Name: Verwendung von Zebrafisch-Lamellen, um die pathologischen Folgen von hämorrhagischen Stroke zu studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit Zebrafisch-Larven die zellulären Reaktionen auf hämorrhagischen Schlaganfall in Echtzeit untersuchen. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Hirnverletzungen, Bewegungsdefiziten und Neuroinflammation.

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Wir danken Dr. David Spiller und der University of Manchester Systems Microscopy Core Facility für den Einsatz der Geräte, Prof. Richard Baines für den Einsatz von DanioVision und Dr. Jack Rivers-Auty für die statistische Beratung. Die BBh-Linie wurde freundlicherweise von Nicole Munsie vom Labor von Dr. Sarah Child an der Universität Calgary geteilt. Wir danken auch Prof. Stephen Renshaw, Dr. Adam Hurlstone, Dr. Andrew Badrock und Dr. Helen Young für die Fischlinien und-ausrüstung.
Diese Studie wurde unterstützt von der NC3Rs (NC/N002598/1), der Stroke Association (TSA LECT 2017/02), ERA-NET NEURON (MR/M501803/1) und der British Heart Foundation (FS/15/32038). Besonders dankbar sind wir auch dem Natalie Kate Moss Trust und der Fakultät für Biologie, Medizin und Gesundheit der Universität Manchester für ihre weitere finanzielle Unterstützung.

Zebrafische wurden an der University of Manchester Biological Services Unit zu Standardbedingungen aufgezogen und gewartet,wie zuvor beschrieben 21. Die adulte Zebrafischhaltung wurde von der University of Manchester Animal Welfare and Ethical Review Board genehmigt. Alle Experimente wurden nach den Vorschriften des britischen Innenministeriums durchgeführt (PPL:P132EB6D7).
NOTE: Transgene Linien, die in dieser Studie verwendet werden, umfassen makrophage-spezifische Linie mpeg1 :MCherry (im eigenen Haus gebaut wiezuvorbeschrieben 22), neutrophil-spezifische mpo :GFP23,erythroid-spezifische gata1: dsRed24 und ubiq:secAnnexinV-mVenus, ein Reporter für Zelltod (in Haus25neu abgeleitet) aufwilden, nacre (mitfaw2/w2) und mutant (bbhm292). Abbildung 1 zeigt die experimentelle Zeitachse.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Bild 1 : Grafik der experimentellen Zeitleiste zur Charakterisierung von Gehirnverletzungen, Bewegungsapparat und neuroinflammatorischen Ergebnissen. ICH, intracerebral hemorrhage; BBh, blehead. Die Abbildung wurde von Crilly et al.20 mit Genehmigung unter einer Creative Commons-Lizenz reproduziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 
1. Tag 0: Eierproduktion und-kollektion
<ol><li>Sammeln Sie befruchtete Embryonen aus natürlichem Laichen in Zuchtkästen, die aus 1 männlichen und 1-2 weiblichen erwachsenen Zebrafischen hergestellt werden. NOTE: Für das atorvastatin-Protokoll können alle Wildtype/transgene Tiere verwendet werden, wobei sich die Blutungen leicht zwischen den Stämmen unterscheiden.</li>
	<li>100 Embryonen bei 28 ° C im Standard-E3-Embryomedium pro Petrischale einwürgen und nach denStandardrichtlinien 26 Stadium.</li>
	<li>Bei ca. 6 Stunden Nachdüngung (hpf) mit einer Pasteur-Pipette die abgestorbenen und unbefruchteten Embryonen aus der Schüssel entfernen.</li>
</ol>2. Tag 1: Atorvastatin Behandlung bei 24 hpf
<ol><li>Dechorionate Embryonen für die atorischen Behandlung mit scharfen ultradünnen Abschnittskreps27. Die für Experimente erforderlichen Zahlen können entsprechend angepasst werden.</li>
	<li>Fügen Sie 30 ml E3 Embryo Medium zu zwei sauberen Petri Geschirr. Verwenden Sie ein Gericht für 100 Embryonen. Achtung: Wenn Platten für die Zellkultur ausgelegt sind, bleiben dechorionierte Zebrafische in diesem frühen Stadium oft am Boden. Um dies zu vermeiden, spülen Sie die Platten vor dem Gebrauch gründlich in sauberem Wasser ab.</li>
	<li>60 μL Embryonenwasser von der Aufbereitungsplatte entfernen und 60 μL von 0,5 mM atorvastatin (ATV) hinzufügen. Bei einer Lagerkonzentration von 0,5 mM führt die obige Verdünnung zu einer Endkonzentration von 1 μM, was zu ~ 20% der Larven ohne Blutungen (ICH-) und ~ 80% der Larven führt. Verwenden Sie die andere Platte für unbehandelte Kontrollen Hinweis: Atorvastatin wird in destilliertem Wasser (3 mg bis 10 ml) gelöst, um eine 0,5 mM-Lagerlösung zu bilden. Inkubieren Sie über Nacht bei Raumtemperatur in der Dunkelheit mit Rührung, da Lösungsansatlähmung einige Zeit in Anspruch nimmt. Eine vollständige Lösung kann bis zu 1 Woche dauern. Verwenden Sie DMSO nicht. Die Lösung wird auf-20°C alitiert und gespeichert. Tauwetter nicht einfrieren.</li>
	<li>Mit einer Pasteur-Pipette 100 Embryonen in möglichst wenig Wasser auf die Aufbereitungsplatten übertragen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platten bei 28 ° C. Hinweis: ICH wird zwischen 33 und 48 hpf auftreten. Atorvastatin muss nicht entfernt werden, da Inkubation länger als 24 h keine weiteren Entwicklungsprobleme verursacht.</li>
</ol>3. Tag 2: Trennung von ICH-und ICH + Populationen bei 50 hpf
<ol><li>Separate ICH + Fisch aus ICH-Populationen und Transfer zu neuen Gerichten für Leichtigkeit.<ol>
<li>Bei Verwendung des ATV-Modells bei einer Konzentration von 1 μM werden zu diesem Zeitpunkt 75-100% der Larven eine Blutung aufweisen. Hinweis: Die Reaktion der Larven unterscheidet sich zwischen Stämmen, wenn Larven nicht bei den gewünschten Frequenzen blutend sind, eine frische Charge von atorischen oder eine höhere Konzentration verwenden. Wenn Larven keine Blutungen von 48 hpf gezeigt haben, dann betrachten sie ICH-.</li>
		<li>Wenn Sie das bbh-Modell verwenden, werden alle homozygösen Mutanten eine Blutung um 48 hpf aufweisen. Bei Verwendung eines heterozygösen Inkreuzes können die ICH-Heterozygous-Geschwister und Wildgeschwister als Kontrolltiere für Experimente eingesetzt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenn nötig, die Larven anästhetisieren, indem man 0,02% MS222 zu den E3-Medien hinzufügt. Mit einer Pasteur-Pipette sortieren Sie die Larven für das Vorhandensein von Blut im Kopf in frische E3-Medien. Siehe Abbildung 2. Hinweis: Blut im Kopf kann im Vordergrund, in der Mitte oder im Hintern oder in Kombination auftreten, und das blutende Volumen kann zwischen den Tieren variieren. Bei den BH-Mutanten wird ICH oft mit schweren Ödemen assoziiert, die durch größere Köpfe erkennbar sind, einem breiteren Raum zwischen den Augen und einem diffusen Blutbild. Allerdings weisen nicht alle ICH + bbh-Larven Ödeme auf.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig2.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Bild 2 : ICH + Hirnblutung Phenotypen. Beispiele für Larven-ICH-Phenotypen, die auf einem transgenen Gata1:DsRed-Renporter nacre Hintergrund mit einem Brightfield-Stereomikroskop (obere Panels) und Fluoreszenz (untere Tafel) bei ~ 48 h Nachdüngung beobachtet werden. In ICH-Larven (linke Tafeln) wurden keine Blutungen beobachtet. Eine deutliche Ansammlung von roten Blutkörperchen im Vorder-und Hinterhieb (Pfeile) wurde in ICH + Larven (rechte Panels) beobachtet. Die Abbildung ist 250 μm. Die Figur wurde unter der Genehmigung von Crilly et al.20 mit Genehmigung unter einer Creative Commons-Lizenz reproduziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 
4. Tag 3: Zelltod und Leukozytenanalyse bei 72 hpf
<ol><li>Screen Sie die Larven mit einem Fluoreszenzmikroskop, um die Expression von fluoreszierendem Protein zu gewährleisten. NOTE: In dieser Studie wurden transgene ubiq: secAnnexinV-mVenus Larven verwendet, um den Tod von Gehirnzellen und Doppel-transgener mpozu melden: GFP; mpeg1: MCherry oder ubiq: secAnnexinV-mVenus; mpeg1: mCherry, das für die Leukozyten-Analyse verwendet wird.</li>
	<li>Füllen Sie die Lichtblechmontagskammer mit E3-Medien aus, die 0,02% MS222 enthalten.</li>
	<li>Die Larven mit 0,02% MS222 anästhetisieren. Larven für die Montage (n = 1-6) in einem Tropfen auf eine trockene Petrischläche übertragen. So viel Flüssigkeit wie möglich entfernen. Hinweis: 1,5% niedrige Schmelzagarose wird mit 0,15 g niedriger Schmelz-und Arethan-, die sich in 10 mL E3-Medium ohne Methylenblau in einer Mikrowelle aufgelöst und bis zum Gebrauch bei 45 ° C halten, hergestellt.</li>
	<li>Fügen Sie den Larven einen Tropfen von 1,5% mit niedrigem Schmelzhaken (der in einem 45 ° C-Wärmeblock als Flüssigkeit erhalten wird) und wird eine 800 μm große Montagekapillare verwendet, und ziehen Sie die Larven zuerst auf den Kopf. Ist die Positionierung nicht genau, können die Larven aus dem Acharose ausgestoßen und wieder montiert werden. Lassen Sie die Kapillare abkühlen, bevor Sie in die Lichtblattkammer einfügen. Hinweis: Alternativ könnte für dieses Verfahren ein konfokales Mikroskop verwendet werden. Dazu sollten Larven seitlich auf einer Glasbodenschüssel montiert werden.</li>
	<li>Erwerben Sie z-stack-Bilder des Kopfes zwischen den Augenlinsen (~ 300 μm) und verarbeiten Sie ein Bild der maximalen Intensität.<ol>
<li>Analysieren Sie die Hirnregion aus Bildern, die für die Gesamtzahl der Fluoreszenzzellen und die Fluoreszenz der Intensitätgesammeltwurden 20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erstellen Sie ein Zeitraffer-Video von mehreren Projektionsverbundwerkstoffen über 18-24 h, um Leukozyten-Mobilität und Interaktion mit sterbenden Zellen zu verfolgen. Hinweis: Wenn eine langfristige Live-Bildgebung durchgeführt wird, wird nur eine Larve in der Kapillare montiert.</li>
	<li>Wenn die Bildgebung abgeschlossen ist, vertreiben Sie die Larven aus der Montagekapillare in eine tödliche Überdosis von 4% MS222, um zu euthanisieren.</li>
</ol>5. Tag 3: Larven für Motilitätsuntergang bei 72 hpf auswählen
<ol><li>Anästhesie Larven in den Petrischalen mit 0,02% MS222.</li>
	<li>Zufällig n = 24 Larven für Motilitätsuntersuchungen auswählen und in frische E3-Medien übertragen und den Tieren erlauben, sich von der Betäubung zu erholen. Hinweis: Anästhetisch an dieser Stelle entfernt die Selektionsneigung für langsame Schwimmer, die leicht zu fangen sind.</li>
</ol>6. Tag 3-5: Lokomotion mit 72, 96 und 120 hpf
<ol><li>Die Larven, die mit 72 hpf in das E3-Medium ohne Methylenblau ausgewählt wurden. Hinweis: Für die Belagerung um 3 dpf lassen Sie den Larven genügend Zeit, um sich von der Betäubung (&amp; gt;1 h) zu erholen.</li>
	<li>Platte eine Larve in 1 mL pro Brunnen einer 24-Well-Platte mit einer Pipette. NOTE: Schneiden Sie das Ende der Pipette-Spitze, um zu vermeiden, dass die Larven beschädigt werden. Die Plattengröße kann nach experimentellem Design verändert werden.</li>
	<li>Laden Sie Platten in die Kamerokammer und die Bewegung für 10 Minuten mit Hilfe einer weißen Lichtleucht-Routine, um das spontane Schwimmen zu erhöhen. Hinweis: Das Schwimmverhalten wurde mit Hilfe einer Kamerakammer und Tracking-Software verfolgt (siehe Materialtabelle). </li>
	<li>Wiederholungsexperiment mit den gleichen Larven bei 96 und 120 hpf. Larven vom einzelnen Gehäuse in der Assayplatte zu einer Petrischale bewegen und bei 28 ° C dazwischen Inkubaten inkubieren.</li>
	<li>Bei der Fertigstellung der Tests, Euthanize Larven in einer tödlichen Überdosis von 4% MS222.</li>
</ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Diese Studie zeigt, dass ICH in Zebrafisch-Larven eine Gehirnverletzungsreaktion hervorruft, die wesentliche Aspekte des menschlichen Zustandes rekapituliert, die systematisch untersucht und quantifiziert werden können. Zebrafische bieten ein konsistentes und reproduzierbares Modell des spontanen ICH, das bei zukünftigen Medikamenteninterventionsstudien helfen wird, die sich auf die gezielte Bekämpfungvonblutverursachten Hirnverletzungen konzentrieren, anstatt einen Gefäßbruch von17,28 zuverhindern. Angesichts des schnellen Charakters des Krankheitseintritt, der der klinischen Situation ähnelt, bietet ein solcher Ansatz spannende Perspektiven für eine erfolgreiche Umsetzung in der Zukunft.
Einige Einschränkungen sind mit der Verwendung von Zebrafisch-Larven verbunden, wie die Verwendung eines sich entwickelnden Systems und taxonomischen Ranges, aber die praktischen und wissenschaftlichen Vorteile dieses Modells müssen berücksichtigt werden, um neue Einblicke in ICH zu bieten. Es ist keine Operation erforderlich, um eine Blutung zu initiieren oder zelluläre Prozesse über längere Zeit nach einer Verletzung zu überwachen. Die hohe Fruchtbarkeit von Zebrafisch-Paarungen erzeugt leicht zugängliche und große Probengrößen, und durch die schnelle Entwicklung der Larven wird die experimentelle Zeitachse im Vergleich zu den Nagetierstudien29,30 deutlich reduziert.
Derzeit sind diese Modelle geeignet, um die unmittelbare pathologische und immunologische Reaktion auf spontane ICH im Gehirn von lebenden intakten Tieren zu erklären. Möglicherweise kann dieses Modell für mittelhohe Durchsatzmedikamente für ICH-Therapien angepasst werden, egal ob präventiv oder recovery gefördert werden. Die in dieser Studie vorgestellten Post-ICH-Pathologien stellen daher eine alternative, sich ergänzende Plattform für die präklinische ICH-Forschung dar.

Die intrakerebrale Blutung (ICH) ist die schwerste Unterart des Schlaganfalls, der mit einem spontanen Bruch des Gehirns und einer Blutung in das Parenchyma einhergeht, das zu Hirnschäden, körperlicher Behinderung und oft Tod 1 führt. Trotz der hohen Sterblichkeits-und Morbiditätsrate, die mit ICH2 verbundenist, fehlt es immer noch an Verständnis für die zugrunde liegende Ätiologie und die Pathologie nach der Blutung. Daher gibt es keine spezifischen Behandlungen, um ICH zu verhindern oder die Ergebnisse der Patienten zu verbessern. Der größte Teil unseres Verständnisses von Krankheitsbiologie stammt aus präklinischen Nagetiermodellen desICH3, jedoch haben Studien in diesen Modellen bisher kein erfolgreiches therapeutisches Therapeutikum in die Klinik4,5übersetzt. Dieses Versagen kann zum Teil auf einige Einschränkungen dieser präklinischen Modelle zurückzuführen sein, einschließlich der Unfähigkeit, die spontane Natur der menschlichen Krankheit leicht zu rekapitulieren, und die Notwendigkeit einer invasiven Chirurgie, um die Modelle bei Säugetieren 6 zu erzeugen. Darüber hinaus stellen Nagetiere praktische Probleme bei der Beobachtung des schnellen Auftretens von zellulären Reaktionen auf ICH in intaktem Gewebe dar. Angesichts des Mangels an Übersetzungen durch Nagetiermodelle ist die Entwicklung alternativer Modelle des spontanen ICH unerlässlich, wenn wir diese praktischen Probleme überwinden und dabei helfen wollen, neue Drogenziele zu identifizieren.
Die molekularen Mechanismen der Gefäßentwicklung sind unter Wirbeltieren, darunter Zebrafische (Danio rerio)7, gut erhalten. Als solche wird die Annahme dieses Modellorganismus zu einer immer nützlicheren mechanistischen Strategie für die Untersuchung von zerebrovaskulären Erkrankungen 8. Es wurden eine Reihe von Zebrafisch-Modellen entwickelt, die Phenotypen rekapitulieren, die mit Schlaganfall-bedingten Zuständen9,10,11, 12 inVerbindung stehen. Der Einsatz von Zebrafisch-Larven zur Untersuchung von Krankheitserregern bietet sowohl praktische als auch wissenschaftliche Vorteile gegenüber Säugetiermodellen 8. Dazu gehören hohe Reproduktionsraten, eine rasante Entwicklung und eine Larventransparenz, die eine intravitale Bildgebung ohne die invasiven Einschränkungen von Nagetierenermöglicht. Die Kopplung dieser Vorteile mit der breiten Palette von transgenen Reporterlinien, die in der Zebrafisch-Forschunggemeinde zur Verfügung stehen, ist ein leistungsfähiger Ansatz in vivo , um die Krankheitsbiologie zu studieren, die noch nicht für die Untersuchung der pathologischen Folgen von ICH.
Die Verletzungsreaktion auf Blut im Gehirn ist biphasic 13; Die primäre Beleidigung verursacht neuronale Todesfälle und Zellnekrosen, die dann eine sekundäre Welle von Schäden auslösen, die durch angeborene Immunaktivierung ausgelöst wird. Die zweite Phase der Hirnverletzung, insbesondere die neuroinflammatorische Komponente, gilt als realistisches Ziel für die zukünftige medikamentöse Behandlung 13. In Zebrafisch-Larven wurden zuvorzuvor 14,15,16, 17, 18,19spontane und zerebartige Blutungen beschrieben. Zwei solcher Modelle sind der Einsatz von atorvastatin (ATV) bei 24 h Post-Befruchtung (hpf), um den HMGCR-Weg und die Cholesterin-Biosynthese14zu hemmen, und ein Blasenkopf (BBh) Mutant, das eine hypomorphe Mutation im Arhgef7 -Gen ausdrückt, Und hemmt in der Folge die Aktin-Umgestaltung für enge endovaskuläre Knotenpunkte18. Diese Modelle weisen bei Beginn der Zirkulation einen spontanen zerebral-spezifischen Blutgefäßbruch auf (~ 33 hpf). In jüngster Zeit haben wir diese Modelle weiter charakterisiert, um zu zeigen, dass Schlüsselaspekte der Gehirnverletzungsreaktion zwischen Menschen und Zebrafisch-Larven 20 konserviert werden. Diese Studie zeigt die Methodik, die erforderlich ist, um spontane Hirnblutungen in Zebrafisch-Larven zu erhalten und zu visualisieren und wie man Gehirnverletzungen quantifiziert, und Bewegungsstörungen und neuroentzündliche Phenotypen, die sich auf den menschlichen Zustand beziehen. Diese Daten und Techniken unterstützen den Einsatz dieser Modellart als wertvolles Komplementärsystem für die präklinische ICH-Forschung.

<table><tbody><tr><td>24-Well-Platten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527</td><td></td></tr><tr><td>28 &deg; C Inkubator</td><td>LMS</td><td>210</td><td></td></tr><tr><td>Atorvastatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PZ0001-5mg</td><td></td></tr><tr><td>Zuchtboxen</td><td>Thoren Aquatics systems</td><td>10011</td><td></td></tr><tr><td>Daniovision Beobachtungskammer</td><td>Noldus</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>E3 medium 1x</td><td></td><td></td><td>4% Instant Ocean, 500 &micro; L Methylenblau in 1 L dH2O</td></tr><tr><td>EthoVision XT Software</td><td>Noldus</td><td>Version 11</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>Grant-Bio</td><td>PHMT-PSC18</td><td></td></tr><tr><td>Instant ocean</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Lightsheet Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Z.1</td><td></td></tr><tr><td>Lightsheet Mikroskop Montage Kapillare</td><td>Zeiss</td><td>402100-9320-000</td><td></td></tr><tr><td>Low Melt Agarose</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr><tr><td>Methylenblau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319112-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop&nbsp;</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td>Dissektionsmikroskop</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td>M165FC</td><td>Fluoreszenzmikroskop</td></tr><tr><td>MS222</td><td></td><td></td><td>4 g Tricainpulver, 500 mL dH2O, 10 mL von 1 M Tris (pH 9). pH-Wert auf ~7</td></tr><tr><td>einstellen P1000 Pipette</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipettenspitzen</td><td>Starlab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipetten</td><td>Starlab</td><td>E1414-0300</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Corning</td><td>101VR20</td><td></td></tr><tr><td>Pipetboy</td><td>Integra Biosciences</td><td>PIPETBOY</td><td></td></tr><tr><td>Stripette 25ml</td><td>Corning</td><td>CLS3527</td><td></td></tr><tr><td>Tricain Pulver</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafeine Dissektionszange</td><td>Agar scientific</td><td>AGT502</td><td></td></tr><tr><td>Zen-Software</td><td>Zeiss</td><td>Version 2.3</td><td></td></tr></tbody></table>

verwendung von zebrafisch-lamellen, um die pathologischen folgen von hämorrhagischen stroke zu studieren

Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke

Obwohl es sich um die schwerste Subsorte des Schlaganfalls mit hoher globaler Sterblichkeit handelt, gibt es keine spezifische Behandlung für Patienten mit intrazerebraler Blutung (ICH). Die Modellierung von ICH vorklinisch hat sich als schwierig erwiesen, und aktuelle Nagetiermodelle haben die Spontane des menschlichen ICH schlecht rekapitulieren können. Daher ist es dringend erforderlich, alternative präklinische Methoden für die Untersuchung von Krankheitsmechanismen im ICH und für eine mögliche Arzneimittelentdeckung zu entwickeln.
Der Einsatz von Zebrafischen stellt einen immer beliebter werdenden Ansatz für die translationale Forschung dar, vor allem aufgrund einer Reihe von Vorteilen, die sie gegenüber Säugetiermodellen besitzen, einschließlich der fruchtbaren Reproduktionsraten und der Larventransparenz, die das Leben ermöglicht. Imaging. Andere Gruppen haben festgestellt, dass Zebrafisch-Larven nach genetischen oder chemischen Störungen der zerebrovaskulären Entwicklung spontane ICH ausweisen können. Ziel dieser Methodik ist es, mit solchen Modellen die pathologischen Folgen von Hirnblutungen im Rahmen der präklinischen ICH-Forschung zu untersuchen. Durch den Einsatz von Live-Bildgebungs-und Beweglichkeitsassays können Hirnschäden, Neuroentzündungen und Bewegungsapparate nach ICH bewertet und quantifiziert werden.
Diese Studie zeigt, dass die wichtigsten pathologischen Folgen der Hirnblutung beim Menschen in Zebrafisch-Larven konserviert werden, die den Modellorganismus als wertvolles In-vivo-System für die präklinische Untersuchung von ICH hervorheben. Ziel dieser Methodik ist es, die präklinische Schlaganfallgemeinschaft in die Lage zu versetzen, das Färbemodell für Zebrafische als alternatives komplementäres Modellsystem für Nagetiere einzusetzen.

Bewertung des Datentotodes von Gehirnzellen mit transgenen Ubiq:secAnnexinV-mVenus führt zu klaren, definitiven Anhäufungen von sterbenden Zellen in ICH + Larven sowohl in ATV als auch BBh-Modellen, die in allen ICH-Larven fehlen (Abbildung3). Cluster ziehen vor 96 hpf ab Durch die Bildanalyse wird Blutungen mit einer signifikanten zweifachen Zunahme der Gesamtintensität des Fluoreszenzsignals im Gehirn verbunden, was auf einen deutlichen Zelltod hinweist.
Eine neuroinflammatorische Reaktion wird in ICH + Larven durch eine signifikant erhöhte Anzahl von mpeg1 positiven Makrophagenzellen im Gehirn festgestellt. Auch die Zahl der insgesamt mpo positiven Neutrophilen, die statistische Bedeutung erlangt haben, hat sich nicht erhöht (Abbildung 4). Die Morphologie der mpeg1 positiven Makrophagen kann auch bei ICH + Larven gesehen werden, da die Zellen eine aktive, abgerundete, amoeboide Form annehmen. Diese aktivierten abgerundeten Zellen können auch im Laufe der Zeit überwacht werden, um eine erhöhte phagozytische Reaktion des Ubiq zuzeigen: secAnnexinV-mVenus, die sterbende Zellen in ICH + Larven ausdrückt (Abbildung 5). Die positiven Makrophagen, die ramifizierte Prozesse aufweisen, wurden als inaktiv eingestuft.
Die Gehirnblutung ist mit einem signifikanten Rückgang der Beweglichkeit bei 72 und 96 hpf im Vergleich zu ICH-Geschwisterkontrollen sowohl bei bbh als auch bei ATV-Modellen verbunden (Abbildung6). Die Beweglichkeit bei 120 hpf erholt sich in der Nähe der Basiswerte. Es gibt oft Unterschiede in der Basismotilität zwischen Eierkupplungen und Stämmen, und daher sollte man sich jedes Mal mit ICH-Kontrollen vergleichen.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig3.jpg"> Bild 3 : Intrakerebrale Blutungen (ICH) in Zebrafisch-Larven führen zu einer quantifizierbaren Hirnverletzung. (A) repräsentative Bilder des Hirnverletzungs-Phenotyps in ICH + Larven (rechte Tafeln), im Vergleich zu ICH-Geschwistern (linke Tafeln), bei 72 hpf. Brightfield-Bilder (Bodenplatten, Skalenbalken = 250 μm) zeigen das Vorhandensein von Hirnblutungen (Pfeile) in ICH + Larven. Die fluoreszierende Mikroskopie wurde durchgeführt, um den Zelltod in der Ubiq:secAnnexinV-mVenus Reporterlinie zu visualisieren (obere Panels, Skala bar = 100 μm). In den peri-Hämoatomalregionen wurden Cluster von sterbenden Zellen beobachtet. Die Bilder wurden in Gehirnregionen geschnitten und mit Hilfe des Makros in der ergänzendenDatei 1 auf die gesamte grüne Fluoreszenzintensität in runden Partikeln mit einem Durchmesser von mehr als 30 Pixeln (weiße Linie) analysiert. B) Quantifizierung des Fluoreszenzsignals in den Gehirnen von unbehandelten, ICH-und ICH + Larven, die durch das ATV-Modell (n = 12 pro Gruppe; 3 unabhängige Replikate) bei 72 hpf gewonnen werden. Beim Vergleich von ICH + mit unbehandelten Geschwistern (* * p = 0.004) und mit ICH-(* p = 0,03) wurden signifikante Unterschiede beobachtet. C) Quantifizierung des Fluoreszenzsignals als Auslesen für annexinV-Bindung in den Gehirnen von ICH-und ICH + Larven, die durch das Blasenkopf-Modell (bbh) (n = 12 pro Gruppe; 2 unabhängige Replikate) bei 72 hpf gewonnen werden. Graphen zeigen SD aus dem Mittelwert. Zwischen ICH + und ICH-Altersgruppe wurde ein signifikanter Unterschied in der MVenus-Fluoreszenz beobachtet (* * p = 0.002). Die Abbildung wurde von Crilly et al.20 mit Genehmigung unter einer Creative Commons-Lizenz reproduziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig4.jpg"> Bild 4 : Die intrakerebrale Blutung (ICH) initiiert eine angeborene zelluläre Immunantwort im Zarenfisch-Larvenhirn. Die Anzahl der Leukozyten, die in den zuvor beschriebenen Hirnregionen für mpo:GFP;mpeg1:dsRed doppelten transgenen Larven (n = 8 pro Gruppe; 2 unabhängige Replikate) bei 72 Hpf quantifiziert wurden, zeigt einen signifikanten Anstieg der Makrophagen (* p = 0,01), aber keine Neutrophilen (p = 0,5), als Reaktion auf ICH. Die Abbildung wurde von Crilly et al.20 mit Genehmigung unter einer Creative Commons-Lizenz reproduziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig5.jpg"> Bild 5 : Aktivierte Makrophage-Zellen zeigen eine phagozytische Reaktion auf die Gehirnlähmung. A) repräsentative Zeitraffer sind immernoch 20, die eine verzweigte, patrouillierte Makrophage zeigen, die in eine anämneV-positive Zelle (i-vi) abwandert. Stills werden aus einer Reihe von Bildern gewonnen, die vom ganzen Gehirn mit einem 20x-Ziel aufgenommen wurden. Die Skalierstange stellt 50 μm dar. Die Makrophage erwarb eine Amoeboid-Morphologie (v), bevor sie die annexinV-positive Zelle (vi, vii) phagocytosing. Nach der Phagozytose nimmt die Makrophage eine verzweigte Morphologie wieder auf und wandert weg und die annexfrisch-positive Zelle ist nicht mehr zu sehen (viii). Ramified macrophage (#), annexinV positive Zelle (Pfeil), Amoeboid-Makrophage (*) werden angezeigt. B) repräsentative Bilder von mpeg1-positiven Zellen im ICH-und ICH + Larvenhirn, die Amoeboid und verzweigte Morphologien aufweisen. (C) Ein erhöhter Anteil an Amoeboid (Phagozytic) und ein verminderter (inaktiver) Makrophagen wurden in ICH + Gehirnen im Vergleich zu ICH-Geschwistern beobachtet. Die Abbildung wurde von Crilly et al.20 mit Genehmigung unter einer Creative Commons-Lizenz reproduziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig6.jpg"> Bild 6 : Die durch ICH verursachte Hirnverletzung führt zu einem quantifizierbaren Bewegungsmangel bei Zebrafischlarven. A) repräsentative Beispiele für die Schwimmwege in ICH-und ICH + bbh-Larven bei 72, 96 und 120 hpf. (B) ICH + Larven wiesen einen signifikanten Rückgang der kumulierten Zeit auf, die während der 10-minütigen Aufzeichnungszeit bei 72 und 96 hpf für mobile Zeit ausgegeben wurde. Am 120. Z-P-P-Takt verlor sich an Bedeutung, die möglicherweise auf die Genesung von Hirnverletzungen anfällt (n = 24 Larven pro Gruppe; 3 unabhängige Replikate; * * * p = 0.00006; * * p = 0.003; ns: p = 0,08). C) Quantifizierung der kumulierten Zeit, die im Umzug in unbehandelten und ATV-behandelten ICH-und ICH +-Larven auf 120 hpf verbracht wird. ICH + Larven wiesen einen signifikanten Rückgang der kumulierten Zeit auf, die während der 10-minütigen Aufzeichnungszeit für mobile mobile Zeiten ausgegeben wurde. Drei technische Replikate (n = 24 Larven pro Gruppe) wurden verwendet, um SD aus dem Mittelwert zu berechnen (* * * p = 0.00004, * * p = 0.0003). Die Abbildung wurde von Crilly et al.20 mit Genehmigung unter einer Creative Commons-Lizenz reproduziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 
Zusatzdatei 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/Supplementary_File_1-Macro.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Hier stellen wir ein Protokoll zur Quantifizierung von Hirnverletzungen, Bewegungsdefiziten und Neuroentzündungen nach Blutungen im Gehirn in Zebrafisch-Larven vor, im Zusammenhang mit der menschlichen intrazerebralen Blutung (ICH).

Verwendung von Zebrafisch-Lamellen, um die pathologischen Folgen von hämorrhagischen Stroke zu studieren

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage ...

Diese Methode bietet einen kostenlosen präklinischen Ansatz für die Untersuchung der unmittelbaren zellulären Reaktion auf Blut im Gehirn nach einem hämorrhagischen Schlaganfall, eine sehr ernste Erkrankung, für die wir keine spezifischen Medikamente für Patienten zur Verfügung haben. Im Gegensatz zu Nagetiermodellen ermöglicht uns die Transparenz von Zebrafischlarven, zelluläre Reaktionen im Gehirn lebender intakter Tiere in Echtzeit mithilfe der fluoreszierenden Mikroskopie zu beobachten. Verwenden Sie zunächst ein Teesieb, um alle befruchteten Embryonen aus dem natürlichen Laichen in Zuchtboxen zu sammeln, die von einem männlichen und einem bis zwei weiblichen erwachsenen Zebrafischen hergestellt werden.Übertragen Sie 100 Embryonen auf jede Petrischale, die das Standard-E3-Embryomedium enthält. Inkubieren bei 28 Grad Celsius und Stufe nach Standard-Richtlinien. Nach sechs Stunden nach der Befruchtung tote und unbefruchtete Embryonen mit einer Pasteur-Pipette aus der Schale entfernen und das Geschirr wieder in den Brutkasten geben.Nach der Befruchtung 24 Stunden nach der Befruchtung verwenden Sie unter einem hellfeldigen Stereomikroskop scharfe ultradünne Sezierzangen, um Embryonen für die Atorvastatin-Behandlung zu dekoorizieren. Dann fügen Sie 30 Milliliter E3 Embryo Medium zu zwei sauberen Petri-Schalen, eine für die Behandlung und die andere für die Kontrolle. Entfernen Sie 60 Mikroliter Embryowasser aus der Behandlungsschale und fügen Sie 60 Mikroliter 0,5 Millimolar Atorvastatin hinzu, um 80 % der blutüberstten Larven zu erreichen.Mit einer Pasteur-Pipette 100 Embryonen in so wenig Wasser wie möglich auf jede Schale übertragen. Die beiden Gerichte bei 28 Grad Celsius bebrüten. Nach 50 Stunden nach der Befruchtung verwenden Sie unter dem Mikroskop eine Pasteur-Pipette, um bluterwerdende Fische sorgfältig von nicht blutrünstigen Populationen zu trennen und die Larven auf neue Gerichte mit frischen E3-Medien zu übertragen.Um es einfacher zu machen, Blutungen positive Larven zu trennen, könnten Sie Fische ohne Pigment oder Fische verwenden, die fluoreszierendes Protein in roten Blutkörperchen ausdrücken. Am dritten Tag, unter einem fluoreszierenden Mikroskop Bildschirm die Larven, um die Expression von fluoreszierendem Protein zu gewährleisten. Dann füllen Sie die Lichtbogen-Montagekammer mit E3-Medien, die 0,2%MS-222 zur Anästhesisierung enthalten.Mit einer Pasteur-Pipette ein einzelnes Tröpfchen mit ein bis sechs Larven zur Montage auf eine trockene Petrischalenoberfläche übertragen. Verwenden Sie eine Pipette, um so viel Flüssigkeit wie möglich zu entfernen. Fügen Sie einen Tropfen von 1,5% niedrige Schmelze Agarose aus dem 45 Grad Celsius Wärmeblock zu den Larven und verwenden Sie eine 800 Mikrometer Montage Kapillare, um die Larven Nachoben Kopf zuerst zu ziehen.Wenn die Positionierung nicht korrekt ist, vertreiben Sie die Larven aus der Agarose und montieren Sie sie wieder. Lassen Sie die Kapillare abkühlen und legen Sie sie dann in die Lichtbogenkammer ein. Drücken Sie auf die ZEN-Bildgebungssoftware kontinuierlich, um die Larven zu orientieren, und erfassen Sie z-stack-Bilder des Kopfes zwischen den Augenlinsen.Generieren Sie auf der Registerkarte Verarbeitung aus jedem Z-Stack ein Projektionsbild mit maximaler Intensität. Um nach dem Zufallsprinzip für motility assay auszuwählen, übertragen Sie 24 Larven nach der Anästhesie in frische E3-Medien und lassen Sie die Tiere sich von der Anästhesie erholen. Nachdem sich die Larven vollständig von der Anästhesie erholt haben, mit einer Pipette mit dem Endschnitt transferiert wiedergewonnene Larven in E3 Medium ohne Methylenblau.Platte eine Larve in einem Milliliter pro Brunnen einer 24 Brunnenplatte. Laden Sie die Platte in die Kamerakammer. Passen Sie in der EthoVision XT-Tracking-Software die Experimenteinstellungen an, um eine weiße Licht-Erschreckt-Routine einzurichten, um die spontane Schwimm- und Assay-Bewegung für 10 Minuten zu erhöhen.Wiederholen Sie den Bewegungstest bei 96 und 120 Stunden nach dem Fertilizatin. Die Beurteilung des Hirnzelltodes unter Verwendung einer transgenen Ubiquitin-Sekretion Annexin V M venöse Reporterlinie führt zu eindeutigen Clustern sterbender Zellen in blutüberstten Larven, die in allen nicht blutüberstten Larven fehlen, die durch grüne Fluoreszenz angezeigt werden. Sterbende Zellen wurden sowohl in Atorvastatin als auch in Blasenkopfmodellen für blutüberlegte Larven beobachtet.Die Morphologie der MPEG1-positiven Makrophagen ändert sich in intrazerebralen Blutungen, positive Larven, wenn die Zellen in aktiver abgerundeter Amoemoemoide-Form annehmen. Diese aktivierten abgerundeten Zellen wurden im Laufe der Zeit überwacht, um eine erhöhte phagozytische Reaktion des ubiquitin sezerzierten Annexin V M venös entrisierend sterbenden Zellen in intrachrraren Blutungen positive Larven zu zeigen. Hirnblutungen sind mit einer signifikanten Verringerung der Beweglichkeit bei 72 und 96 Stunden nach der Befruchtung im Vergleich zu intrazerebralen Blutungen negative Geschwisterkontrollen verbunden.Die Beweglichkeit nach 120 Stunden nach der Befruchtung erholt sich auf ein Nahelandniveau. Der wichtigste Aspekt dieses Verfahrens ist es, die Larven gründlich auf das Vorhandensein oder Fehlen von Hirnblutungen zu untersuchen, bevor Sie zu den Phänotypisierungstests übergehen. Dieses Modell kann auch für das Arzneimittelscreening verwendet werden, um festzustellen, ob die Schwere des Phänotyps nach einer Blutung verbessert werden kann, ein Ansatz, der uns dazu bringen kann, neue Arzneimittelkandidaten in der Zukunft zu identifizieren.Diese Technik ermöglicht es uns, die zellulären Reaktionen unmittelbar nach einer Blutung im Gehirn während eines Zeitpunkts zu erforschen, der bisher so notorisch schwierig zu studieren war. Obwohl keines der in diesem Protokoll beschriebenen Reagenzien oder Instrumente besonders gefährlich ist, müssen bei der Verwendung von Chemikalien, Scharfen oder Lasern überall Standardsorgfalt und Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Untersuchung von Hirnverletzungen von Zebrafischlarven mit Hilfe der groß angelegten Rastertransmissionselektronenmikroskopie (STEM), einer Technik, die Elemente der Rasterelektronenmikroskopie (REM) und der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) kombiniert, um hochauflösende Bilder zu erzeugen. Es beschreibt die Schritte bei der Vorbereitung von Proben und der Aufnahme von hochauflösenden MINT-Bildern zur Identifizierung von Hirnverletzungen.

Untersuchung einer Hirnverletzung einer Zebrafischlarve mit großflächiger Rastertransmissionselektronenmikroskopie

In diesem Video werden befruchtete Zebrafischembryonen unter einem Stereomikroskop dechorioniert und dann einem Cholesterinsynthesehemmer ausgesetzt, was zur Entwicklung von Blutgefäßrissen und Hirnblutungen in den Larven führt. Hämorrhagische Larven, die an deutlichen roten Flecken zu erkennen sind, werden anschließend zur weiteren Analyse unter einem Mikroskop getrennt.

Modellierung der medikamenteninduzierten Blutung in Zebrafischlarven

Imaging von zerebrovaskulären Entwicklung in Zebrafisch-Larven beschrieben. Techniken zur 3D-Bildgebung zu erleichtern und zu ändern zerebrovaskuläre Entwicklung mit chemischen Behandlungen sind ebenfalls vorhanden.

Imaging und 3D-Rekonstruktion der zerebrovaskuläre Strukturen in embryonalen Zebrafisch

Um die zellulären und molekularen Mechanismen der Neurogenese und Regeneration adulter Zebrafische zu beleuchten, haben wir ein Protokoll für invasive Operationen entwickelt, die mechanische Verletzungen im adulten Telencephalon des Zebrafisches verursachen, und die anschließende Überwachung von Veränderungen in der gestochenen Hemisphäre durch Immunhistochemie oder in situ Hybridisierung.

Stichwunde Verletzung des Zebrafisch Erwachsene Telen: eine Methode, um Wirbel Gehirn Neurogenese und Regeneration Untersuchen

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Erzeugung einer mechanischen Gefäßverletzung in Zebrafischembryonen. Dieses Verletzungsmodell bietet eine Plattform für die Untersuchung von Blutstillung, verletzungsbedingten Entzündungen und Wundheilung in einem Organismus, der sich ideal für die Echtzeitmikroskopie eignet.

Mechanische Gefäßverletzung in Zebrafischembryonen

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese, Charakterisierung und Injektion von Monomeren Amyloid-β42 Peptide zur Erzeugung von Amyloid Toxizität in Erwachsenen Zebrafisch, eine Alzheimer-Krankheitsmodell, gefolgt von histologische Analyse und Erkennung von Aggregationen.

Modellierung von Amyloid-β42 Toxizität und Neurodegeneration bei Erwachsenen Zebrafisch-Gehirn

Hier stellen wir eine Methode vor, um das embryonale Gehirn des Zebrafischs in vivo bis hin zu Larven- und Juvenilenstadien abbilden zu können. Dieses mikroinvasive Verfahren, das von elektrophysiologischen Ansätzen adaptiert wurde, bietet Zugang zu zellulären und subzellulären Details reifer Neuronen und kann mit optogenetischen und neuropharmakologischen Studien zur Charakterisierung der Gehirnfunktion und der medikamentösen Intervention kombiniert werden.

In vivo Bildgebung von vollaktivem Hirngewebe bei wachen Zebrafischlarven und Jungtieren durch Schädel- und Hautentfernung

Wir modifizierten das Marmarou-Gewichtsabfallmodell für erwachsene Zebrafische, um eine Breite von Pathologien nach stumpfer traumatischer Hirnverletzung (TBI) und die Mechanismen, die der nachfolgenden neuronalen Regeneration zugrunde liegen, zu untersuchen. Dieses stumpfe TBI-Modell ist skalierbar, induziert ein leichtes, mittelschweres oder schweres SHT und rekapituliert die bei menschlichen TBI beobachtete Verletzungsheterogenität.

Ein skalierbares Modell zur Untersuchung der Auswirkungen von Stumpfkraftverletzungen bei erwachsenen Zebrafischen

Ein mechanisches Hirnverletzungsmodell im erwachsenen Zebrafisch wird beschrieben, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die ihre hohe Regenerationsfähigkeit regulieren. Die Methode erklärt, wie eine Stichwundenverletzung im optischen Tectum mehrerer Arten kleiner Fische erzeugt wird, um die regenerativen Reaktionen mittels fluoreszierender Immunfärbung zu bewerten.

Stichwundenverletzungsmodell des adulten optischen Tektums unter Verwendung von Zebrafisch und Medaka zur vergleichenden Analyse der Regenerationsfähigkeit

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Induktion gewebespezifischer und hochreproduzierbarer Verletzungen in Zebrafischlarven unter Verwendung eines Laserläsionssystems in Kombination mit einer automatisierten mikrofluidischen Plattform für die Larvenhandhabung.

Kontrollierte halbautomatische laserinduzierte Verletzungen zur Untersuchung der Rückenmarksregeneration bei Zebrafischlarven

Das vorliegende Protokoll beschreibt die intrazerebroventrikuläre (ICV) Injektion von adulten Zebrafischen mit neurotoxischem 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) am ventralen Zwischenhirn (Dn) und die Beurteilung der Beeinträchtigung und anschließenden Wiederherstellung der Nachbehandlung des Schwimmverhaltens unter Verwendung des offenen Tanktests, der von einer Analyse mit einer Video-Tracking-Software begleitet wird.

Lokomotorische Bewertung des 6-Hydroxydopamin-induzierten adulten Zebrafisch-basierten Parkinson-Modells

Erfahren Sie, wie Sie mit Zebrafisch-Larven die zellulären Reaktionen auf hämorrhagischen Schlaganfall in Echtzeit untersuchen. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Hirnverletzungen, Bewegungsdefiziten und Neuroinflammation.

Verwendung von Zebrafisch-Lamellen, um die pathologischen Folgen von hämorrhagischen Stroke zu studieren

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