Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung eines tumortragenden Mausmodells zur Überwachung der Tumorprogression und Angiogenese in Echtzeit durch duale Biolumineszenz-Bildgebung.
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Methodenartikel
Dual Biolumineszenz-Bildgebung der Tumorprogression und Angiogenese
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Angiogenese als entscheidender Prozess der Tumorprogression ist zu einem Forschungs-Hotspot und Ziel der Anti-Tumor-Therapie geworden. Es gibt jedoch kein zuverlässiges Modell, um Tumorprogression und Angiogenese gleichzeitig visuell und sensibel zu verfolgen. Die Biolumineszenz-Bildgebung zeigt ihre einzigartige Überlegenheit in der lebendigen Bildgebung aufgrund ihrer Vorteile hoher Empfindlichkeit, starker Spezifität und genauer Messung. Präsentiert hier ist ein Protokoll, um ein tumortragendes Mausmodell zu etablieren, indem eine Renilla-Luziferase-markierte murine Brustkrebs-Zelllinie 4T1 in die transgene Maus mit Angiogenese-induzierter Firefly-Luzifferase-Expression injiziert wird. Dieses Mausmodell bietet ein wertvolles Werkzeug, um die Tumorprogression und Angiogenese in Echtzeit durch duale Biolumineszenz-Bildgebung in einer einzigen Maus zu überwachen. Dieses Modell kann weit verbreitet in Anti-Tumor-Arzneimittel-Screening und Onkologie-Forschung angewendet werden.
Einleitung
Angiogenese ist ein wesentlicher Prozess bei der Progression von Krebs von kleinen, lokalisierten Neoplasmen zu größeren, potenziell metastasierenden Tumoren1,2. Die Korrelation zwischen Tumorwachstum und Angiogenese wird zu einem der Schwerpunkte im Bereich der onkologischen Forschung. Herkömmliche Methoden zur Messung morphologischer Veränderungen können jedoch die Tumorprogression und Angiogenese bei lebenden Tieren nicht gleichzeitig mit einem visualisierten Ansatz überwachen.
Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) von Tumorzellen ist eine besonders geeignete experimentelle Methode zur....
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Protokoll
Die Versuche müssen den nationalen und institutionellen Vorschriften über die Verwendung von Tieren zu Forschungszwecken entsprechen. Genehmigungen für die Durchführung von Experimenten müssen eingeholt werden. Die Behandlung von Tieren und die experimentellen Verfahren der Studie entsprechen den Richtlinien des Nankai University Animal Care and Use Committee, die den richtlinien für Tierpflege entsprechen, die von den National Institutes of Health (NIH) genehmigt wurden.
1. LV-Rluc-RFP (RR) und LV-Rluc-RFP-HSV-ttk (RRT) lentivirale Verpackung und Produktion
ANMERKUNG: Der pLV-RR trägt die Gensequenzen von Renilla ....
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Ergebnisse
In diesem Experiment wurde ein Brustkrebs-Mausmodell mit 4T1-Zellen erstellt, um den Zusammenhang zwischen Tumorwachstum und Tumorangiogenese zu untersuchen (Abbildung 1). Zunächst wurden zwei Lentiviren verpackt, die Gensequenzen trugen, die Rluc/RFP (LV-RR) und Rluc/RFP/HSV-ttk (LV-RRT) exättierten, wie bereits berichtet7. Anschließend wurden zwei verschiedene 4T1-Zelllinien mit den Namen 4T1-RR und 4T1-RRT durch die Transducing LV-R.......
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Diskussion
In diesem Protokoll wird ein nicht-invasiver dualer BLI-Ansatz zur Überwachung der Tumorentwicklung und Angiogenese beschrieben. Das BLI-Reportersystem wurde entwickelt und enthält das HSV-ttk/GCV-Selbstmordgen zur Verfolgung der Tumorprogression und Regression in vivo durch Rluc-Bildgebung. In der Zwischenzeit wird die Tumorangiogenese mit Vegfr2-Fluc-KI-Mäusen mittels Fluc-Bildgebung untersucht. Dieses tumortragende Mausmodell ist in der Lage, eine praktische Plattform für die kontinuierliche und nicht-invasive Trackin.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Forschung wurde unterstützt durch das National Key R&D Program of China (2017YFA0103200), die National Natural Science Foundation of China (81671734) und Key Projects of Tianjin Science and Technology Support Program (18YFZCSY00010), Fundamental Research Funds for den Zentraluniversitäten (63191155). Wir erkennen die Revisionen der Gloria Nance an, die für die Verbesserung der Qualität unseres Manuskripts wertvoll waren.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,25 % Trypsin-0,53 mM EDTA | Gibco | 25200072 | |
| 1,5 mL Röhrchen | Axygen Scientific | MCT-105-C-S | |
| 15 mL Röhrchen | Corning Glass Works | 601052-50 | |
| 293T | ATCC | CRL-3216 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 60 mm Dish | Corning Glass Works | 430166 | |
| 6-Well-Platte | Corning Glass Works | 3516 | |
| Biosicherheitswerkbank | Shanghai Lishen Scientific | Hfsafe-900LC | |
| Blasticidin S Hydrochlorid (BSD) | Sigma-Aldrich | 15205 | |
| Zellzählkit-8 | MedChem Express | HY-K0301 | |
| CO2 Tegulierter Inkubator | Thermo Fisher Scientific | 4111 | |
| Coelenterazin (CTZ) | NanoLight-Technologie | 479474 | |
| D-Luciferin-Kaliumsalz-Messschieber | Life Sciences | 119222 DMEM-Medium | |
| Gibco | C11995500BT | ||
| Fötales Rinderserum (FBS) | BIOIND | 04-001-1A | |
| Fluoreszenzmikroskop | Nikon | Ti-E/U/S | |
| Ganciclovir (GCV) | Sigma-Aldrich | Y0001129 | |
| Grafiksoftware | GraphPad Software | Graphpad Prism 6 | |
| Insulinspritzennadeln | Becton Dickinson | 328421 | |
| Isofluran | Baxter | 691477H | |
| Lentivirales Verpackungssystem | Biosettia | cDNA-pLV03 | |
| Liposom | Invitrogen | ||
| Living Imaging Software Caliper | Life Sciences | Living Imaging Software 4.2 | |
| Living Imaging System | Caliper Life Sciences | IVIS Lumina II | |
| MEM Medium | Invitrogen | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Corning Glass Works | R21031399 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-1G | |
| RPMI1640 Medium | Gibco | C11875500BT | |
| SORVALL ST 16R Zentrifuge | Thermo Fisher Scientific | Thermo Sorvall ST 16 ST16R | |
| Ultratiefkühlschrank | Haier | DW-86L338 | |
| XGI-8 Gas-Anästhesiesystem | XENOGEN Korporation | 7293 |
Referenzen
- Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. The New England Journal of Medicine. 285, 1182-1186 (1971).
- Kerbel, R. S. Tumor angiogenesis. The New England Journal of Medicine. 358, 2039-2049 (2008).
- Hosseinkhani, S.
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Nachdrucke und Genehmigungen
