Verwendung von Zebrafisch-Lamellen, um die pathologischen Folgen von hämorrhagischen Stroke zu studieren
June 5th, 2019
Hier stellen wir ein Protokoll zur Quantifizierung von Hirnverletzungen, Bewegungsdefiziten und Neuroentzündungen nach Blutungen im Gehirn in Zebrafisch-Larven vor, im Zusammenhang mit der menschlichen intrazerebralen Blutung (ICH).
Diese Methode bietet einen kostenlosen präklinischen Ansatz für die Untersuchung der unmittelbaren zellulären Reaktion auf Blut im Gehirn nach einem hämorrhagischen Schlaganfall, eine sehr ernste Erkrankung, für die wir keine spezifischen Medikamente für Patienten zur Verfügung haben. Im Gegensatz zu Nagetiermodellen ermöglicht uns die Transparenz von Zebrafischlarven, zelluläre Reaktionen im Gehirn lebender intakter Tiere in Echtzeit mithilfe der fluoreszierenden Mikroskopie zu beobachten. Verwenden Sie zunächst ein Teesieb, um alle befruchteten Embryonen aus dem natürlichen Laichen in Zuchtboxen zu sammeln, die von einem männlichen und einem bis zwei weiblichen erwachsenen Zebrafischen hergestellt werden.
Übertragen Sie 100 Embryonen auf jede Petrischale, die das Standard-E3-Embryomedium enthält. Inkubieren bei 28 Grad Celsius und Stufe nach Standard-Richtlinien. Nach sechs Stunden nach der Befruchtung tote und unbefruchtete Embryonen mit einer Pasteur-Pipette aus der Schale entfernen und das Geschirr wieder in den Brutkasten geben.
Nach der Befruchtung 24 Stunden nach der Befruchtung verwenden Sie unter einem hellfeldigen Stereomikroskop scharfe ultradünne Sezierzangen, um Embryonen für die Atorvastatin-Behandlung zu dekoorizieren. Dann fügen Sie 30 Milliliter E3 Embryo Medium zu zwei sauberen Petri-Schalen, eine für die Behandlung und die andere für die Kontrolle. Entfernen Sie 60 Mikroliter Embryowasser aus der Behandlungsschale und fügen Sie 60 Mikroliter 0,5 Millimolar Atorvastatin hinzu, um 80 % der blutüberstten Larven zu erreichen.
Mit einer Pasteur-Pipette 100 Embryonen in so wenig Wasser wie möglich auf jede Schale übertragen. Die beiden Gerichte bei 28 Grad Celsius bebrüten. Nach 50 Stunden nach der Befruchtung verwenden Sie unter dem Mikroskop eine Pasteur-Pipette, um bluterwerdende Fische sorgfältig von nicht blutrünstigen Populationen zu trennen und die Larven auf neue Gerichte mit frischen E3-Medien zu übertragen.
Um es einfacher zu machen, Blutungen positive Larven zu trennen, könnten Sie Fische ohne Pigment oder Fische verwenden, die fluoreszierendes Protein in roten Blutkörperchen ausdrücken. Am dritten Tag, unter einem fluoreszierenden Mikroskop Bildschirm die Larven, um die Expression von fluoreszierendem Protein zu gewährleisten. Dann füllen Sie die Lichtbogen-Montagekammer mit E3-Medien, die 0,2%MS-222 zur Anästhesisierung enthalten.
Mit einer Pasteur-Pipette ein einzelnes Tröpfchen mit ein bis sechs Larven zur Montage auf eine trockene Petrischalenoberfläche übertragen. Verwenden Sie eine Pipette, um so viel Flüssigkeit wie möglich zu entfernen. Fügen Sie einen Tropfen von 1,5% niedrige Schmelze Agarose aus dem 45 Grad Celsius Wärmeblock zu den Larven und verwenden Sie eine 800 Mikrometer Montage Kapillare, um die Larven Nachoben Kopf zuerst zu ziehen.
Wenn die Positionierung nicht korrekt ist, vertreiben Sie die Larven aus der Agarose und montieren Sie sie wieder. Lassen Sie die Kapillare abkühlen und legen Sie sie dann in die Lichtbogenkammer ein. Drücken Sie auf die ZEN-Bildgebungssoftware kontinuierlich, um die Larven zu orientieren, und erfassen Sie z-stack-Bilder des Kopfes zwischen den Augenlinsen.
Generieren Sie auf der Registerkarte Verarbeitung aus jedem Z-Stack ein Projektionsbild mit maximaler Intensität. Um nach dem Zufallsprinzip für motility assay auszuwählen, übertragen Sie 24 Larven nach der Anästhesie in frische E3-Medien und lassen Sie die Tiere sich von der Anästhesie erholen. Nachdem sich die Larven vollständig von der Anästhesie erholt haben, mit einer Pipette mit dem Endschnitt transferiert wiedergewonnene Larven in E3 Medium ohne Methylenblau.
Platte eine Larve in einem Milliliter pro Brunnen einer 24 Brunnenplatte. Laden Sie die Platte in die Kamerakammer. Passen Sie in der EthoVision XT-Tracking-Software die Experimenteinstellungen an, um eine weiße Licht-Erschreckt-Routine einzurichten, um die spontane Schwimm- und Assay-Bewegung für 10 Minuten zu erhöhen.
Wiederholen Sie den Bewegungstest bei 96 und 120 Stunden nach dem Fertilizatin. Die Beurteilung des Hirnzelltodes unter Verwendung einer transgenen Ubiquitin-Sekretion Annexin V M venöse Reporterlinie führt zu eindeutigen Clustern sterbender Zellen in blutüberstten Larven, die in allen nicht blutüberstten Larven fehlen, die durch grüne Fluoreszenz angezeigt werden. Sterbende Zellen wurden sowohl in Atorvastatin als auch in Blasenkopfmodellen für blutüberlegte Larven beobachtet.
Die Morphologie der MPEG1-positiven Makrophagen ändert sich in intrazerebralen Blutungen, positive Larven, wenn die Zellen in aktiver abgerundeter Amoemoemoide-Form annehmen. Diese aktivierten abgerundeten Zellen wurden im Laufe der Zeit überwacht, um eine erhöhte phagozytische Reaktion des ubiquitin sezerzierten Annexin V M venös entrisierend sterbenden Zellen in intrachrraren Blutungen positive Larven zu zeigen. Hirnblutungen sind mit einer signifikanten Verringerung der Beweglichkeit bei 72 und 96 Stunden nach der Befruchtung im Vergleich zu intrazerebralen Blutungen negative Geschwisterkontrollen verbunden.
Die Beweglichkeit nach 120 Stunden nach der Befruchtung erholt sich auf ein Nahelandniveau. Der wichtigste Aspekt dieses Verfahrens ist es, die Larven gründlich auf das Vorhandensein oder Fehlen von Hirnblutungen zu untersuchen, bevor Sie zu den Phänotypisierungstests übergehen. Dieses Modell kann auch für das Arzneimittelscreening verwendet werden, um festzustellen, ob die Schwere des Phänotyps nach einer Blutung verbessert werden kann, ein Ansatz, der uns dazu bringen kann, neue Arzneimittelkandidaten in der Zukunft zu identifizieren.
Diese Technik ermöglicht es uns, die zellulären Reaktionen unmittelbar nach einer Blutung im Gehirn während eines Zeitpunkts zu erforschen, der bisher so notorisch schwierig zu studieren war. Obwohl keines der in diesem Protokoll beschriebenen Reagenzien oder Instrumente besonders gefährlich ist, müssen bei der Verwendung von Chemikalien, Scharfen oder Lasern überall Standardsorgfalt und Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden.
Überblick
Diese Studie präsentiert ein Protokoll zur Quantifizierung von Hirnverletzungen, lokomotorischen Defiziten und Neuroinflammation bei Zebrafischlarven nach intracerebraler Blutung (ICH), einer kritischen menschlichen Erkrankung. Die Nutzung der Transparenz von Zebrafischlarven ermöglicht die Echtzeit-Beobachtung zellulärer Reaktionen in einem lebenden Hirnmodell nach hämorrhagischem Schlaganfall.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Neuroinflammation
- Wiedererlangung nach Schlaganfall
Hintergrund
- Intracerebrale Blutung (ICH) ist eine ernste medizinische Erkrankung, der spezifische Behandlungen fehlen.
- Zebrafischlarven dienen als innovatives Modell zur Untersuchung von Hirnreaktionen aufgrund ihrer Transparenz.
- Echtzeit-Bildgebung liefert Einblicke in die zelluläre Dynamik nach Hirnverletzung.
- Die Studie verwendet fluoreszierende Mikroskopie, um Neuroinflammation und andere zelluläre Reaktionen im Gehirn zu beurteilen.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines präklinischen Modells zur Untersuchung der zellulären Reaktion auf hämorrhagischen Schlaganfall.
- Untersuchung der Auswirkungen von ICH auf die Lokomotion und Neuroinflammation.
- Erforschung potenzieller Wirkstoffkandidaten zur Minderung der Auswirkungen von ICH.
Verwendete Methoden
- Die Hauptplattform ist die fluoreszierende Mikroskopie zur Bildgebung zellulärer Reaktionen.
- Zebrafischlarven sind das biologische Modell, mit Fokus auf Hirnverletzung durch induzierte Blutung.
- Wichtige Zeitpläne beinhalten Embryo-Sammeln, Behandlungsanwendung und anschließende Bildgebung zu bestimmten Stunden nach der Befruchtung.
- Kritische Phasen umfassen die Überwachung der Motilität und die Bewertung der Neuroinflammations-Reaktionen über mehrere Tage.
Hauptergebnisse
- Es wurden signifikante zelluläre Reaktionen beobachtet, einschließlich Cluster von sterbenden Zellen in blutenden Larven.
- Eine Abnahme der Motilität wurde nach der Blutung festgestellt, mit teilweiser Erholung nach 120 Stunden.
- Aktivierte Makrophagen zeigten morphologische Veränderungen, die mit der ICH-Reaktion assoziiert sind.
- Dieses Modell ermöglicht die Bewertung potenzieller therapeutischer Interventionen für Schlaganfall.
Schlussfolgerungen
- Diese Forschung etabliert ein Zebrafisch-Modell zur Untersuchung von ICH und deren zellulären Auswirkungen.
- Der Ansatz kann Wirkstoff-Screening-Bemühungen zur Verbesserung der Ergebnisse nach Hirnblutung erleichtern.
- Insgesamt fördert es das Verständnis der zellulären Dynamik nach Hirnverletzung und potenzieller Wiederherstellungsmechanismen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Zebrafish larval models address a critical gap in hemorrhagic stroke research by enabling real-time visualization of cellular responses to intracerebral hemorrhage, a process difficult to capture in opaque mammalian systems. This approach supports early target validation and mechanistic de-risking by quantifying neuroinflammation, cell death, and functional deficits in a disease-relevant in vivo system. The model’s compatibility with live imaging and motility assays provides predictive confidence for screening therapeutic candidates aimed at mitigating hemorrhage-induced pathology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing immediate cellular responses to blood in the brain, supporting target validation in hemorrhagic stroke pathways.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking through conserved pathological phenotypes such as dying cell clusters and macrophage activation, which mirror human ICH responses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative readouts of locomotor dysfunction and neuroinflammation, enabling reliable compound evaluation in phenotypic screening.
- Operational Value: Supports assay reproducibility and scalability via staged larval populations and automated tracking (e.g., EthoVision XT), enhancing throughput for lead identification.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates translational continuity by recapitulating key ICH consequences—neuroinflammation, cell death, and motor deficits—enabling preclinical validation of mechanism-based interventions.
- Operational Value: Allows longitudinal assessment from 72 to 120 hours post-fertilization, supporting risk-adjusted advancement decisions based on phenotypic recovery or persistence.
Pipeline & Workflow Integration
The zebrafish larval ICH model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, offering a bridge between mechanistic insight and preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time imaging of Annexin V-positive dying cells and MPEG1 macrophage morphological shifts following hemorrhage.
- Screening: Delivers assay readiness through quantifiable motility assays at 96 and 120 hpf, providing scalable, reproducible behavioral endpoints for compound screening.
- Analytics: Yields measurable outputs including fluorescence intensity of cell death reporters, macrophage morphology changes, and locomotion tracking data, enabling comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by modeling conserved human ICH pathologies, supporting biomarker-aligned target engagement studies.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for mechanistic screening and target de-risking across multiple therapeutic modalities due to its non-terminal, quantifiable readouts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct observation of hemorrhage-induced neuroinflammation and cell death.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via defined staging (e.g., 24 hpf decoronation, Atorvastatin treatment) and blinded hemorrhage sorting before phenotypic assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early efficacy signals in a disease-relevant system, reducing late-stage biological risk in stroke drug development.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that improve hemorrhage phenotypes, informing advancement based on functional recovery and cellular rescue.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, embryonic staging, and fluorescent microscopy for live imaging.
- Dependent on instrumentation including light sheet or fluorescence microscopes, agarose mounting systems, and automated behavior tracking tools (e.g., EthoVision XT).
- Necessitates cross-team standardization in hemorrhage scoring and larval separation to ensure phenotypic assay validity.
- Involves adaptation considerations for pigment-free or transgenic reporter lines to enhance hemorrhage detection and signal clarity.
- Limited by larval size and throughput constraints compared to higher vertebrates, though offset by rapid generation times and optical accessibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
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Title
0:35
Day 0: Egg Production and Collection
1:11
Day 1 - 2: Atorvastatin Treatment and ICH- and ICH+ Populations Separation
2:22
Day 3 - 5: Cell Death, Leukocyte Analysis and Motility Assay
4:24
Results: Intracerebral Hemorrhage (ICH) in Zebrafish Larvae
5:39
Conclusion
