Verwendung von Zebrafisch-Lamellen, um die pathologischen Folgen von hämorrhagischen Stroke zu studieren
5. Juni 2019
Hier stellen wir ein Protokoll zur Quantifizierung von Hirnverletzungen, Bewegungsdefiziten und Neuroentzündungen nach Blutungen im Gehirn in Zebrafisch-Larven vor, im Zusammenhang mit der menschlichen intrazerebralen Blutung (ICH).
Diese Methode bietet einen kostenlosen präklinischen Ansatz für die Untersuchung der unmittelbaren zellulären Reaktion auf Blut im Gehirn nach einem hämorrhagischen Schlaganfall, eine sehr ernste Erkrankung, für die wir keine spezifischen Medikamente für Patienten zur Verfügung haben. Im Gegensatz zu Nagetiermodellen ermöglicht uns die Transparenz von Zebrafischlarven, zelluläre Reaktionen im Gehirn lebender intakter Tiere in Echtzeit mithilfe der fluoreszierenden Mikroskopie zu beobachten. Verwenden Sie zunächst ein Teesieb, um alle befruchteten Embryonen aus dem natürlichen Laichen in Zuchtboxen zu sammeln, die von einem männlichen und einem bis zwei weiblichen erwachsenen Zebrafischen hergestellt werden.
Übertragen Sie 100 Embryonen auf jede Petrischale, die das Standard-E3-Embryomedium enthält. Inkubieren bei 28 Grad Celsius und Stufe nach Standard-Richtlinien. Nach sechs Stunden nach der Befruchtung tote und unbefruchtete Embryonen mit einer Pasteur-Pipette aus der Schale entfernen und das Geschirr wieder in den Brutkasten geben.
Nach der Befruchtung 24 Stunden nach der Befruchtung verwenden Sie unter einem hellfeldigen Stereomikroskop scharfe ultradünne Sezierzangen, um Embryonen für die Atorvastatin-Behandlung zu dekoorizieren. Dann fügen Sie 30 Milliliter E3 Embryo Medium zu zwei sauberen Petri-Schalen, eine für die Behandlung und die andere für die Kontrolle. Entfernen Sie 60 Mikroliter Embryowasser aus der Behandlungsschale und fügen Sie 60 Mikroliter 0,5 Millimolar Atorvastatin hinzu, um 80 % der blutüberstten Larven zu erreichen.
Mit einer Pasteur-Pipette 100 Embryonen in so wenig Wasser wie möglich auf jede Schale übertragen. Die beiden Gerichte bei 28 Grad Celsius bebrüten. Nach 50 Stunden nach der Befruchtung verwenden Sie unter dem Mikroskop eine Pasteur-Pipette, um bluterwerdende Fische sorgfältig von nicht blutrünstigen Populationen zu trennen und die Larven auf neue Gerichte mit frischen E3-Medien zu übertragen.
Um es einfacher zu machen, Blutungen positive Larven zu trennen, könnten Sie Fische ohne Pigment oder Fische verwenden, die fluoreszierendes Protein in roten Blutkörperchen ausdrücken. Am dritten Tag, unter einem fluoreszierenden Mikroskop Bildschirm die Larven, um die Expression von fluoreszierendem Protein zu gewährleisten. Dann füllen Sie die Lichtbogen-Montagekammer mit E3-Medien, die 0,2%MS-222 zur Anästhesisierung enthalten.
Mit einer Pasteur-Pipette ein einzelnes Tröpfchen mit ein bis sechs Larven zur Montage auf eine trockene Petrischalenoberfläche übertragen. Verwenden Sie eine Pipette, um so viel Flüssigkeit wie möglich zu entfernen. Fügen Sie einen Tropfen von 1,5% niedrige Schmelze Agarose aus dem 45 Grad Celsius Wärmeblock zu den Larven und verwenden Sie eine 800 Mikrometer Montage Kapillare, um die Larven Nachoben Kopf zuerst zu ziehen.
Wenn die Positionierung nicht korrekt ist, vertreiben Sie die Larven aus der Agarose und montieren Sie sie wieder. Lassen Sie die Kapillare abkühlen und legen Sie sie dann in die Lichtbogenkammer ein. Drücken Sie auf die ZEN-Bildgebungssoftware kontinuierlich, um die Larven zu orientieren, und erfassen Sie z-stack-Bilder des Kopfes zwischen den Augenlinsen.
Generieren Sie auf der Registerkarte Verarbeitung aus jedem Z-Stack ein Projektionsbild mit maximaler Intensität. Um nach dem Zufallsprinzip für motility assay auszuwählen, übertragen Sie 24 Larven nach der Anästhesie in frische E3-Medien und lassen Sie die Tiere sich von der Anästhesie erholen. Nachdem sich die Larven vollständig von der Anästhesie erholt haben, mit einer Pipette mit dem Endschnitt transferiert wiedergewonnene Larven in E3 Medium ohne Methylenblau.
Platte eine Larve in einem Milliliter pro Brunnen einer 24 Brunnenplatte. Laden Sie die Platte in die Kamerakammer. Passen Sie in der EthoVision XT-Tracking-Software die Experimenteinstellungen an, um eine weiße Licht-Erschreckt-Routine einzurichten, um die spontane Schwimm- und Assay-Bewegung für 10 Minuten zu erhöhen.
Wiederholen Sie den Bewegungstest bei 96 und 120 Stunden nach dem Fertilizatin. Die Beurteilung des Hirnzelltodes unter Verwendung einer transgenen Ubiquitin-Sekretion Annexin V M venöse Reporterlinie führt zu eindeutigen Clustern sterbender Zellen in blutüberstten Larven, die in allen nicht blutüberstten Larven fehlen, die durch grüne Fluoreszenz angezeigt werden. Sterbende Zellen wurden sowohl in Atorvastatin als auch in Blasenkopfmodellen für blutüberlegte Larven beobachtet.
Die Morphologie der MPEG1-positiven Makrophagen ändert sich in intrazerebralen Blutungen, positive Larven, wenn die Zellen in aktiver abgerundeter Amoemoemoide-Form annehmen. Diese aktivierten abgerundeten Zellen wurden im Laufe der Zeit überwacht, um eine erhöhte phagozytische Reaktion des ubiquitin sezerzierten Annexin V M venös entrisierend sterbenden Zellen in intrachrraren Blutungen positive Larven zu zeigen. Hirnblutungen sind mit einer signifikanten Verringerung der Beweglichkeit bei 72 und 96 Stunden nach der Befruchtung im Vergleich zu intrazerebralen Blutungen negative Geschwisterkontrollen verbunden.
Die Beweglichkeit nach 120 Stunden nach der Befruchtung erholt sich auf ein Nahelandniveau. Der wichtigste Aspekt dieses Verfahrens ist es, die Larven gründlich auf das Vorhandensein oder Fehlen von Hirnblutungen zu untersuchen, bevor Sie zu den Phänotypisierungstests übergehen. Dieses Modell kann auch für das Arzneimittelscreening verwendet werden, um festzustellen, ob die Schwere des Phänotyps nach einer Blutung verbessert werden kann, ein Ansatz, der uns dazu bringen kann, neue Arzneimittelkandidaten in der Zukunft zu identifizieren.
Diese Technik ermöglicht es uns, die zellulären Reaktionen unmittelbar nach einer Blutung im Gehirn während eines Zeitpunkts zu erforschen, der bisher so notorisch schwierig zu studieren war. Obwohl keines der in diesem Protokoll beschriebenen Reagenzien oder Instrumente besonders gefährlich ist, müssen bei der Verwendung von Chemikalien, Scharfen oder Lasern überall Standardsorgfalt und Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden.
Übersicht
Diese Studie stellt ein Protokoll zur Quantifizierung von Hirnschäden, motorischen Defiziten und Neuroinflammation bei Zebrafischarven nach einer intrazerebralen Blutung (ICH), einer schwerwiegenden Erkrankung des Menschen, vor. Die Nutzung der Transparenz der Zebrafischarven ermöglicht die Echtzeitbeobachtung zellulärer Reaktionen in einem lebenden Gehirnmodell nach hämorrhagischem Schlaganfall.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Neuroinflammation
- Schlaganfall-Rehabilitation
Hintergrund
- Intrazerebrale Blutung (ICH) ist ein schwerer medizinischer Zustand, für den es keine spezifischen Behandlungen gibt.
- Zebrafischembryonen dienen als innovatives Modell zur Untersuchung von Gehirnreaktionen aufgrund ihrer Transparenz.
- Mittels Echtzeit-Bildgebung lassen sich Einblicke in die zellulären Dynamiken nach einer Hirnverletzung gewinnen.
- Die Studie verwendet fluoreszierende Mikroskopie, um Neuroinflammation und andere zelluläre Reaktionen im Gehirn zu bewerten.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines präklinischen Modells zur Untersuchung der zellulären Reaktion auf hämorrhagischen Schlaganfall.
- Untersuchung der Auswirkungen von ICH auf die Lokomotion und Neuroinflammation.
- Erkundung potenzieller Wirkstoffkandidaten zur Abschwächung der Folgen von ICH.
Verwendete Methoden
- Die Hauptplattform ist die Fluoreszenzmikroskopie zur Abbildung zellulärer Reaktionen.
- Als biologisches Modell dienen Zebrafischembryonen, wobei der Fokus auf Hirnverletzungen infolge induzierter Blutungen liegt.
- Zu den wichtigsten Zeitpunkten gehören die Sammlung der Embryonen, die Applikation der Behandlung sowie die anschließende Bildgebung zu definierten Zeitpunkten nach der Befruchtung.
- Kritische Phasen umfassen die Überwachung der Motilität und die Beurteilung der neuroinflammatorischen Reaktionen über mehrere Tage hinweg.
Hauptergebnisse
- Es wurden signifikante zelluläre Reaktionen beobachtet, darunter Zellverbände absterbender Zellen in blutenden Larven.
- Nach der Blutung wurde eine verminderte Beweglichkeit festgestellt, die bis 120 Stunden teilweise wiederhergestellt war.
- Aktivierte Makrophagen zeigten morphologische Veränderungen, die mit der ICH-Reaktion assoziiert sind.
- Dieses Modell ermöglicht die Beurteilung potenzieller therapeutischer Ansätze bei Schlaganfall.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie etabliert ein Zebrafisch-Modell zur Untersuchung von ICH und deren zellulären Auswirkungen.
- Der Ansatz könnte die Arzneimittelscreening-Bemühungen zur Verbesserung der Ergebnisse nach Hirnblutung erleichtern.
- Insgesamt trägt dies zum Verständnis der zellulären Dynamik nach Hirnverletzung und möglicher Erholungsmechanismen bei.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Zebrabärbling-Larvenmodelle schließen eine kritische Lücke in der Forschung zu hämorrhagischen Schlaganfällen, indem sie die Echtzeit-Visualisierung zellulärer Reaktionen auf eine intrazerebrale Blutung ermöglichen – ein Prozess, der in undurchsichtigen Säugetiersystemen schwer zu erfassen ist. Dieser Ansatz unterstützt die frühe Validierung von Zielstrukturen und die mechanistische Risikominderung, indem Neuroinflammation, Zelltod und funktionelle Defizite in einem krankheitsrelevanten in-vivo-System quantifiziert werden. Die Verträglichkeit des Modells mit Live-Bildgebung und Beweglichkeitsassays liefert eine vorhersagbare Zuverlässigkeit für das Screening therapeutischer Kandidaten, die darauf abzielen, die durch Blutungen verursachte Pathologie zu verringern.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Visualisierung unmittelbarer zellulärer Reaktionen auf Blut im Gehirn und unterstützt die Zielvalidierung in Signalwegen der hämorrhagischen Schlaganfälle.
- Operativer Wert: Erleichtert die biologische Risikominimierung anhand konservierter pathologischer Phänotypen wie sterbende Zellverbände und Makrophagenaktivierung, die menschlichen ICH-Reaktionen entsprechen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte, quantitative Messgrößen für motorische Dysfunktion und Neuroinflammation und ermöglicht dadurch eine zuverlässige Verbindungsevaluierung im phänotypischen Screening.
- Operationaler Wert: Unterstützt die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit des Assays durch gestaffelte Larvenpopulationen und automatisierte Verfolgung (z. B. EthoVision XT) und erhöht so den Durchsatz für die Identifizierung von Leitverbindungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Zeigt die translative Kontinuität, indem er zentrale Folgen einer intrazerebralen Hämorrhagie – Neuroinflammation, Zelltod und motorische Defizite – nachbildet und so die präklinische Validierung mechanismenbasierter Interventionen ermöglicht.
- Operativer Wert: Ermöglicht die longitudinale Beurteilung von 72 bis 120 Stunden nach der Befruchtung und unterstützt so entscheidungsrelevante Maßnahmen mit angepasstem Risikoprofil, basierend auf phänotypischer Erholung oder anhaltenden Defiziten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Das Larven-Ich-Modell des Zebrabärblings fügt sich in die Entdeckungskette von der Zielvalidierung bis zur Leitstrukturidentifizierung ein und schlägt eine Brücke zwischen mechanistischem Verständnis und präklinischer Wirksamkeitsprüfung.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen, indem sie die Echtzeit-Bildgebung von Annexin-V-positiven sterbenden Zellen und morphologischen Veränderungen von MPEG1-Makrophagen nach einer Blutung ermöglicht.
- Screening: Bietet Bereitschaft für Assays durch quantifizierbare Beweglichkeitsassays zu 96 und 120 hpf und liefert skalierbare, reproduzierbare Verhaltensendpunkte für die Wirkstoffprüfung.
- Analytik: Erbringt messbare Ergebnisse, darunter die Fluoreszenzintensität von Zelltod-Reportern, Veränderungen der Makrophagenmorphologie und Daten zur Bewegungsverfolgung, und ermöglicht so die vergleichende Analyse unter verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Kontinuität, indem sie konservierte menschliche ICH-Pathologien modelliert und Studien zur biomarkerbasierten Zielstrukturenbindung unterstützt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Plattform für die mechanistische Untersuchung und Risikominderung von Zielstrukturen über mehrere therapeutische Modalitäten hinweg, dank ihrer nicht-terminalen, quantifizierbaren Endpunkte.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine vorhersagbare Sicherheit bei der Zielvalidierung, indem die mechanistische Uneindeutigkeit durch direkte Beobachtung von hämorrhagieinduzierter Neuroinflammation und Zelltod reduziert wird.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch definierte Stadieneinteilung (z. B. Dekoronation nach 24 hpf, Behandlung mit Atorvastatin) und verblindete Sortierung nach Hämorrhagie vor phänotypischen Assays.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem frühzeitige Wirksamkeitssignale in einem krankheitsrelevanten System ermöglicht werden und somit biologische Risiken in späteren Entwicklungsstadien bei der Schlaganfalldrugentwicklung verringert werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem Verbindungen identifiziert werden, die hämorrhagische Phänotypen verbessern, und die Weiterentwicklung auf Grundlage funktioneller Erholung und zellulärer Rettung erfolgt.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Zebrafischhaltung, der embryonalen Stadienbestimmung und der fluoreszenzmikroskopischen Live-Bildgebung.
- Ist abhängig von der verfügbaren Instrumentierung, einschließlich Lichtblatt- oder Fluoreszenzmikroskopen, Agarose-Einbettungssystemen und automatisierten Verhaltensverfolgungstools (z. B. EthoVision XT).
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen bei der Beurteilung von Blutungen und der Trennung von Larven, um die Validität der phänotypischen Assays sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungen für pigmentfreie oder transgene Reporterkonstrukte, um die Detektion von Blutungen und die Signalqualität zu verbessern.
- Ist im Vergleich zu höheren Wirbeltieren durch die geringe Größe der Larven und begrenzte Durchsatzkapazität eingeschränkt, was jedoch durch kurze Generationszeiten und optische Zugänglichkeit kompensiert wird.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
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Title
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Day 0: Egg Production and Collection
1:11
Day 1 - 2: Atorvastatin Treatment and ICH- and ICH+ Populations Separation
2:22
Day 3 - 5: Cell Death, Leukocyte Analysis and Motility Assay
4:24
Results: Intracerebral Hemorrhage (ICH) in Zebrafish Larvae
5:39
Conclusion
