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Methodenartikel

Charakterisieren Sie krankheitsbedingte Mutanten der Kinases der RAF-Familie durch die Verwendung einer Reihe praktischer und machbarer Methoden

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DOI:

10.3791/59795

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17. Juli 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Laboratory of Cancer Signaling, Division of Cellular and Molecular Research, National Cancer Centre Singapore, 2The Cancer and Stem Cell Program, Duke-NUS Medical School

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In diesem Artikel haben wir eine Reihe praktischer und praktikabler Methoden zur Charakterisierung krankheitsbedingter Mutanten von KI-Familienkinasen vorgestellt, die In-vitro-Kinase-Assay, RAF-Koaktivierungstest und komplementärer Split-Luziferase-Assay umfassen.

Zusammenfassung

Die schnell beschleunigten Fibrosarkom (RAF) Familie Kiinasen spielen eine zentrale Rolle in der Zellbiologie und ihre Dysfunktion führt zu Krebs und Entwicklungsstörungen. Eine Charakterisierung krankheitsbedingter RAF-Mutanten wird uns helfen, geeignete therapeutische Strategien zur Behandlung dieser Krankheiten auszuwählen. Jüngste Studien haben gezeigt, dass KI-Familienkiinasen sowohl katalytische als auch allosterische Aktivitäten haben, die durch Dimerisierung streng reguliert werden. Hier haben wir eine Reihe praktischer und praktikabler Methoden konstruiert, um die katalytischen und allosterischen Aktivitäten und die relative Dimeraffinität/Stabilität von RAF-Familienkiinasen und ihren Mutanten zu bestimmen. Erstens haben wir den klassischen In-vitro-Kinase-Assay geändert, indem wir die Waschmittelkonzentration in Puffern reduziert enden, ein sanftes Schnellwaschverfahren anwenden und eine Glutathion-S-Transferase-Fusion (GST) verwenden, um zu verhindern, dass sich RAF-Dimer während der reinigung. Dies ermöglicht es uns, die katalytische Aktivität konstitutiv aktiver RAF-Mutanten angemessen zu messen. Zweitens haben wir einen neuartigen RAF-Coaktivierungstest entwickelt, um die allosterische Aktivität von kinase-toten RAF-Mutationen zu bewerten, indem wir N-terminal abgeschnittene RAF-Proteine verwenden, die Anforderung von aktiven Ras in aktuellen Protokollen eliminieren und dadurch eine höhere sensibilität. Schließlich haben wir einen einzigartigen komplementären Split-Luziferase-Assay erstellt, um die relative Dimeraffinität/Stabilität verschiedener RAF-Mutationen quantitativ zu messen, was zuverlässiger und empfindlicher ist als der traditionelle Co-Immunoprecipitation-Assay. Zusammenfassend haben diese Methoden folgende Vorteile: (1) benutzerfreundlich; (2) in der Lage sind, ohne fortgeschrittene Ausrüstung effektiv durchzuführen; (3) kosteneffektiv; (4) hochempfindlich und reproduzierbar.

Einleitung

Die Kinasen der RAF-Familie sind eine Schlüsselkomponente der RAS/RAF/MEK/ERK-Signalkaskade, die ein Signal von RAS zur Aktivierung der Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MEK)1,2,3,4. Diese Familie von Kiinasen spielt eine entscheidende Rolle für Zellwachstum, Überleben und Differenzierung, und ihre Veränderungen induzieren viele Krankheiten, vor allem Krebs5,6,7,8. Kürzlich haben genomische Sequenzierungen viele krankheitsbedingte RAF-Mutationen identifiziert, die unterschiedliche Eigenschaften in der Signalübertragung von RAS/RAF/MEK/ERK-Kaskade9,10,11aufweisen. Eine sorgfältige Charakterisierung von RAF-Mutationen wird uns helfen, die molekularen Mechanismen zu verstehen, wie RAF-Mutanten die Signalleistung von RAS/RAF/MEK/ERK-Kaskade verändern, schließlich geeignete Ansätze zur Behandlung verschiedener RAF-mutierter Krankheiten auswählen.

Die Kiinasen der RAF-Familie umfassen drei Mitglieder, CRAF, BRAF und ARAF, die ähnliche molekulare Strukturen, aber unterschiedliche Fähigkeiten haben, um die nachgeschaltete Signalisierung1,2,3,4zu aktivieren. Unter diesen Paralogen hat BRAF die höchste Aktivität aufgrund seines konstitutiv phosphorylierten NtA- (N-terminal acidic) Motiv12,13,14, während ARAF das niedrigste Tätigkeit, die sich aus dem nicht-kanonischen APE-Motiv15ergibt. Dies kann die unterschiedlichen Mutationshäufigkeiten von RAF-Paralogen bei Krankheiten erklären: BRAF>CRAF>ARAF. Darüber hinaus können Mutationen an verschiedenen Standorten innerhalb desselben RAF-Paralogs auf unterschiedliche Weise nachgeschaltete Signalisierung auslösen, was der Regulierung von KI-Familienkinasen eine weitere Komplexitätsschicht hinzufügt. Jüngste Studien haben gezeigt, dass alle RAF-Kiinasen sowohl katalytische als auch allosterische Aktivitäten haben13,14,16,17,18. Konstitutiv aktive RAF-Mutationen schalten die nachgeschaltete Signalisierung direkt durch Phosphorylating MEK ein, während kinasetote RAF-Mutationen ihre wildtypisierten Gegenstücke durch Seiten-zu-Seite-Dimerisierung transaktivieren und die MEK-ERK-Signalisierung 16 aktivieren können. ,19,20. Die Dimer-Affinität/Stabilität ist ein wichtiger Parameter, der nicht nur die allosterische Aktivität von kinase-toten RAF-Mutanten bestimmt, sondern auch die katalytische Aktivität konstitutiv aktiver RAF-Mutanten15,21, 22. Die kinase-toten RAF-Mutationen mit hoher Dimer-Affinität/Stabilität können die endogenen Wildtyp-RAFs direkt15transaktivieren, während diejenigen mit mittlerer Dimeraffinität/Stabilität eine Koordination von aktiven Ras oder erhöhte Seebene von wildtypen RAF-Molekülen auf Funktion13,15,20,21,23. In ähnlicher Weise phosphorylieren konstitutiv aktive RAF-Mutationen MEK auf dimerabhängige Weise, und diejenigen mit geringer Dimer-Affinität/Stabilität verlieren ihre katalytische Aktivität in vitro nach Immunpräzipation, die die schwachen RAF-Dimerebricht 15, 21,22. Die Dimer-Affinität/Stabilität bestimmt auch die Empfindlichkeit von RAF-Mutanten gegenüber ihren Inhibitoren und korreliert positiv mit der Resistenz von RAF-Hemmern24. Daher ist es notwendig, ihre katalytischen und allosterischen Aktivitäten zu messen, um krankheitsbedingte RAF-Mutationen zu charakterisieren, und die Affinität/Stabilität zu verschleiern.

In den letzten Jahren haben unser Labor und andere verschiedene Methoden entwickelt, um die Kiinasen der RAF-Familie und ihre Mutanten zu charakterisieren. Nach der Erfahrung unseres Labors und der Erfahrung anderer denken wir, dass die folgenden drei Assays Vorteile bei der Definition krankheitsbedingter RAF-Mutanten haben: (1) der In-vitro-Kinase-Assay, der mit Leichtigkeit durchgeführt werden kann, um die katalytische Aktivität konstitutivzu zu erkennen aktive RAF-Mutanten15; (2) der RAF-Koaktivierungstest, der eine zuverlässige und bequeme Methode zur Messung der allosterischen Aktivität von kinase-toten RAF-Mutanten13,15,21,22,23ist, 25; (3) der komplementäre Split-Luziferase-Assay, der im Gegensatz zum herkömmlichen Co-Immuno-Präzipitationstest eine viel höhere Empfindlichkeit bei der Messung der relativen Dimeraffinität/-stabilität von RAF-Mutanten hat und ohne fortgeschrittene Ausrüstung in im Gegensatz zu den quantitativen analytischen Methoden wie SPR (Surface Plasmon Resonance) Analyse15,22. Durch die Kombination dieser drei Assays können wir leicht verstehen, wie ein krankheitsbedingter RAF-Mutant die nachgeschaltete Signalisierung verändert und dabei eine geeignete therapeutische Strategie zur Behandlung der durch diese RAF-Mutation verursachten Krankheit nutzt.

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Protokoll

1. In Vitro Kinase Assay zur Messung der katalytischen Aktivität von RAF Mutanten

  1. Konstruieren Sie Vektoren, die RAF-Mutationen (Abbildung1A) mit FLAG(DYKDDDDK) Tag am C-terminus codieren, indem Sie Gibson Assembly oder traditionelle molekulare Klonmethoden verwenden.
    1. Führen Sie das FLAG-Tag und die Mutationen durch PCRs in die RAF-Codierungssequenzen ein, und fügen Sie dann ganze Sequenzen in den pCDNA3.1(+)-Vektor ein, indem Sie Gibson-Baugruppe oder T4-DNA-Ligation verwenden und den Protokollen der Herstellung folgen. Verwenden Sie die folgenden Bedingungen für PCR-Reaktionen: (1) 95 °C, 2 min; (2) 95 °C, 30 s; (3) 59 °C, 30 s; (4) 68 °C, 3 min; (5) 20 Zyklen von (2 bis 4); (6) 4 °C halten.
      HINWEIS: Die PCR-Primer zum Klonen: 5- AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCC-3 und 5-CAGCGGGTTTAACGGGCCCTCTA-3.
    2. Fügen Sie die GST-Codierungssequenz vor DEN RAF-Mutanten-Codierungssequenzen ein, um Vektoren zu generieren, die GST-gebundene RAF-Mutationen kodieren, indem Sie dieselben Methoden verwenden, wie in Schritt 1.1.1 beschrieben.
    3. Validieren Sie alle Vektoren durch DNA-Sequenzierungen vor der Transfektion.
  2. Platte 293T-Zellen in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 5 x 105 Zellen/gut einen Tag vor der Transfektion. Wenn die Zelldichte am zweiten Tag 80 bis 90 % Zusammenfluss erreicht, transfekt man sich mit Vektoren über, die MIT FLAG-markierten RAF-Kiinasen oder deren Mutanten von Schritt 1.1 in Zellen kodieren, indem sie dem Herstellungsprotokoll von Transfektionsreagenzien folgen (Materialtabelle).
  3. Ersetzen Sie das Kulturmedium 24 h nach der Transfektion.
  4. Saugen Sie das Kulturmedium 48 h nach der Transfektion und fügen Sie 400 l/Well lysis Puffer (25 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,25% NP-40, pH 7,2) ergänzt mit Protease- und Phosphataseinhibitoren zu Lysezellen auf Eis.
    HINWEIS: Die Konzentration von NP-40 im Lysepuffer ist entscheidend für den Nachweis der katalytischen Aktivität von RAF-Mutanten mit moderater Dimer-Affinität/Stabilität in vitro. Eine hohe Konzentration von Waschmittel oder ein starkes Reinigungsmittel im Lysepuffer kann RAF-Dicher brechen und dadurch die katalytische Aktivität von RAF-Kiinasen oder deren Mutanten abtöten.
  5. Übertragen Sie die Zelle lysiert in ein 1,5 ml Rohr, und drehen Sie um 12.000 x g für 10 min bei 4 °C, um Zellablagerungen zu abbauen.
  6. Übertragen Sie 300 l pro Probe sauberer ganzer Zelllysate auf 1,5 ml-Rohre, fügen Sie 20 l pro Probe anti-FLAG-Affinitätsperlen hinzu und drehen Sie in einem kalten Raum (4 °C) für 1 h. Nehmen Sie auch 40 l pro Probe von sauberem vollzelligem Lysat beiseite, um die Expression und Aktivität (Phospho-ERK1/2) von RAF-Mutanten durch Immunoblots zu erkennen, wie unten beschrieben.
  7. Waschen Sie die Anti-FLAG-Perlen einmal mit Lysepuffer, dann einmal mit Kinase-Reaktionspuffer (20 mM HEPES, 10 mM MgCl2, 0,5 mM Na3VO4, 0,5 mM DTT, pH 7,2), und fügen Sie 20 l Kinase-Reaktionsmischung (2 g MEK1(K97A) und 100 Aktionspuffer) pro Probe.
    HINWEIS: Die Perlenwäsche sollte schonend und schnell durchgeführt werden, der Restpuffer sollte vor dem Hinzufügen eines Kinase-Reaktionsgemisches vollständig angesaugt werden, und alle Operationen bei diesem Schritt sollten bei 4 °C in einem Kühlraum durchgeführt werden.
  8. Inkubieren Sie die Kinase-Reaktionen bei Raumtemperatur (25 °C) für 10 min, und kippen Sie die Röhren mit Kinase-Reaktionen mit Denfingern jede zweite Minute während der Inkubation.
  9. Fügen Sie 5 l 5x SDS-Probenpuffer hinzu (375 mM Tris HCl, 9% Natriumdodecylsulfat (SDS), 50% Glycerin, 0,03% Bromophenol blau) pro Probe, um Kinase-Reaktionen zu stoppen, und erhitzen Sie dann die Proben bei 90 °C für 5 min.
  10. Führen Sie die Proben in 9 bis 12% Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) mit 0,1% SDS, übertragen Sie die Proteine auf die Nitrocellulosemembran und detektieren Sie die Konzentrationen von Phospho-MEK- und RAF-Mutanten in Proben durch Immunoblots.
    HINWEIS: Das Phospho-MEK kann auch mitder Verwendung von 32 P-ATP quantifiziert werden. Kurz gesagt, wirddem Kinase-Reaktionspuffer 10 'M'32 P-ATP zugesetzt, und die Menge an phosphoryliertem MEK wird dann nach der PAGE-Trennung mit Standard-Autoradiographie-, Phosphor-Imaging- oder Flüssigszintillationszähltechniken als angemessen.

2. RAF Co-Aktivierung Assay zur Bewertung der allosterischen Aktivität von Kinase-toten RAF Mutanten

  1. Konstruieren Sie Vektoren, die den RAF-Empfänger (CRAF-Kinase-Domäne mit nicht phosphorylierbarem NtA-Motiv, AAFF) oder die kinase-toten RAF-Aktivatoren (RAF-Kinase-Domäne mit phosphorylierungsmimicked NtA-Motiv, SSDD, DDEE oder DGEE) (Abbildung1A) als in Schritt 1.1 beschrieben.
  2. Transfekt 293T-Zellen mit zwei Vektoren, die sowohl den RAF-Empfänger als auch den kinase-toten RAF-Aktivator oder einen einzelnen Vektor kodieren, der eines der Proteine kodiert, wie in den Schritten 1.2 und 1.3 beschrieben.
  3. Ersetzen Sie das Kulturmedium bei 24 h nach der Transfektion, und ernten Sie 293T Transfektanten bei 48 h, um die gesamte Zelllysate vorzubereiten, wie in den Schritten 1.4 und 1.5 beschrieben.
  4. Mischen Sie das saubere ganzzellige Lysat schnell mit 5x SDS-Probenpuffer bei Raumtemperatur (25 °C) und kochen Sie dann bei 90 °C für 5 min.
  5. Führen Sie die gekochten Ganzzelllysatproben in 9 bis 12% PAGE mit 0,1% SDS durch, übertragen Sie die Proteine auf die Nitrozellulosemembran, und detektieren Sie die Phospho-ERK1/2-Spiegel und kontrollieren Sie Proteine durch Immunoblots.

3. Kostenloser Split Luciferase Assay zur Messung der relativen Dimer-Affinität/Stabilität von RAF-Mutanten

  1. Konstruieren Sie Vektoren, die FLAG-markierte RAF-Mutationen kodiert, die mit dem N-Terminus von Nluc (N-terminus of firefly luciferase, aa2-416) oder dem C-terminus von Cluc (C-terminus of firefly luciferase, aa398-550) verschmolzen sind, wie in Schritt 1.1 beschrieben.
  2. Transfekt293T-Zellen mit einem Paar Vektoren, die verschiedene Nluc-RAF-Mutationen und Cluc-RAF-Mutationen kodieren, wie in Schritt 1.2 beschrieben.
  3. Bei 24 h nach der Transfektion 293T Zelltransfektate in Krystal black Bildplatten mit der Zelldichte von 2x105 pro Brunnen mit farbfreiem Medium (d.h. DMEM ohne Phenolrot) replate.
  4. 24 h später D-Luciferin (0,2 mg/ml) zu 293T Zelltransfektaten hinzufügen, 30 min inkubieren und die Luziferasesignale mit Hilfe eines Multi-Detektionssystems (Materialtabelle )messen.
  5. Nach der Messung der Luziferasesignale, aspirieren Sie das Medium und Lyse 293T Transfektanten mit Lysepuffer, um die gesamte Zelle Lysate vorzubereiten, wie in den Schritten 1.4 und 1.5 beschrieben.
  6. Führen Sie die gesamte Zelllysat-Proben in 9-12% PAGE mit 0,1% SDS aus und detektieren Sie die Expressionswerte von Nluc-RAF-Mutationen und Cluc-RAF-Mutationen durch Anti-FLAG-Immunoblot, wie in Schritt 2.5 beschrieben. Die relativen Expressionsniveaus sowohl von Nluc-RAF-Mutation als auch von Cluc-RAF-Mutationen in 293T-Transfektanten werden anhand von Bild J aus ihren Immunoblots quantifiziert.
  7. Normalisieren Sie die Luziferase-Signale von 293T-Zelltransfekten entsprechend den Expressionsniveaus von Nluc-RAF-Mutanten und Cluc-RAF-Mutanten. Kurz gesagt, wird dies erreicht, indem das rohe Luziferasesignal durch die relativen Expressionsniveaus von Nluc-RAF-Mutationen und Cluc-RAF-Mutationen von Schritt 3.6 dividiert wird.

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Ergebnisse

Die Kiinasen der RAF-Familie haben sowohl katalytische als auch allosterische Aktivitäten, die es ihren krankheitsbedingten Mutanten ermöglichen, die nachgeschaltete Signalisierung durch verschiedene Mechanismen einzuschalten13,14,16,17 ,18. Die konstitutiv aktiven RAF-Mutationen phosphorylieren direkt ihre Substrate, während die kinase-toten RAF-Mutanten ihr...

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Diskussion

In diesem Artikel haben wir drei Methoden zur Charakterisierung krankheitsbedingter RAF-Mutationen vorgestellt, darunter In-vitro-Kinase-Assay, RAF-Koaktivierungs-Assay und komplementärer Split-Luziferase-Assay. Da RAF-Kiinasen sowohl katalytische als auch allosterische Aktivität haben, können verschiedene RAF-Mutationen die nachgeschaltete Signalisierung durch zwei unterschiedliche Mechanismenaktivieren 13,14,16,

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Die Autoren möchten das Hairy Cell Leukemia Fellowship für die Unterstützung von Yuan Jimin würdigen. Diese Arbeit wurde unterstützt von Asia Fund Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Bridge Funding Award (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF Bridging Grant (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot grant (NCCRF-YR2017-JUL-PG3) und SHF Academic Medicine Forschungsstipendium (AM/TP011/2018).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
anti-phosphoERK1/2Cell Signaling Technologies4370
anti-phosphoMEK1/2Cell Signaling Technologies9154
anti-ERK1/2AB klonalA0229
anti-MEK1/2Cell Signaling Technologies9124
anti-FLAG (Maus)Sigma-AldrichF3165
anti-HANovus BiologicalsMAB6875
anti-FLAG(Rabbit)Cell Signaling Technologies14793
anti-β-AktinSigma-AldrichA2228
anti-FLAG beads(M2)Sigma-AldrichA4596
HRP-konjugiert anti-mouse IgGJackson Laboratories115-035-003
HRP-konjugiert Anti-Kaninchen-IgGJackson Laboratories111-035-144
pcDNA3.1(+)In-vitrogenV79020
Gibson Assembly Klonierung  KitNew England BiolabsE5510
T4 DNA-LigaseNew England BiolabsM0202
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019
Fugene 6Roche11 814 443 001
DMEM ohne PhenolrotInvitrogen21063-029
D-Luciferin GoldBioLUCK-100
6xhis-getaggt MEK1 (K97A)  erstellt in unseren früheren StudienN.A.Referenz 15.
GloMax-Multi Detektionssystem.PromegaE7041

Referenzen

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