Wir präsentieren eine Methode, die für die großflächige enzymatische Synthese und Reinigung spezifischer Enantiomere und Regioisomere von Epoxiden von Arachidonsäure (AA), Docosahexaensäure (DHA) und Eicosapentaensäure (EPA) unter Verwendung eines bakteriellen Cytochroms nützlich ist. P450-Enzym (BM3).
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Methodenartikel
Enzymatische Synthese von epoxidierten Metaboliten von Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic und Arachidonsäuren
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die epoxidierten Metaboliten verschiedener mehrfach ungesättigter Fettsäuren (PUFAs), die als Epoxidfettsäuren bezeichnet werden, haben eine Vielzahl von Rollen in der menschlichen Physiologie. Diese Metaboliten werden endogen durch die Cytochrom-P450-Klasse von Enzymen hergestellt. Aufgrund ihrer vielfältigen und starken biologischen Wirkung besteht ein erhebliches Interesse an der Untersuchung dieser Metaboliten. Die Bestimmung der einzigartigen Rolle dieser Metaboliten im Körper ist eine schwierige Aufgabe, da die Epoxidfettsäuren zunächst in signifikanten Mengen und mit hoher Reinheit erhalten werden müssen. Die Gewinnung von Verbindungen aus natürlichen Quellen ist oft arbeitsintensiv, und lösliche Epoxidhydrolasen (sEH) hydrolysieren die Metaboliten schnell. Andererseits ist die Erlangung dieser Metaboliten über chemische Reaktionen sehr ineffizient, da es schwierig ist, reine Regioisomere und Enantiomere, niedrige Erträge und eine umfangreiche (und teure) Reinigung zu erhalten. Hier präsentieren wir eine effiziente enzymatische Synthese von 19(S), 20(R)- und 16(S),17(R)-epoxydocosapentaennoic acids (EDPs) aus DHA via Epoxidation mit BM3, einem bakteriellen CYP450-Enzym, das ursprünglich aus Bacillus isoliert wurde Megaterium (das leicht in Escherichia coliausgedrückt wird). Die Charakterisierung und Bestimmung der Reinheit erfolgt mit DerKernspinresonanzspektroskopie (NMR), der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und der Massenspektrometrie (MS). Dieses Verfahren veranschaulicht die Vorteile der enzymatischen Synthese von PUFA-Epoxid-Metaboliten und ist auf die Epoxidation anderer Fettsäuren anwendbar, einschließlich Arachidonsäure (AA) und Eicosapentaensäure (EPA), um die analoge epoxyeicosatrienoische Säuren (EETs) bzw. Epoxyeicosatetraenosäuren (EEQs).
Einleitung
Da das Interesse an der Rolle, die mehrfach ungesättigte Fettsäuren (insbesondere Omega-3 und Omega-6 mehrfach ungesättigte Fettsäuren) in der menschlichen Biologie spielen, in den letzten Jahren zugenommen hat, haben Forscher die breite Palette attraktiver Vorteile, die ihre Metaboliten ausstellen. Insbesondere Epoxid-Fettsäure-Metaboliten, die von der Cytochrom-P450-Klasse von Enzymen produziert wurden, waren ein großer Schwerpunkt. Beispielsweise spielen viele PUFA-Epoxide, einschließlich Epoxyeicosatrienosäuren (EETs), Epoxydocosapentaensäuren (EDP) und Epoxyeicosatetraenosäuren (EEQs), eine entscheidende Rolle bei der Regulierung von Blutdruck und Entzündungen
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Protokoll
VORSICHT: Bitte konsultieren Sie alle relevanten Materialsicherheitsdatenblätter (MSDS), bevor Sie die aufgeführten Chemikalien verwenden.
1. Ausdruck des Wildtyps BM3
- Inokulat pBS-BM3 transfizierte DH5- E. coli (eine großzügige Spende von Dr. F. Ann Walker) in 5 ml steriler LB-Brühe mit 0,5 mg Ampicillin in einem 20 ml Kulturrohr.
- Die Zellkultur in einem Shaker bei 37 °C für 24 h bei 200 Umdrehungen pro Minute inkubieren. Fügen Sie die Nachtstarterkultur (5 ml) und 100 mg Ampicillin zu 1 L steriler LB-Brühe in einem Fernbach- oder Erlenmeyerkolben hinzu. Bei 37 °C bei 200 Umdrehungen von 200 Umdrehungen/ minute....
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Ergebnisse
Das Blitzsäulenchromatogramm (durchgeführt mit einem automatisierten Blitzreinigungssystem, wie unten beschrieben), das bei der Reinigung des Rohgemischs aus enzymatischer Epoxidation erhalten wurde, ist in Abbildung 1dargestellt. Nach Veresterung und Trennung der Regioisomerewurden reine 16( S), 17(R)-EDP und 19(S),20(R)-EDP Methylester erhalten. In der Regel sind sie in einem ungefähren Verhältnis von 1:4bis 1:5 .......
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Diskussion
Wir präsentieren hier eine operativ einfache und kostengünstige Methode zur Vorbereitung der beiden am häufigsten vorkommenden Epoxidmetaboliten von DHA - 19,20 und 16,17-EDP. Diese Epoxidfettsäuren können in hochenantiopurer (als S,R-Isomere) Form mit Wildtyp-BM3-Enzym hergestellt werden. Im Folgenden werden mehrere kritische Punkte beschrieben, die zur Fehlerbehebung verwendet werden können, und die Erweiterung unserer Methode zur Herstellung von enantiopuren Epoxidmetaboliten von AA und EPA.
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wird von R00 ES024806 (National Institutes of Health), DMS-1761320 (National Science Foundation) und Startup-Fonds der Michigan State University finanziert. Die Autoren danken Dr. Jun Yang (University of California at Davis) und Lalitha Karchalla (Michigan State University) für die Unterstützung bei der Optimierung der enzymatischen Reaktion und Dr. Tony Schilmiller (MSU Mass Spectrometry and Metabolomics Facility) Unterstützung bei der HRMS-Datenerfassung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Ammoniumbicarbonat | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicillin | GoldBio | A30125 | NA |
| Wasserfreies Magnesiumsulfat | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Wasserfreies Methanol | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Wasserfreies Natriumsulfat | Fisher | Scientific S421-500 | NA |
| wasserfrei Toluol | Sigma-Aldrich | 244511 | NA |
| Arachidonsäure (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Luftempfindlich. |
| Diethylether | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (molekularbiologische Qualität) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Docosahexaensäure (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Luftempfindlich. |
| EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) | Invitrogen | 15576028 | |
| NA Eicosapentaensäure (EPA) | Nu-Chek Vorbereitung | U-99A | luftempfindlich. |
| Ethylacetat | Sigma | 34858 | NA |
| Flash-Säulenkartuschen Größen 25, 40, 4, 12 g | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | Alternativ kann auch konventionelle Säulenchromatographie verwendet werden |
| Ameisensäure (HPLC-Qualität) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glycerin | Sigma | G7757 | NA |
| Hexane | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Bouillon | Sigma | L3022 | NA |
| Lithiumhydroxid | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Magnesiumchlorid | Fisher Scientific | 2444-01 | NA |
| Methanol (HPLC-Qualität) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Tetranatriumsalz | Sigma-Aldrich | 481973 | Luftempfindlich. |
| Oxalsäure | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 transfiziert DH5α E. coli | NA | NA | NA |
| PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid) | Sigma | P7626 | Giftig! |
| Kaliumpermanganat | Sigma-Aldrich | 223468 | Für die DC-Färbung. |
| Kaliumphosphat zweibasisch | Sigma | 795496 | NA |
| Kaliumphosphat monobasisch | Sigma | 795488 | NA |
| Q Sepharose Fast Flow Harz (GE Healthcare life sciences) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | Für die Reinigung des Anionenaustauschs von |
| Enzym Natriumchlorid | Sigma | 71376 | NA |
| Tetrahydrofuran, wasserfrei | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazomethan (2,0 M in Hexanen) | Sigma-Aldrich | 362832 | Sehr giftig. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| strong>Ebenfalls erforderlich:Automatisches Flash-Reinigungssystem | |||
| (wir haben einen Büchi Reveleris X2 verwendet) | Büchi | ||
| C18 HPLC-Säule (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Agilent | ||
| Zentrifuge für 10.000 x g | |||
| chirale HPLC-Säule (Lux Cellulose-3), 250 x 4,6 mm, 5 & Mikro; M, 1000 Å) | Phenomenex | ||
| General Chemistry liefert: einen 2-Liter-Scheidetrichter, Bechergläser und Erlenmeyerkolben mit einem Fassungsvermögen von 1000-2000 l, 20-ml-Fläschchen, HPLC-Fläschchen, kleine Rundkolben und Rührstäbchen. | |||
| HPLC (wir verwenden eine Shimadzu Prominence LC-20AT Analysepumpe und SPD-20A UV-vis Detektor | Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 Spektralphotometer | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: Agilent DD2 Spektrometer (500 MHz) | ||
| Rotationsverdampfer | Buchi | ||
| Sonic Dismembrator oder Ultraschall-Homogenisator | Cole-Parmer |
Referenzen
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circulation Research. 78, 415-423 (1996).
- Ulu, A., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
