Messung der BK-Polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Summary

In diesem Manuskript wird ein Protokoll zur FACS-basierten Messung der Transkriptionsaktivität des BK-Polyomavirus unter Verwendung von HEK293T-Zellen vorgestellt, die mit einem bidirektionalen Reporter-Plasmid transfiziert werden, das tdTomato und eGFP exzessiiert. Diese Methode ermöglicht es ferner, den Einfluss neuartiger Verbindungen auf die virale Transkription quantitativ zu bestimmen.

Abstract

Polyomaviren, wie das BK-Polyomavirus (BKPyV), können schwere Pathologien bei immungeschwächten Patienten verursachen. Da jedoch derzeit keine hochwirksamen antiviralen Mittel verfügbar sind, sind Methoden erforderlich, die die Wirkung potenzieller antiviraler Wirkstoffe messen. Hier wurde ein Dual-Fluoreszenz-Reporter konstruiert, der die Analyse der BKPyV-Nicht-Kodierungs-Kontrollregion (NCCR) ermöglicht, die früh und spät epromoternde Aktivität angetrieben hat, um die Auswirkungen potenzieller antiviraler Medikamente auf die virale Genexpression über tdTomato und eGFP zu quantifizieren. ausdruck. Darüber hinaus können durch das Klonen von BKPyV-NCCR-Amplonikern, die in diesem Protokoll exemplarisch aus der blutabgeleiteten DNA immungeschwächter renaltransplantierter Patienten gewonnen wurden, die Auswirkungen von NCCR-Umlagerungen auf die virale Genexpression bestimmt werden. Nach dem Klonen der vom Patienten abgeleiteten Amplika wurden HEK293T-Zellen mit den Reporter-Plasmiden transfiziert und mit potenziellen antiviralen Wirkstoffen behandelt. Anschließend wurden die Zellen einer FACS-Analyse unterzogen, um die mittleren Fluoreszenzintensitäten 72 h nach der Transfektion zu messen. Um auch die Analyse von Medikamenten zu testen, die eine potentielle zellzyklushemmende Wirkung haben, werden nur transfizierte und damit fluoreszierende Zellen verwendet. Da dieser Test in großen T-Antigen-Expressionszellen durchgeführt wird, können die Auswirkungen der frühen und späten Expression auf gegenseitig unabhängige Weise analysiert werden.

Introduction

Polyomaviren stellen eine unabhängige Familie kleiner doppelsträngiger DNA-Viren (dsDNA) dar, wobei das Simian-Virus 40 (SV40) als Prototypart existiert. Die primäre Infektion tritt vor allem während der Kindheit, die in der Regel ohne Krankheitssymptome und in der Regel latente Infektionen bei immunkompetenten Wirten verursachen. Das BK-Polyomavirus (BKPyV) bleibt hauptsächlich in Nierentubulizellen ohne Nephropathologien fort, kann jedoch im Falle einer Beeinträchtigung der Immunkompetenz nach einer Nierentransplantation reaktivieren und schwere Schäden und beeinträchtigte Transplantate verursachen. bei Erreichen einer hohen Virämie (1 x 10⁴ BKPyV DNA-Kopien/ml)^1,2. Bei etwa 10% der Nierentransplantationsempfänger führt die Reaktivierung des BK-Polyomavirus (BKPyV) zu einer Polyomavirus-assoziierten Nephropathie (PyVAN), die mit einem hohen Risiko für Renal-Allograft-Ausfällen verbunden war^3,4 . Da keine zugelassenen antiviralen Wirkstoffe verfügbar sind, basiert die aktuelle Therapie auf der Reduktion der Immunsuppression. Interessanterweise scheinen mTOR-Hemmer eine antivirale Wirkung zu haben; Daher könnte die Umstellung der immunsuppressiven Therapie auf mTOR-basierte Immunsuppression einen alternativen Ansatz darstellen, um das Fortschreiten der BKPyV-Virämie^5,6,7zu verhindern. Der mTOR-basierte antivirale Mechanismus ist derzeit jedoch noch nicht vollständig verstanden. Daher sind Methoden zur Messung der Wirkung potenzieller antiviraler Wirkstoffe in klinisch relevanten Konzentrationen erforderlich.

Das kreisförmige Genom des BKPyV besteht aus ca. 5 kb, die eine nicht-kodierende Kontrollregion (NCCR) beherbergen, die als Ursprung der Replikation dient und gleichzeitig als bidirektionaler Promotor, der die Expression von mRNA-Transkripten der frühen und späten Phase antreibt. Da spontan auftretende NCCR-Umlagerungen, Deletionen und Duplizierungen bei pathogenen BKPyV⁸ gefunden und bei Patienten mit PVAN^5,9signifikant angesammelt werden, wird ein Vergleich von archetypischen (wt) und neu arrangierte (rr) NCCR-Aktivitäten sind hilfreich, um virale reproduziertive Fitness zu charakterisieren.

Wie in Abbildung 1zusammengefasst, beschreibt dieses Protokoll eine häufig verwendete Methode zur Messung der BKPyV NCCR-Transkriptionsaktivität durch Quantifizierung der Fluoreszenz von zwei Fluorophoren tdTomato und eGFP, ausgedrückt aus einem Reporterplasmid^{5, 9,10,11}. Das Verfahren wird in Gegenwart des SV40 large T Antigens (lTAg) durchgeführt, das es ermöglicht, die Auswirkungen potenzieller antiviraler Wirkstoffe auf die frühe und späte NCCR-Aktivität separat zu analysieren⁵. Dieser Assay analysiert weiter die Auswirkungen von Umlagerungen auf die NCCR-Aktivität und vergleicht mit wt-NCCRs^5,9. Das Reporter-Plasmid enthält das SV40-Spätpolyadenylierungssignal nach jedem offenen Leserahmen des Fluorophors, um eine vergleichbare und effiziente Verarbeitung beider Transkripte für tdTomato bzw. eGFP zu gewährleisten. Im Vergleich zu den qRT-PCR-basierten Methoden^5,12stellt dieser FACS-basierte Ansatz eine kostengünstige und hohe Durchsatz-kompatible Alternative dar, da keine komplizierten Extraktionsprotokolle für infizierte Zellkultur und keine teuren Antikörper für Immunfluoreszenzfärbung sind erforderlich. Da darüber hinaus eine definierte Menge an fluoreszierenden Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert wird, ist die Analyse von Zellzyklushemmungsmitteln auch quantitativ möglich.

Protocol

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Humanforschung, die vom Ethikausschuss der Medizinischen Fakultät der Universität Duisburg-Essen (14-6028-BO) gebilligt wurden.

1. Entnahme von Blut- oder Urinproben und Isolierung der Polyomavirus-DNA

1. Sammeln Sie mindestens 3 ml Blut in EDTA-Röhrchen oder Urin in Anschaffungsröhrchen.
2. Zentrifugieren Sie die Probe bei 2.500 x g für 15 min. Bei Bedarf Pipettenplasma in eine neue Röhre geben und die Plasmaproben mehrere Tage bei 4 °C lagern oder bei -20 °C für eine längere Lagerung einfrieren.
3. Bereiten Sie 40 l Proteinase K in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr vor und fügen Sie 400 l Plasma durch Pipettieren hinzu.
4. Lyse die Probe durch Zugabe von 400 l Lysepuffer, Wirbel für 15 s, und inkubieren für 10 min bei 56 °C.
5. Isolieren Sie die DNA mit einem DNA-Blutextraktionskit, wie in den Anweisungen des Herstellers beschrieben. Kurz gesagt, fügen Sie Alkohol hinzu und laden Sie die Lysate auf eine Spin-Säule, die eine DNA-bindende Kieselsäure-basierte Membran enthält. Waschen Sie die Säulen mehrmals, um reine DNA zu ergeben.
6. Elute die ergab DNA in 30-50 l TE Puffer.

2. Verstärkung des nicht kodierenden Kontrollbereichs (NCCR)

1. Führen Sie das folgende Verfahren in physisch getrennten Räumen aus. Verwenden Sie einen isolierten Raum, um die Reagenzien vorzubereiten und die Mischung an die PCR-Röhren zu verteilen.
2. Bereiten Sie den Master Mix für die Pre-PCR mit dem Primerpaar A (Tabelle 1) in einem Gesamtvolumen von 50 l vor und verwenden Sie die zuvor isolierte DNA aus Schritt 1.6. Das Pipettierschema zum Vorbereiten des Master-Mix für die vor und geschachtelte PCR ist in Tabelle 2gedruckt.
3. Verteilen Sie 45 l des Master-Mix in die PCR-Röhren.
4. Fügen Sie 5 l der isolierten DNA in die PCR-Röhren ein.
   HINWEIS: Verwenden Sie einen anderen Raum als den für die Master-Mix-Vorbereitung, um Eine Kontamination zu vermeiden.
5. Führen Sie die PCR mit den Reaktionsbedingungen aus, wie in Tabelle 3dargestellt. Wiederholen Sie Denaturierung, Glühen und Verlängerung in 35 Zyklen.
6. Für die verschachtelte Verstärkung verwenden Sie das Primerpaar B, das die Restriktionsstandorte für AgeI und SpeI enthält (Tabelle 1).
7. Führen Sie die verschachtelte PCR mit den Reaktionsbedingungen aus, wie in den Schritten 2.2 bis 2.5 beschrieben, mit 5 l der Vor-PCR.
8. Mischen Sie 10 l des PCR-Produkts mit 2 l 6x Gel-Ladefarbstoff. 10 l der Mischung auf ein 1,5% Agarose-Gel geben und das Gel 30 min bei 60 mA laufen lassen.
9. Visualisieren Sie das Gel mit einem geeigneten UV-Dokumentationssystem.
   HINWEIS: Die Größe des Amplicons wird voraussichtlich zwischen 300-500 bp liegen, je nachdem, ob Umlagerungen (Deletionen, Einfügungen oder Duplizierungen) aufgetreten sind (Abbildung 2C).
10. Reinigen Sie die PCR-Amplicons mit einem PCR-Reinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Elute die PCR-Amplicons in 30 L Elutionspuffer.
11. Senden Sie die Amplicons für die Sanger-Sequenzierung mit dem Primerpaar B.

3. Klonen des NCCR in den Dual-Fluoreszenz-Reporter

1. Verdauen Sie die gereinigten Amplicons (Schritt 2.10) mit AgeI und SpeI für 2 h bei 37 °C, wie in Tabelle 4beschrieben.
2. Wiederholen Sie Schritt 2.10 und reinigen Sie die verdauten Amplicons.
3. Verdauen Sie parallel auch das Plasmid-Rückgrat (1,5 g) mit AgeI und SpeI für 2 h bei 37 °C, wie in Tabelle 5beschrieben. Dieser Schritt muss nur einmal ausgeführt werden. Für nachfolgende Reaktionen die Verdauung bei -20 °C einfrieren.
4. Analysieren Sie das verdaute Plasmid-Rückgrat auf einem 0,8% niedrigen Schmelzagarose-Gel.
   HINWEIS: Führen Sie das Gel nicht mit einem Strom von mehr als 40 mA aus. Die erwartete Einfügung des Spacer-Bereichs, der ursprünglich vom Plasmid pEX-K4 2-LTR CD3¹³ abgeleitet wurde, beträgt 128 bp (Abbildung 2C).
5. Visualisieren Sie DNA-Fragmente mit langwelligem UV-Licht (320 nm) und schneiden Sie das Rückgratband mit einem sauberen Skalpell aus. Übertragen Sie das niedrige Schmelzgelfragment in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Vermeiden Sie lange UV-Belichtungszeiten, um DNA-Schäden zu verhindern.
   HINWEIS: Da niedrige Schmelzagarose verwendet wird, ist es nicht notwendig, die DNA vor der Ligation zu reinigen.
6. Das Rückgrat mit dem schwachschmelzenden Agarose-Stück 10 min bei 65 °C erhitzen, um das Gelstück zu schmelzen und alle 2 min durch sanftes Wirbeln zu mischen. Das geschmolzene Gel kann direkt zur Ligation verwendet werden.
7. Ligate das Rückgrat und das verdaute Amplicon mit T4 DNA Ligase über Nacht bei 16 °C mit dem Schema in Tabelle 6gezeigt .
8. Führen Sie die Umwandlung in E. coli mit der Hitzeschockmethode, Plattenbakterien auf LB-Amp-Platten und Kultur bei 37 °C über Nacht durch.
9. Wählen Sie am nächsten Tag drei positive Klone aus und bereiten über Nacht E. coli-Kulturen (5 ml LB-Amp) und Kultur bei 37 °C vor.
10. Isolieren Sie die Plasmid-DNA mit Standardprotokollen, wie an anderer Stelle beschrieben¹⁴, führen Sie AgeI und SpeI Verdauung, um auf positive Klone zu überprüfen und visualisieren ausgeschnittene Fragmente auf einem 1% Agarose Gel. Das Abstandsband (128 bp) wird durch die größere NCCR-Sequenz (300-500 bp, siehe oben) ersetzt.
11. Senden Sie das Plasmid für die Sanger-Sequenzierung mit Primer EGFP-N oder Primerpaar B (Tabelle 1).
12. Da Mutationen spontan auftreten können, vergleichen Sie die Sequenzierungsergebnisse mit den Sequenzierungsergebnissen, die mit dem Amplikon erzielt wurden. Verwenden Sie nur die Klone, die im Vergleich zum Amplikon identische Sequenzen enthalten.
13. Verwenden Sie eine molekulare Workbench-Software (z. B. Freeware GENtle 1.9.4 oder andere Sequenzbearbeitungsprogramme), um die erhaltenen Sequenzen auszurichten und zu bearbeiten (Abbildung 3).
14. Starten Sie GENtle 1.9.4 und importieren Sie die DNA-Sequenzen, indem Sie auf den Import-Button (grüner Pfeil nach unten) klicken.
15. Klicken Sie als nächstes auf Werkzeug und wählen Sie Ausrichtung aus dem Menü (Verwenden Sie Strg+G als Verknüpfung) und wählen Sie die DNA-Sequenzen für die Ausrichtung.
16. Fügen Sie der Ausrichtung eine Sequenz hinzu, indem Sie auf Hinzufügen oder Entfernen einer Sequenz klicken, indem Sie auf Entfernenklicken. Schließen Sie eine archetypische NCCR-Konsenssequenz wie JN192438¹⁵ein, verwenden Sie nicht die NCCR-Sequenz aus dem häufig verwendeten Dunlop-Stamm¹⁶, da sie Umlagerungen und Duplizierungen anderer als die archetypische BKPyV enthält Stämme.
    HINWEIS: Die NCCR enthält bereits das translationale Startcodon (Abbildung 3).
17. Wählen Sie eine Methode für die Ausrichtung, indem Sie in der Symbolleiste auf Algorithmus klicken und clustal W auswählen. Legen Sie die Ausrichtungsparameter so fest, dass sie 2 entsprechen; Spaltverlängerungsstrafe -1; Spaltstrafe -2 und klicken Sie auf OK, um die Ausrichtung auszuführen.

4. Transiente Transfektion von HEK293T-Zellen mit dem Reporterplasmid und Behandlung mit potenziellen antiviralen Wirkstoffen

1. Um ausreichende Mengen an Plasmid-DNA für nachfolgende Transfektionsexperimente vorzubereiten, wird eine 150 ml Übernachtkultur vorbereitet. Isolieren Sie die Plasmid-DNA mit einem Plasmid-Isolationskit. Alternativ können auch andere Plasmid-Reinigungskits verwendet werden.
2. Samen 1 x 10⁵ HEK293T-Zellen in DMEM, die 10% FCS, Penicillin und Streptomycin (1x) pro Bohrung einer 12-Well-Platte 24 h vor der Transfektion enthalten und über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren, um die aktive Proliferation während der Transfektion aufrechtzuerhalten.
   HINWEIS: Zellen sollten bei der Transfektion etwa 80 % konfluent sein.
3. Legen Sie 250 l reduziertes Serummedium in eine sterile Röhre und fügen Sie 1 g jeder Reporter-Plasmid-DNA hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren.
4. Fügen Sie dem DNA-Gemisch 3 l des Transfektionsreagenzes hinzu, mischen Sie es vorsichtig durch Pipettieren und inkubieren Sie 15 min. Das Transfektionsreagenz vor der Umgebungstemperatur von 22 °C vorerwärmen und vor Gebrauch sanft wirbeln.
5. Fügen Sie die Mischung tropfenweise in die Brunnen und verteilen Sie vorsichtig auf den Brunnen.
6. Nach 4 h den Überstand durch ein frisches Medium ersetzen, das die Prüfmittel und die Lösungsmittelkontrolle enthält. Bei 37 °C bis zur Analyse inkubieren. In diesem Beispiel wurden die mTOR-Inhibitoren INK128 (100 ng/mL) und Rapamycin (100 ng/mL) verwendet.

5. Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie

1. Überprüfen Sie Zellen auf die rote und grüne Fluoreszenz unter dem Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 4).
   HINWEIS: Rote und grüne Fluoreszenz entsprechen der frühen bzw. späten BKPyV-Genexpression.
2. Nach 72 h nach der Transfektion den Überstand aspirieren und die Zellen zweimal mit 1 ml kaltem PBS waschen.
3. Fügen Sie vorsichtig 500 l Trypsin hinzu und drehen Sie die Platte leicht, um eine vorzeitige Ablösung der Zellen zu vermeiden. Dieser Schritt ist wichtig, um Zelldoublets zu vermeiden.
4. Nach dem Hinzufügen entfernen Sie das Trypsin direkt mit der gleichen Pipettespitze.
5. Inkubieren Sie die Zellen für mindestens 5 min bei 37 °C.
6. Trypsinisierte Zellen mit 1 ml PBS, die 3% FCS enthalten, wieder aufsetzen und die Suspension in vorbeschriftete FACS-Rohre übertragen.
7. Fügen Sie vor der FACS-Analyse DAPI (1 g/ml) hinzu.
8. Analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometer. Messen Sie für jede Probe mindestens 10.000 lebende Zellen, die für die DAPI-Färbung negativ sind.

6. Datenanalyse

1. Importieren Sie die Daten in die Flow-Zytometrie-Analysesoftware, und fügen Sie Beispiele per Klick und Drag in den Arbeitsbereich hinzu.
2. Doppelklicken Sie auf die importierte Datei und erstellen Sie ein Diagrammdiagramm. Wählen Sie FSC-A gegen SSC-A, indem Sie auf die x- und y-Achse klicken. Gate die Hauptzellpopulation, indem Sie auf Polygon in der Symbolleiste klicken und die Zellpopulation umrahmen (Abbildung 5). Benennen Sie die ausgewählte Zellpopulation nach Bedarf (z. B. "einzelne Zellen"). Die "einzelnen Zellen" werden als neuer Arbeitsbereich angezeigt.
3. Fahren Sie mit dem Gating "einzelne Zellen" für DAPI-Negativ (d. h. "lebende Zellen") fort. Um lebende Zellen zu identifizieren, vergleichen Sie die Zellpopulation mit und ohne DAPI-Färbung. Wählen Sie in beiden Parzellen FSC-A versus pacific-blue-A.
4. Klicken Sie auf das Rechteck und wählen Sie die negative DAPI-Zellpopulation, benennen Sie die ausgewählte Zellpopulation als "lebende Zellen" und erstellen Sie ein neues Punktdiagramm, das FITC (eGFP) im Vergleich zu PE (tdTomato) wie zuvor beschrieben zeigt.
5. Fügen Sie Quadranten in "lebende Zellen" hinzu, indem Sie Quad aus der Symbolleiste auswählen. Gate die Bevölkerung, indem Sie die Mitte des Quadranten an den Rand jeder Bevölkerung ziehen. Die Quadranten stellen 1) eGFP-tdTOM-, 2) eGFP-tdTOM+, 3) eGFP+tdTOM-, 4) eGFP+tdTOM+ dar.
   HINWEIS: Aufgrund der spektralen Überlagerung von Emissionsspektren zwischen FITC und PE ist eine anfängliche Kompensation unerlässlich, um zwischen roten und grünen Signalen zu unterscheiden und genaue Ergebnisse zu erzielen.
6. Bestimmen Sie die mittleren Fluoreszenzintensitäten (MFI), indem Sie mit der rechten Maustaste auf den Quadranten klicken und Statistik hinzufügenauswählen. Wählen Sie Mittelwert und klicken Sie auf OK. Das mittlere MFI wird nun unterhalb der Bevölkerung im Abschnitt "Statistik" angezeigt. Quadranten 2 und 4 entsprechen dem frühen Ausdruck, während quadranten 3 und 4 einen späten Ausdruck darstellen.
7. Fügen Sie zusätzliche Replikationen auf die gleiche Weise für die statistische Leistung hinzu.
8. Für Dateninterpretationsdiagramm MFI-Werte von früh und spät in ein Balkendiagramm:
9. Um NCCR-Aktivitäten von verschiedenen Spendern oder Virusstämmen zu vergleichen, fügen Sie eine archetypische Kontrolle oder den Dunlop-Stamm¹⁶ hinzu, und legen Sie ihre relativen MFIs auf 100 % fest, und berechnen Sie die relativen MFI-Werte. Wiederholen Sie dies mit jeder Replikation und bestimmen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung.
10. Um eine Wirkung potenzieller Verbindungen auf die Transkriptionsaktivität zu bewerten, stellen Sie die Lösungsmittelkontrolle auf 100% ein und zeichnen Sie das MFI der behandelten Zellen auf.

Results

In diesem repräsentativen Experiment wurde die von BK-Polyomavirus Non-Coding Control Region gesteuerte Transkriptionsaktivität mittels Durchflusszytometrie gemessen. Darüber hinaus wurde ein mTOR-Hemmer, der zur Behandlung von Patienten nach BKPyV-Reaktivierung eingesetzt werden könnte, auf seine Hemmung der viralen frühen Genexpression getestet. Zu diesem Zweck wurde ein dualer Fluoreszenz-Reporter-Assay verwendet, wie zuvor veröffentlicht⁵. Das gesamte Workflow-...

Discussion

In diesem Artikel wird eine häufig verwendete Methode vorgestellt, die die Analyse der BKPyV-Nicht-Kodierungssteuerungsregion (NCCR) ermöglicht, die von einer frühen und späten Promotoraktivität getrieben wird. Die NCCR-Aktivität kann gleichzeitig gemessen werden und benötigt keine Lyse der transfizierten Zellen. Darüber hinaus kann eine relativ große Anzahl von Zellen analysiert werden und die Ko-Transfektion zusätzlicher Marker zur Normalisierung der Fluoreszenzwerte ist nicht notwendig.

Ein...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 bp Leiter	NEB	N3231	Jede Leiter mit einer Reichweite von bis zu 1 kb kann ersetzt werden
2-log Leiter	NEB	N0550	Jede Leiter mit einer Reichweite von bis zu 10 kb kann ersetzt werden
Agar-Agar, Kobe I	Carl Roth	5210.3
AgeI-HF	NEB	R3552
Ampicillin Natriumsalz Cellpure	Carl Roth	HP62.1
Aqua ad iniectabilia	Bbraun	2351744	kann durch jeden Hersteller
ersetzt werden BD FACSCanto™ II	BD Biosciences
BD FACSDiva	BD Biosciences
DAPI	Sigma	10236276001
DFC450C Kameramodul	Leica		Jede Kamera kann verwendet werden
DMEM	Gibco	41966-029	kann von jedem Hersteller ersetzt
werden DMIL LED-Mikroskop	Leica		Jedes Fluoreszenzmikroskop kann verwendet werden
DNA Blood Mini Kit	Qiagen	51104	kann von jedem Hersteller ersetzt
werden E.coli DH5alpha Competent Cells	Thermo Scientific	18258012
FBS Superior	MerckMillipore	50615	Jedes FBS kann verwendet werden
FlowJo v10.5.3	FlowJo, LLC		Jede Durchflusszytometrie-Software FBS kann verwendet werden
Gel Loading Dye, Purple (6X)	NEB	B7024	Jeder 6x-Beladungsfarbstoff kann HEK293T Zellen substituiert werden
	ATCC	11268	Diese Zellen exprimieren konstitutiv das große T-Antigen des Affenvirus 40 (SV40), und Klon 17 wurde speziell aufgrund seiner hohen Transfektionsfähigkeit ausgewählt.
HERAcell® 240i CO2-Inkubator	Thermo Scientific		kann von jedem Hersteller ersetzt
werden HotStar PCR-Kit	Qiagen	203203
Intas Gel Dokumentationssystem	Intas		Jedes Visualisierungssystem für gefärbte DNA, das Agarose-Gele enthält, kann verwendet werden
Low Melt Agarose	Biozym	850081	kann von jedem Hersteller
Opti-MEM	Invitrogen	31985070	kann von jedem Hersteller substituiert werden
pBKV (34-2)	ATCC	45025	Plasmid, das das vollständige Genom des BKPyV-Stammes Dunlop enthält; wurde als Positivkontrolle verwendet; DNA Seq. Acc.: KP412983
PBS	Gibco	14190-136
PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler	Bio-Rad	Auslaufprodukt	Jeder Thermocycler kann verwendet werden
PCR Nucleotide Mix, 10 mM	Promega	#C1145	kann von jedem Hersteller ersetzt werden
PCR1 und PCR2 Primer	Metabion	nicht anwendbar	Entsalzt. Verdünnen auf (10 & Mikro; M) mit Wasser in PCR-Qualität
PenStrep (100x)	Gibco	15140-122	kann von jedem Hersteller ersetzt werden
Roti®-GelStain	Carl Roth	3865	Ein fluoreszenzbasierter Farbstoff zur Messung der dsDNA-Konzentration
SpeI-HF	NEB	R3133
T4-DNA Ligase	NEB	M0202
TransIT LT1	Mirus	MIR2300
Trypsin 0,05% - EDTA	Gibco	25300-054	kann von jedem Hersteller substituiert
werden ZymoPURE II Plasmid Kit	Zymo	D4201	kann von jedem Hersteller ersetzt