aus ICH-Populationen und Transfer zu neuen Gerichten für Leichtigkeit.
   1. Bei Verwendung des ATV-Modells bei einer Konzentration von 1 μM werden zu diesem Zeitpunkt 75-100% der Larven eine Blutung aufweisen.
      Hinweis: Die Reaktion der Larven unterscheidet sich zwischen Stämmen, wenn Larven nicht bei den gewünschten Frequenzen blutend sind, eine frische Charge von atorischen oder eine höhere Konzentration verwenden. Wenn Larven keine Blutungen von 48 hpf gezeigt haben, dann betrachten sie ICH-.
   2. Wenn Sie das bbh-Modell verwenden, werden alle homozygösen Mutanten eine Blutung um 48 hpf aufweisen. Bei Verwendung eines heterozygösen Inkreuzes können die ICH-Heterozygous-Geschwister und Wildgeschwister als Kontrolltiere für Experimente eingesetzt werden.
2. Wenn nötig, die Larven anästhetisieren, indem man 0,02% MS222 zu den E3-Medien hinzufügt. Mit einer Pasteur-Pipette sortieren Sie die Larven für das Vorhandensein von Blut im Kopf in frische E3-Medien. Siehe Abbildung 2.
   Hinweis: Blut im Kopf kann im Vordergrund, in der Mitte oder im Hintern oder in Kombination auftreten, und das blutende Volumen kann zwischen den Tieren variieren. Bei den BH-Mutanten wird ICH oft mit schweren Ödemen assoziiert, die durch größere Köpfe erkennbar sind, einem breiteren Raum zwischen den Augen und einem diffusen Blutbild. Allerdings weisen nicht alle ICH + bbh-Larven Ödeme auf.

Bild 2 : ICH + Hirnblutung Phenotypen. Beispiele für Larven-ICH-Phenotypen, die auf einem transgenen Gata1:DsRed-Renporter nacre Hintergrund mit einem Brightfield-Stereomikroskop (obere Panels) und Fluoreszenz (untere Tafel) bei ~ 48 h Nachdüngung beobachtet werden. In ICH-Larven (linke Tafeln) wurden keine Blutungen beobachtet. Eine deutliche Ansammlung von roten Blutkörperchen im Vorder-und Hinterhieb (Pfeile) wurde in ICH + Larven (rechte Panels) beobachtet. Die Abbildung ist 250 μm. Die Figur wurde unter der Genehmigung von Crilly et al.²⁰ mit Genehmigung unter einer Creative Commons-Lizenz reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 

4. Tag 3: Zelltod und Leukozytenanalyse bei 72 hpf

1. Screen Sie die Larven mit einem Fluoreszenzmikroskop, um die Expression von fluoreszierendem Protein zu gewährleisten.
   NOTE: In dieser Studie wurden transgene ubiq: secAnnexinV-mVenus Larven verwendet, um den Tod von Gehirnzellen und Doppel-transgener mpozu melden: GFP; mpeg1: MCherry oder ubiq: secAnnexinV-mVenus; mpeg1: mCherry, das für die Leukozyten-Analyse verwendet wird.
2. Füllen Sie die Lichtblechmontagskammer mit E3-Medien aus, die 0,02% MS222 enthalten.
3. Die Larven mit 0,02% MS222 anästhetisieren. Larven für die Montage (n = 1-6) in einem Tropfen auf eine trockene Petrischläche übertragen. So viel Flüssigkeit wie möglich entfernen.
   Hinweis: 1,5% niedrige Schmelzagarose wird mit 0,15 g niedriger Schmelz-und Arethan-, die sich in 10 mL E3-Medium ohne Methylenblau in einer Mikrowelle aufgelöst und bis zum Gebrauch bei 45 ° C halten, hergestellt.
4. Fügen Sie den Larven einen Tropfen von 1,5% mit niedrigem Schmelzhaken (der in einem 45 ° C-Wärmeblock als Flüssigkeit erhalten wird) und wird eine 800 μm große Montagekapillare verwendet, und ziehen Sie die Larven zuerst auf den Kopf. Ist die Positionierung nicht genau, können die Larven aus dem Acharose ausgestoßen und wieder montiert werden. Lassen Sie die Kapillare abkühlen, bevor Sie in die Lichtblattkammer einfügen.
   Hinweis: Alternativ könnte für dieses Verfahren ein konfokales Mikroskop verwendet werden. Dazu sollten Larven seitlich auf einer Glasbodenschüssel montiert werden.
5. Erwerben Sie z-stack-Bilder des Kopfes zwischen den Augenlinsen (~ 300 μm) und verarbeiten Sie ein Bild der maximalen Intensität.
   1. Analysieren Sie die Hirnregion aus Bildern, die für die Gesamtzahl der Fluoreszenzzellen und die Fluoreszenz der Intensität^gesammeltwurden 20.
6. Erstellen Sie ein Zeitraffer-Video von mehreren Projektionsverbundwerkstoffen über 18-24 h, um Leukozyten-Mobilität und Interaktion mit sterbenden Zellen zu verfolgen.
   Hinweis: Wenn eine langfristige Live-Bildgebung durchgeführt wird, wird nur eine Larve in der Kapillare montiert.
7. Wenn die Bildgebung abgeschlossen ist, vertreiben Sie die Larven aus der Montagekapillare in eine tödliche Überdosis von 4% MS222, um zu euthanisieren.

5. Tag 3: Larven für Motilitätsuntergang bei 72 hpf auswählen

1. Anästhesie Larven in den Petrischalen mit 0,02% MS222.
2. Zufällig n = 24 Larven für Motilitätsuntersuchungen auswählen und in frische E3-Medien übertragen und den Tieren erlauben, sich von der Betäubung zu erholen.
   Hinweis: Anästhetisch an dieser Stelle entfernt die Selektionsneigung für langsame Schwimmer, die leicht zu fangen sind.

6. Tag 3-5: Lokomotion mit 72, 96 und 120 hpf

1. Die Larven, die mit 72 hpf in das E3-Medium ohne Methylenblau ausgewählt wurden.
   Hinweis: Für die Belagerung um 3 dpf lassen Sie den Larven genügend Zeit, um sich von der Betäubung (& gt;1 h) zu erholen.
2. Platte eine Larve in 1 mL pro Brunnen einer 24-Well-Platte mit einer Pipette.
   NOTE: Schneiden Sie das Ende der Pipette-Spitze, um zu vermeiden, dass die Larven beschädigt werden. Die Plattengröße kann nach experimentellem Design verändert werden.
3. Laden Sie Platten in die Kamerokammer und die Bewegung für 10 Minuten mit Hilfe einer weißen Lichtleucht-Routine, um das spontane Schwimmen zu erhöhen.
   Hinweis: Das Schwimmverhalten wurde mit Hilfe einer Kamerakammer und Tracking-Software verfolgt (siehe Materialtabelle).
4. Wiederholungsexperiment mit den gleichen Larven bei 96 und 120 hpf. Larven vom einzelnen Gehäuse in der Assayplatte zu einer Petrischale bewegen und bei 28 ° C dazwischen Inkubaten inkubieren.
5. Bei der Fertigstellung der Tests, Euthanize Larven in einer tödlichen Überdosis von 4% MS222.

Bewertung des Datentotodes von Gehirnzellen mit transgenen Ubiq:secAnnexinV-mVenus führt zu klaren, definitiven Anhäufungen von sterbenden Zellen in ICH + Larven sowohl in ATV als auch BBh-Modellen, die in allen ICH-Larven fehlen (Abbildung3). Cluster ziehen vor 96 hpf ab Durch die Bildanalyse wird Blutungen mit einer signifikanten zweifachen Zunahme der Gesamtintensität des Fluoreszenzsignals im Gehirn verbunden, was auf einen deutlichen Zelltod hinweist.

Eine neuroinflammatorische Reaktion wird in ICH + Larven durch eine signifikant erhöhte Anzahl von mpeg1 positiven Makrophagenzellen im Gehirn festgestellt. Auch die Zahl der insgesamt mpo positiven Neutrophilen, die statistische Bedeutung erlangt haben, hat sich nicht erhöht (Abbildung 4). Die Morphologie der mpeg1 positiven Makrophagen kann auch bei ICH + Larven gesehen werden, da die Zellen eine aktive, abgerundete, amoeboide Form annehmen. Diese aktivierten abgerundeten Zellen können auch im Laufe der Zeit überwacht werden, um eine erhöhte phagozytische Reaktion des Ubiq zuzeigen: secAnnexinV-mVenus, die sterbende Zellen in ICH + Larven ausdrückt (Abbildung 5). Die positiven Makrophagen, die ramifizierte Prozesse aufweisen, wurden als inaktiv eingestuft.

Die Gehirnblutung ist mit einem signifikanten Rückgang der Beweglichkeit bei 72 und 96 hpf im Vergleich zu ICH-Geschwisterkontrollen sowohl bei bbh als auch bei ATV-Modellen verbunden (Abbildung6). Die Beweglichkeit bei 120 hpf erholt sich in der Nähe der Basiswerte. Es gibt oft Unterschiede in der Basismotilität zwischen Eierkupplungen und Stämmen, und daher sollte man sich jedes Mal mit ICH-Kontrollen vergleichen.

Bild 3 : Intrakerebrale Blutungen (ICH) in Zebrafisch-Larven führen zu einer quantifizierbaren Hirnverletzung. (A) repräsentative Bilder des Hirnverletzungs-Phenotyps in ICH + Larven (rechte Tafeln), im Vergleich zu ICH-Geschwistern (linke Tafeln), bei 72 hpf. Brightfield-Bilder (Bodenplatten, Skalenbalken = 250 μm) zeigen das Vorhandensein von Hirnblutungen (Pfeile) in ICH + Larven. Die fluoreszierende Mikroskopie wurde durchgeführt, um den Zelltod in der Ubiq:secAnnexinV-mVenus Reporterlinie zu visualisieren (obere Panels, Skala bar = 100 μm). In den peri-Hämoatomalregionen wurden Cluster von sterbenden Zellen beobachtet. Die Bilder wurden in Gehirnregionen geschnitten und mit Hilfe des Makros in der ergänzendenDatei 1 auf die gesamte grüne Fluoreszenzintensität in runden Partikeln mit einem Durchmesser von mehr als 30 Pixeln (weiße Linie) analysiert. B) Quantifizierung des Fluoreszenzsignals in den Gehirnen von unbehandelten, ICH-und ICH + Larven, die durch das ATV-Modell (n = 12 pro Gruppe; 3 unabhängige Replikate) bei 72 hpf gewonnen werden. Beim Vergleich von ICH + mit unbehandelten Geschwistern (* * p = 0.004) und mit ICH-(* p = 0,03) wurden signifikante Unterschiede beobachtet. C) Quantifizierung des Fluoreszenzsignals als Auslesen für annexinV-Bindung in den Gehirnen von ICH-und ICH + Larven, die durch das Blasenkopf-Modell (bbh) (n = 12 pro Gruppe; 2 unabhängige Replikate) bei 72 hpf gewonnen werden. Graphen zeigen SD aus dem Mittelwert. Zwischen ICH + und ICH-Altersgruppe wurde ein signifikanter Unterschied in der MVenus-Fluoreszenz beobachtet (* * p = 0.002). Die Abbildung wurde von Crilly et al.20 mit Genehmigung unter einer Creative Commons-Lizenz reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Bild 4 : Die intrakerebrale Blutung (ICH) initiiert eine angeborene zelluläre Immunantwort im Zarenfisch-Larvenhirn. Die Anzahl der Leukozyten, die in den zuvor beschriebenen Hirnregionen für mpo:GFP;mpeg1:dsRed doppelten transgenen Larven (n = 8 pro Gruppe; 2 unabhängige Replikate) bei 72 Hpf quantifiziert wurden, zeigt einen signifikanten Anstieg der Makrophagen (* p = 0,01), aber keine Neutrophilen (p = 0,5), als Reaktion auf ICH. Die Abbildung wurde von Crilly et al.20 mit Genehmigung unter einer Creative Commons-Lizenz reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 

Bild 5 : Aktivierte Makrophage-Zellen zeigen eine phagozytische Reaktion auf die Gehirnlähmung. A) repräsentative Zeitraffer sind immernoch 20, die eine verzweigte, patrouillierte Makrophage zeigen, die in eine anämneV-positive Zelle (i-vi) abwandert. Stills werden aus einer Reihe von Bildern gewonnen, die vom ganzen Gehirn mit einem 20x-Ziel aufgenommen wurden. Die Skalierstange stellt 50 μm dar. Die Makrophage erwarb eine Amoeboid-Morphologie (v), bevor sie die annexinV-positive Zelle (vi, vii) phagocytosing. Nach der Phagozytose nimmt die Makrophage eine verzweigte Morphologie wieder auf und wandert weg und die annexfrisch-positive Zelle ist nicht mehr zu sehen (viii). Ramified macrophage (#), annexinV positive Zelle (Pfeil), Amoeboid-Makrophage (*) werden angezeigt. B) repräsentative Bilder von mpeg1-positiven Zellen im ICH-und ICH + Larvenhirn, die Amoeboid und verzweigte Morphologien aufweisen. (C) Ein erhöhter Anteil an Amoeboid (Phagozytic) und ein verminderter (inaktiver) Makrophagen wurden in ICH + Gehirnen im Vergleich zu ICH-Geschwistern beobachtet. Die Abbildung wurde von Crilly et al.20 mit Genehmigung unter einer Creative Commons-Lizenz reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 

Bild 6 : Die durch ICH verursachte Hirnverletzung führt zu einem quantifizierbaren Bewegungsmangel bei Zebrafischlarven. A) repräsentative Beispiele für die Schwimmwege in ICH-und ICH + bbh-Larven bei 72, 96 und 120 hpf. (B) ICH + Larven wiesen einen signifikanten Rückgang der kumulierten Zeit auf, die während der 10-minütigen Aufzeichnungszeit bei 72 und 96 hpf für mobile Zeit ausgegeben wurde. Am 120. Z-P-P-Takt verlor sich an Bedeutung, die möglicherweise auf die Genesung von Hirnverletzungen anfällt (n = 24 Larven pro Gruppe; 3 unabhängige Replikate; * * * p = 0.00006; * * p = 0.003; ns: p = 0,08). C) Quantifizierung der kumulierten Zeit, die im Umzug in unbehandelten und ATV-behandelten ICH-und ICH +-Larven auf 120 hpf verbracht wird. ICH + Larven wiesen einen signifikanten Rückgang der kumulierten Zeit auf, die während der 10-minütigen Aufzeichnungszeit für mobile mobile Zeiten ausgegeben wurde. Drei technische Replikate (n = 24 Larven pro Gruppe) wurden verwendet, um SD aus dem Mittelwert zu berechnen (* * * p = 0.00004, * * p = 0.0003). Die Abbildung wurde von Crilly et al.20 mit Genehmigung unter einer Creative Commons-Lizenz reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 

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