Einzellige Screening-Methode zur Auswahl und Wiederherstellung von Antikörpern mit gewünschten Besonderheiten aus angereicherten menschlichen Gedächtnis B-Zellpopulationen

Zusammenfassung

Die BSelex-Methode zur Identifizierung und Wiederherstellung einzelner antigenspezifischer Antikörper aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen kombiniert Durchflusszytometrie mit einzelliger PCR und Klonen.

Zusammenfassung

Das menschliche Antikörperrepertoire stellt eine weitgehend ungenutzte Quelle potenzieller therapeutischer Antikörper und nützlicher Biomarker dar. Während aktuelle Rechenmethoden, wie z. B. die Sequenzierung der nächsten Generation (NGS), enorme Datensätze über das Antikörperrepertoire auf Sequenzebene liefern, sind funktionale Daten erforderlich, um zu identifizieren, welche Sequenzen für ein bestimmtes Antigen oder einen Satz von Antigene. Hier beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung und Rückgewinnung einzelner antigenspezifischer Antikörper aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von einem menschlichen Blutspender. Diese Methode nutzt eine anfängliche Anreicherung von reifen B-Zellen und erfordert eine Kombination aus phänotychenZellmarkern und fluoreszierend markiertem Protein, um IgG-Speicher-B-Zellen über Durchflusszytometrie zu isolieren. Die bereiche der schweren und leichten Kettenvariablen werden dann geklont und erneut überprüft. Obwohl diese Methode auf das Speicher-B-Zellfach beschränkt ist, nutzt sie die Durchflusszytometrie, um Millionen von B-Zellen abzuhören, und gibt gepaarte schwere und leichte Kettensequenzen aus einer einzelnen Zelle in einem Ausdrucks- und Spezifitätsformat zurück. Antikörper, die mit dieser Methode zurückgewonnen werden, können für das therapeutische Potenzial in Betracht gezogen werden, können aber auch Spezifität und Funktion mit bioinformatischen Ansätzen verknüpfen, um das B-Zell-Repertoire innerhalb von Individuen zu bewerten.

Einleitung

Antikörper sind eine wachsende Klasse von therapeutischen Molekülen, und das bestehende B-Zell-Repertoire in jedem Menschen ist eine potenzielle Quelle solcher Antikörper. Wenn sie von einem menschlichen Spender geborgen werden, erfordern sie keine Anpassung oder "Humanisierung", Schritte, die für Antikörper erforderlich sind, die in anderen Tiersystemen erzeugt werden. Es gibt mehrere Methoden zur Identifizierung und Isolierung menschlicher Antikörper, einschließlich B-Zellaktivierung und -proliferation¹, Verewigung über EBV-Transformation^2,3und Erzeugung von Hybridom-Zelllinien^{4 ,5}. Jedoch, alle diese Methoden erfordern umfangreiche Zellkultur zu überprüfen und Antigen-spezifische Antikörper zu überprüfen. Mit der Entwicklung der Next Generation Sequencing (NGS)-Technologie, die die Identifizierung riesiger Mengen einzelner Sequenzen in Spenderproben ermöglicht, wurden die Informationen über das menschliche Antikörperrepertoire erheblich erweitert. Da NGS jedoch eine agnostische Sicht auf alle vorhandenen Sequenzen liefert, erlaubt es nicht die Identifizierung und Isolierung antigenspezifischer Antikörper, insbesondere bei seltenen oder niederfrequenten Antikörpern.

Der Zweck der "BSelex"-Methode ist es, antigenspezifische Antikörper aus zirkulierenden peripheren mononukleären Blutzellen bei menschlichen Spendern zu identifizieren und die Sequenzen dieser Antikörper zur weiteren Analyse zu isolieren und wiederherzustellen. Diese Methode nutzt Durchflusszytometrie und Zellsortierung, um den B-Zellrezeptor (BCR) zu nutzen, der auf der Oberfläche von Speicher-B-Zellen ausgedrückt wird. Millionen von B-Zellen können über die Durchflusszytometrie auf Antigenspezifität untersucht werden, bevor die molekularbiologischen Methoden mit niedrigerdurchsatzigem Satz initiiert werden. Eine gepaarte schwere und leichte Kettenidentifikation ist in den meisten NGS-Methoden, die Zellsequenzen in großen Mengen analysieren, nicht möglich. In der Methode, die wir hier beschreiben, werden Zellen einzeln isoliert, und eine gepaarte Wiederherstellung sowohl schwerer als auch leichter Kettensequenzen ist möglich, was das direkte Klonen und die Expression des vollständigen IgG ermöglicht.

Protokoll

Die Verwendung von Proben von menschlichen Freiwilligen folgte Protokollen, die vom Scripps Research Institute Institutional Review Board genehmigt wurden. Vor der Blutspende wurde die informierte Zustimmung der Spender eingeholt.

1. Reagenz-Vorbereitung

1. Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs)
   1. Reseiz periphere mononukleäre Blutzellen von normalen menschlichen Spendern durch Ficoll-Plaque Plus Isolierung. Kryokonservierung bei 50 Millionen Zellen/ml in 90% fetalem Rinderserum (FBS) und 10% Dimethylsulfoxid (DMSO). Einfrieren der Zellen bei -80 °C und Transfer zu flüssigem Stickstoff für die langfristige Lagerung.
2. Kennzeichnung Ziel Antigen Peptide für die Sortierung
   1. Mit einem terminalen Biotin werden peptide spezifisch für das Zielprotein (bis zu 70 Rückstände lang) erzeugt oder erhalten.
   2. Etikett 4 nmol jedes einzelnen biotinylierten Peptids mit Streptavidin, das kovalent an PE (R-Phycoerythrin) oder APC (Allophycocyanin) in separaten Röhrchen befestigt ist. Bereiten Sie sich mit einem Molverhältnis von 9:1 Peptid zu Streptavidin (SA), mit einer Endkonzentration von etwa 3,2 m für SA-PE und 5,7 m SA-APC vor. Bereiten Sie Biotin-Tetramere als Negativkontrolle vor.
   3. Jede Peptidmischung über Nacht im Dunkeln bei 4 °C mit langsamer Mischung inkubieren.
   4. Entfernen Sie ungebundenes Fluorophor, indem Sie markierte Peptide durch Mikrosäulen übergeben, die Polyacrylamidperlen enthalten.
   5. Peptidtetramere bis zu 2 Monate bei 4 °C lagern.

2. Zellsortierung

1. Mindestens 1 h bis 16 h vor der CD22+-Isolierung, Tauen Spender-PBMCs und bei 37 °C ruhen lassen.
   1. Durchstechflaschen gefrorener PBMCs aus dem Gefrierschrank nehmen und sofort in ein 37 °C-Wasserbad überführen. Wenn die Fläschchen fast aufgetaut sind, in den Arbeitsbereich übertragen.
   2. Übertragen Sie den Inhalt jeder Durchstechflasche in ein 50 ml-Rohr, das vorgewärmtes Medium enthält (wobei die Spender getrennt bleiben). Fügen Sie Medium zu einem Endvolumen von 50 ml hinzu. Mischen Sie den Inhalt vorsichtig.
   3. Zentrifuge bei 370 x g für 6 min bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie die Zellen in 15 ml RPMI-Gesamtmedium wieder auf und führen Sie eine Zellzahl aus.
   4. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 2,0 x 10⁷ Zellen/ml mit RPMI-Gesamtmedium ein und übertragen Sie Zellen in einen T75-Kolben oder größer und brüten bei 37 °C für mindestens 1 h und bis zu 16 h, um Dieerholungszeit für aufgetaute Zellen zu ermöglichen.
   5. Sammeln Sie die Zellen (auf Wunsch pooling) und Zentrifugen bei 370 x g für 6 min bei 4 °C. Verwerfen Sie Überstand und setzen Sie die Zellen in 5 ml eiskalten MACS-Puffer (PBS, pH 7,6 mit 0,5% BSA und 2 mM EDTA), bringen Sie auf 50 ml mit MACS-Puffer und führen Sie eine Zellanzahl.
   6. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 x g für 7 min bei 4 °C.
   7. Isolieren Sie die CD22⁺ B-Zellen durch positive Auswahl über Capture auf CD22 Mikroperlen. Verwenden Sie den MACS-Puffer für alle Waschungen. Anzahl und Zentrifuge 400 x g für 7 min bei 4 °C. Die erwartete Erholung beträgt 5-10% der gesamten PBMC-Bevölkerung.
   8. Zellen bei 40 Millionen pro ml FACS-Puffer (Tris-Puffer, pH 8,0 mit 0,5% BSA und 2 mM EDTA) wieder aussetzen und mit der Zellfärbung der Spender einzeln oder als Pool fortfahren.
2. Fleckenzellen für die Speicher-B-Zellsortierung
   1. Entfernen Sie ein Aliquot von Zellen für Zytometer eingerichtet und Kompensation für jeden der Etikettierung Fluorophore verwendet. Fügen Sie ungefärbte Zellen als Steuerelement ein.
   2. Berechnen Sie das endgültige Färbevolumen für die Anzahl der erhaltenen CD22⁺ Zellen (Färbung 2 Millionen pro 100 L).
   3. Fügen Sie extrazelluläre Marker für B-Zellen (CD19-PerCP-Cy5.5), IgG (IgG-FITC) und Speicherfach (CD27-PECy7) gemäß den Verdünnungsempfehlungen des Herstellers hinzu und mischen Sie sie vorsichtig. Aliquot 10⁷ Zellen in ein 1,5 ml Rohr für die negative Kontrolle und übertragen die verbleibenden Zellen zu einem 15 ml Rohr.
   4. Fügen Sie die doppelt gekennzeichneten Biotin-SA-Tetramere in das negative Kontrollröhrchen mit einer Endkonzentration von je 36 nM für PE und APC multipliziert mit der Anzahl der Peptide im Sortierrohr hinzu und bringen Sie das Volumen mit FACS-Puffer auf 0,5 ml Endstand (z. B. 10 Peptide x 36 nM=360 nM).
   5. Fügen Sie die Peptid-Tetramere bei je 36 nM für PE und APC in das Sortierrohr ein und bringen Sie die Zellen mit TBS-Puffer auf 2x10⁶ pro 100 l. Bei 4 °C im Dunkeln und mit sanfter Drehung für 30-60 min inkubieren.
   6. 2x bei 4 °C, 400 x g,7 min waschen und vor der letzten Wäsche ein Aliquot entfernen. Filterzellen mit 5 ml Filterkappenrohren. Fügen Sie DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole) Fleck zu 0,3 M Endkonzentration kurz vor der Sortierung als Marker der ZellmembranIntegrität.
3. Einzelzellsortierung über Durchflusszytometrie
   1. Bereiten Sie 48 Brunnen mit 96-Well-PCR-Platten zum Sortieren vor.
      1. Bereiten Sie eine Master-Mischung vor: (2 l mit 10x RT-Puffer, 0,5 l RNase-Inhibitor, 7,5 l steriles PCR-Wasser) pro Probe. Aliquot 10 l pro Brunnen, abdecken und bei 4 °C lagern, bis es zur Sortierung bereit ist.
   2. Führen Sie das negative Steuerelement auf dem Zellensortierer aus, und analysieren Sie die gesamte Probe.
      1. Legen Sie Flusszytometriegates fest, um die entsprechenden Zellpopulationen für die Einzelzellensortierung zu isolieren.
         1. Plot FSC Bereich vs SSC Bereich und setzen Gate R1 Lymphozyten zu isolieren.
         2. Plot FSC Höhe vs FSC Breite und setzen Gate R3 FSC Doublets auszuschließen.
         3. Plot SSC-Höhe vs SSC-Breite und setzen Gate R4 SSC Doublets auszuschließen.
         4. Plotten Sie SSC-Höhe im Vergleich zu DAPI und setzen Sie Gate R5, um lebende Zellen zu isolieren (DAPI^-).
         5. Plot IgG vs CD19 und set Gate R6, um IgG⁺ B Zellen zu isolieren (CD19⁺ IgG⁺).
         6. Plot IgG vs CD27 und setzen Gate R7,um Speicher B-Zellen (CD27 hoch) auszuwählen.
         7. Plot Antigen-PE (Ag-PE) vs Antigen-APC (Ag-APC) und setgate R8 als Ag-PE⁺/Ag-APC⁺ Quadrant mit einer geringen Anzahl von Ereignissen im doppelten positiven Gate.
   3. Sammeln Sie eine gleiche Anzahl von Speicherzellen aus der Antigen-positiven (Ag⁺) Probe für die Bestimmung von Signal zu Rauschen.
   4. Sortieren Sie einzelne Zellen mit dem Phänotyp CD19⁺ CD27⁺ Ag-PE⁺ Ag-APC⁺ (Gate R8) in präparierte 96-Well-PCR-Platten.
   5. Abdeckplatten mit Aluminiumbandbelägen, Zentrifuge für 1 min bei 400 x g und bei -80 °C für zukünftiges Klonen lagern.

3. Single Cell Cloning

1. Reverse Transkriptionsreaktionen
   1. Entfernen Sie die einzelne B-Zell-Sortierplatte von 80 °C. 2 min auf Eis auftauen. Die Platte 2 min bei 3.300 x g drehen, um den Inhalt im Boden der Brunnen vor dem Öffnen zu bündeln.
   2. Bereiten Sie einen dNTP/Puffer-Master-Mix mit 10% nicht-ionischem Waschmittel und Oligo(dT) als umgekehrter Primer vor. Fügen Sie Enzymmischung zu jedem Brunnen enthalten die einzelne Zelle und NICHT MIX.
   3. 5 min bei 65 °C inkubieren. Fügen Sie einen Enzym-Master-Mix mit 100 mM DTT, RNase-Inhibitor und Reverse-Transkriptase-Enzym hinzu, um das Gesamtvolumen auf 20 l zu erhöhen. 10 min bei 50 °C inkubieren, dann 10 min bei 80 °C.
   4. Übertragung auf Eis vor dem Starten der PCR-Schritte
2. Mehrstufige verschachtelte PCR-Reaktionen
   1. Verwenden Sie separate verschachtelte PCR-Reaktionen werden für schwere Kette (HC) und Lichtkette (LC) Verstärkung verwendet.
   2. Verwenden Sie für die erste Runde der PCR-Verstärkung (Schritt I) einen Pool von Vorwärtsprimern und einen einzigen Reverseprimer, um die HC- und LC-Variablenbereiche in separaten PCR-Reaktionen zu verstärken (Abbildung 2). Der Pool der Vorwärtsprimer verstärkt einen großen Prozentsatz der Keimbahn-Leader-Sequenzen (L) und die umgekehrte Grundierung ist spezifisch für die nachgelagerten konstanten Bereiche jeder Kette, einschließlich kappa () und Lambda () für Lichtketten¹⁶.
      1. Verwenden Sie für jede PCR-Reaktion (Schritt I) 2,5 L cDNA-Produkt als Vorlage. Fügen Sie Primer der endkunden Reaktionskonzentration von jeweils 1 m hinzu. Verdoppeln Sie den 10x Polymerase Puffer auf 2x Konzentration, bringen Sie das Endvolumen auf 25 l pro Reaktion. Führen Sie HC PCR-Reaktionen mit [94 °C/4 min; 94 °C /15 s, 55 °C /20 s, 68 °C/60 s; 68 °C/3 min] für 50 Zyklen. Führen Sie LC-PCR-Reaktionen mit [98 °C/4 min; 98 °C /15 s, 72 °C /20 s, 72 °C/60 s; 72 °C/3 min] für 50 Zyklen.
   3. Verwenden Sie 2,5 L des Step I-Produkts als Vorlage für jede (Schritt II) PCR-Reaktion. Fügen Sie den Pool an Vorwärtsprimern hinzu, die speziell für den HC- und LC-Rahmen 1-Bereich spezifisch sind, sowie einen Pool von Reverse Primern, die für den Anschlussbereich jeder Antikörperkette spezifisch sind. Verdoppeln Sie den 10x Polymerase-Puffer auf 2x Konzentration, und führen Sie PCR-Reaktionen 50 Zyklen mit den gleichen Parametern wie Schritt I aus.
   4. Führen Sie die abgeschlossenen PCR-Reaktionen auf 1% Agarose-Gel aus, um positive Amplifikationstreffer zu visualisieren. Stellen Sie gepaarte Amplicons (sowohl schwere als auch leichte Kette aus der gleichen Zelle) und isolieren Sie über Gelextraktion. Bestimmen Sie die DNA-Fragmentkonzentration über OD₂₆₀ für genaue Ligationsmixberechnungen.
   5. Kombinieren Sie wiederhergestellte schwere und leichte Kettenfragmente mit einem Linkerfragment und dem Expression Vector Backbone mithilfe einer 4-Fragment-Ligationsreaktion mithilfe eines kommerziellen Kits.
   6. Verwandeln Sie Ligationsreaktionen mit einem kommerziellen Kit in chemisch kompetente Bakterien. Einmal auf Antibiotikaplatten plattiert, 4 ml Wachstumsmedien (mit Antibiotikum) in die verbleibende Transformationskultur geben und 37 °C über Nacht bei 250 Umdrehungen pro Minute inkubieren. Das ist die "Ligationsmix-Kultur".
   7. Bereiten Sie Miniprep-DNA aus den nächtlichen Ligations-Mix-Kulturen mit einem kommerziellen Kit vor und bestimmen Sie die resultierende Plasmid-DNA-Konzentration.

4. ELISA-Bildschirm zur Bestätigung der Antigen-Spezifität

1. Transfekt 10 g Miniprep-DNA mit kationischem Lipid-basiertem Reagenz in 10 ml Suspension 293 Zellen und inkubieren Sie 3-4 Tage bei 37 °C (8%_CO2) während der Drehung bei 125 Rpm. Für die Ernte, Zentrifugenkultur 10 min bei 1.000 x g und wieder geklärte Medien.
   1. Messen Sie die IgG-Konzentration in den Überstand über die Affinität zu Protein A.
   2. Testen Sie jedes IgG (im Überstand) bei 20 g/ml durch enzymgebundenen Adsorbent-Assay (ELISA) mit den einzelnen Peptiden, die für die Sortierung verwendet werden und auf einer Streptavidinplatte oder actin als Negativkontrolle erfasst werden. Verwenden Sie einen Ziegen-Anti-Human-Peroxidase-Sekundärantikörper gegen den menschlichen IgG Fab, um rekombinante Klone zu erkennen. Nach subtraktion des Hintergrunds wird OD > 0.5 als Bildschirmpositiv definiert.
   3. Bestätigen Sie die positiven Treffer des Bildschirms, indem Sie einen zusätzlichen ELISA durchführen, indem Sie Verdünnungen von IgG-Überstand verwenden, um eine Konzentrationskurve ab 20 g pro ml zu erzeugen, und eine Darstellung gegen OD für jedes Antigen, das reaktivität im Ausgangsbildschirm-ELISA zeigt.

Ergebnisse

Diese Methode umfasst einen mehrstufigen Prozess zur Isolierung antigenspezifischer Antikörper von menschlichen Spendern. In den hier gezeigten repräsentativen Daten wurden Zellen mit einem Pool fluoreszierend markierter Peptide inkubiert, die mehrere verschiedene Bereiche des Tau-Proteins darstellen, einschließlich phosphorylierter Peptide, um vermeintliche Phosphorylierungsstellen zu imitieren. Diese Peptide wurden als "Köder" verwendet, um Zellen zu identifizieren, die mit Tau-Epitopen von Interesse reaktiv sind. Zur Vorbereitung der Sortierung wurde eine Tafel fluoreszierend markierter phänotypicMarker verwendet, um verschiedene Zellpopulationen innerhalb der angereicherten B-Zellpopulation zu identifizieren. Eine Reihe von Zytometrie-Gattern wurde entwickelt, um die Zielspeicher-B-Zellen zu isolieren (Abbildung 1). Lymphozyten wurden basierend auf ihrer Zellgröße und Granularität mithilfe von Vorwärtsstreuung (FSC) und Side Scatter (SSC) Plots in Derdurchflusszytometrie^6,7isoliert. Nach dem Ausschluss mehrerer Zellen ("Doublets") und abgestorbener Zellen ermöglichten phänotypische Marker die Segregation von IgG⁺ Speicher-B-Zellen über IgG, CD19 (B-Zelle) und CD27 (Speicher). Bei diesem Ansatz verteilt sich der CD27-Marker nicht in zwei diskrete Populationen, sodass die obersten 45 % der CD27⁺ exszierenden Zellen für das endige Tor enthalten sind. Schließlich verteilen sich Zellen doppelt positiv für APC- und PE-Fluorophore in den oberen rechten Quadranten des Gating-Graphen, was auf die Reaktivität auf beide markierten Versionen von Peptiden hinweist. Die Zellen, die innerhalb des gezogenen Tores fielen, wurden isoliert und in einzelne Brunnen einer 96-Well-Platte sortiert. Die Verwendung von Antigen mit zwei verschiedenen Etiketten erhöht das Signal-Rausch-Verhältnis und reduziert die Anzahl der Fehlalarme im anschließenden molekularbiologischen Prozess. Die sortierten Zellen stellten etwa 0,1 % der Speicher-B-Zellen im endgültigen Gate und 0,001 % der Startzellenprobe dar.

Die erste Auslesung des einzelzelligen Klonens ist die Bestätigung der Verstärkung der jeweiligen schweren und leichten variablen Ketten (Abbildung 2). Da eine gepaarte Wiederherstellung beider Amplicons gewünscht ist, werden die PCR-Reaktionen nebeneinander auf Agarose-Gel ausgewertet, und übereinstimmende Paare werden aus dem Gel und DNA-Fragmenten extrahiert. Typische Effizienz der Verstärkung ist 30-50% schwere Kette und 50-70% leichte (kappa) Kette. Die Wiederherstellung von gepaarten Amplicons ist in der Regel zwischen 25-40% Effizienz. Diese Effizienzen variieren zwischen den Geberpools, und die repräsentativen Daten (Abbildung 3) sind ein Beispiel für eine sehr effiziente Verstärkung von 24 Einzelzellen (42 % gepaarte Wiederherstellung). Nach dem IgG-Klonen wird der IgG-Expressionsvektor in die Suspensionszellen der menschlichen embryonalen Niere (HEK-293) transfiziert, die zur Maximierung der Expression verwendet werden. Die Verwendung von serumfreiem Medium reduziert kontaminierende Proteine aus der rekombinanten Antikörperpräparat und hilft, Rauschen in nachfolgenden Bindungstests zu minimieren. Die wiederhergestellten Antikörper werden gegen das ursprüngliche Panel der Tau-Peptide abgeschirmt und von ELISA auf Reaktivität bewertet (Abbildung 4). Ein anfangsschwellenwert von OD = 0,5 über dem Hintergrund wird verwendet, um eine positive Antigenreaktivität anzuzeigen, und das Protein von S-Actin wird als Kontrolle für die unspezifische Bindung verwendet. Wenn die Durchflusszytometrie und die Sortierschritte einen gemischten Pool von Peptiden verwenden, ist der Screening-ELISA der erste Schritt zur Entwirren spezifischer Reaktivität der wiederhergestellten IgGs. Drei der 10 igGs, die untersucht wurden, zeigten Reaktivität gegen phosphoryliertes CBTAU22.1-Peptid, und eine war reaktiv auf nicht phosphoryliertes CBTAU27.1 (Abbildung 4A). Eine zusätzliche Bestätigung wurde mit einer Konzentrationskurve der gleichen rekombinanten Antikörperproben gegen die im Ausgangsbild identifizierten Peptide und einem zusätzlichen Peptid als Negativkontrolle abgeschlossen (Abbildung 4B). Für jeden positiven Treffer wurde ein einzelner Plasmidklon aus dem transformierten Pool isoliert und durch die gleiche ELISA-Methode bestätigt. Nur Klon 34 wird die dargestellten Daten angezeigt, und während die Reaktivität auf nicht phosphorylierte CBTAU27.1 bestätigt wurde, wurde auch eine geringere Affinitätsbindung mit dem phosphorylierten 27,1 Peptid beobachtet (Abbildung 4C).

Abbildung 1 : Isolierung antigenreaktiver Einzelzellen über Durchflusszytometrie. (A) Gezeigt ist ein repräsentatives Diagramm, in dem die Lymphozytenpopulation innerhalb des gezeichneten Tores enthalten war. (B) Tore auf der Grundlage von Vorwärts- und Seitenstreuung (FSC-Höhe gegen FSC-Breite (R3); SSC- Höhe v SSC- breite(R4)) wurden verwendet, um Doublets auszuschließen. Nur Zellen innerhalb gezeichneter Tore wurden in nachfolgenden Plots ausgewertet. DAPI⁺ Zellen wurden als tot und ausgeschlossen (R5) betrachtet. In diesem Experiment wurden 3,7 x 10⁷ "lebende" Zellen abgefragt. Die Mehrheit der lebenden Zellen waren B-Zellen (CD19⁺), und IgG⁺ Zellen (4,66%) von dieser Population isoliert wurden (R6). Die obersten 43,2% der CD27⁺-exemittierenden Speicherzellen wurden in das Auswahlgate (R7) aufgenommen. (C) Quadrant 2 (Q2) enthielt Zellen, die auf beide markierten Antigene (Peptid-APC gegen Peptid-PE) reaktiv waren, und diese Zellen wurden einzeln in eine 96-Well-Platte sortiert und zurückgewonnen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2 : PCR-Verstärkung stellt die schwere und leichte variable Sequenz von IgG zum Klonen wieder her. (A) Sowohl schwere (VH) als auch leichte (Vk- oder Vl) Kettenvariablenbereiche werden mit verschachtelten PCR-Reaktionen wiederhergestellt. Schritt I Primer verstärken sich von der nativen Leader-Sequenz nach vorne und kehren innerhalb der konstanten Region um. Mehrere Pfeile stellen einen Pool von 7-12 Primern dar, die verwendet werden, um eine breite Abdeckung möglicher Keimbahnen zu gewährleisten. Schritt II-Primer sind verschachtelt, spezifisch für die extremen Enden des variablen offenen Leserahmens, und fügen Sequenzen zu den Enden der Amplicons hinzu, die homologe zur benachbarten Sequenz im Ausdrucksvektor sind. (B) Der Linker besteht aus der konstanten Lichtkette (Ck oder Cl), gefolgt vom schweren Kettenpromotor und einer nicht nativen Signalpeptidsequenz. Die Amplicons, der Linker und das Plasmid-Rückgrat werden gleichzeitig über eine überlappende homologe Sequenz ligiert, die während der Step II PCR-Verstärkung erzeugt und als intaktes Plasmid isoliert wird. Die rekombinanten schweren und leichten Ketten im endlichen Expressionsvektor werden von unabhängigen (und identischen) CMV-Promotoren angetrieben und als separate Proteine übersetzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3 : IgG schwere und leichte variable Kettenamplicons werden aus einzelnen Zellen wiederhergestellt. Die verschachtelten PCR-Reaktionen (Schritt II) wurden direkt auf 1% Agarose-Gel geladen und visualisiert. Schwere Kette (H) und Kappa Lichtkette (L) PCR-Reaktionen aus der gleichen Zelle wurden in angrenzenden Brunnen geladen, so dass gepaarte Amplicons leicht beobachtet wurden. Erfolgreiche Schwere und leichte Kettenprodukte sind etwa 400 bp bzw. 350 bp. Die erfolgreiche Wiederherstellung von gepaarten Amplicons wird durch ein (*) bezeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4 : Antigen-Spezifität wird durch rekombinante IgGs bestätigt. Plasmide, die die zurückgewonnenen schweren und leichten Kettensequenzen enthalten, werden zur Expression in HEK-Zellen transfiziert. Nach vier Tagen werden rekombinante Antikörper mit ELISA auf Reaktivität untersucht. (A) Die IgG-Konzentration in den geklärten Medien wurde gemessen und auf 20 g/ml verdünnt. Der Zum Sortieren verwendete Peptidepool wurde einzeln mit 40 pmol pro Brunnen in Streptavidinplatten bewertet. Alle IgGs wurden in doppelten Brunnen getestet. (B) Klone, die die OD450-Messung >0,5 anzeigten, wurden neu bewertet (Clones #32, #34, #35) mit 1:5 Verdünnungsschritten gegen die im Bildschirm identifizierten Peptide. (C) Einmal als Treffer bestätigt, wurde ein einzelner Plasmidklon aus dem Klon isoliert #34 transformierten Ligationen, transfiziert und durch ELISA bestätigt. Dasselbe galt für Klone #32 und #35 (Daten werden nicht angezeigt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Die hier vorgestellte Methode kombiniert Durchflusszytometrie und Einzelzellklonen, und die Methoden, die wir hier beschreiben, basieren auf Methoden, die zuvor von Tiller und Kollegen entwickelt wurden¹¹. Ihre Arbeit beschreibt die Rückgewinnung und das Klonen monoklonaler Antikörper, um das B-Zell-Repertoire beim Menschen auf der Ebene einzelner Zellen zu untersuchen. Wir haben die Hauptkomponenten ihres Prozesses angepasst, um die Rückgewinnung antigenspezifischer monoklonaler Antikörper aus einer Population von Speicher-B-Zellen zu ermöglichen, einschließlich der mehrstufigen Amplifikations-Primer-Strategie. Die wichtigste Modifikation ist die Zugabe von gekennzeichneten Antigen "Köder". Es wurden zusätzliche Anpassungen an das veröffentlichte Protokoll vorgenommen, einschließlich (aber nicht beschränkt auf) Modifizieren des Klonvektor-Rückgrats in ein einziges Expressionsplasmid, zusätzliche Primerabdeckung des Keimbahnrepertoires (sowohl Führungssequenz als auch Rahmen 1), Transfektion von Suspensions-HEK293-Zellen für eine höhere Expression und die Verwendung von Hochtreuepolymerasen während der PCR-Amplifikation.

Bei den hier beschriebenen Methoden befinden sich die wichtigsten Schritte in der Nähe des Übergangs zwischen Durchflusszytometrie und Einzelzellklonen. Zunächst ist die richtige Platzierung von sortierten Einzelzellen in die Platte unerlässlich. Die korrekte Einstellung der Drop-Delay auf der Sortiererin ist ein wichtiger Schritt. Umweltfaktoren wie niedrige Luftfeuchtigkeit müssen ebenfalls berücksichtigt werden, da wir festgestellt haben, dass unsere Wiederherstellungseffizienz deutlich abnimmt, es sei denn, auf den Zielsortierplatten wird ein statisches Geschütz verwendet. Nach der Zellplatzierung werden die Platten zentrifugiert, um sicherzustellen, dass die Zellen den Puffer von 10 L im Boden der Brunnen kontaktiert haben. Alle diese Maßnahmen sind entscheidend für den Erfolg des molekularbiologischen Teils. Wenn die Bedingungen für die Reverse-Transkriptionsreaktion einer einzelnen Zelle suboptimal sind, kann die PCR-Verstärkung von sogar dem Aktin schwierig sein. Die Stärke der vorgestellten Methode ist die Fähigkeit, Millionen von Zellen abzufragen und nur die Zellen zu sortieren, die den Antigen-Reaktivitätskriterien entsprechen, mit dem Antigen der Wahl. Dies erfordert, dass das Signal-Rausch-Verhältnis so hoch wie möglich ist, was durch die Optimierung der Köderkonzentrationen vor dem Sortieren geschieht. Dual-labeled Köder wird verwendet, um die Rückgewinnung von falsch-positiven Zellen zu reduzieren, die auftreten können, wenn einer der Fluorophore einen hohen Hintergrund hat. Die Verwendung von mehr als einem Antigenköder kann die Signal-Rausch-Optimierung erschweren, aber die Möglichkeit, mehrere Peptide gleichzeitig zu hinterfragt, ist ein weiterer Vorteil dieser Methode.

Wenn die Recovery-Effizienz gering ist, wird eine Reihe von verschachtelten '-Actin-Primern verwendet, um zu bestätigen, dass Vorlagen-cDNA vorhanden ist. Der Nachteil dieses Ansatzes ist, dass es schwierig ist, festzustellen, ob keine Zelle im Brunnen vorhanden war oder die umgekehrte Transkriptionsreaktion fehlgeschlagen ist, was die Fehlerbehebung erschwert. Gelegentlich tritt das Gegenteil auf, und die Effizienz ist höher als erwartet. Die typische Erholung für schwere Kette ist zwischen 30-45% und Leichte Ketten sind höher, zwischen 40-60%. Jede PCR-Reaktion (Schritt I & II) verwendet 50 Zyklen, um sich aus einer einzelnen Zelle zu verstärken. Die hohe Anzahl der Gesamtzyklen macht diese Methode auch anfällig für Verunreinigungen. Die Sequenzanalyse von Amplicons kann verwendet werden, um festzustellen, ob ein Schadstoff eingeführt wurde oder eine ungewöhnlich hohe Rückgewinnungsrate rechtmäßig erreicht wurde.

Der Nutzen dieser Methode, um native menschliche Antikörper gegen ein Antigen der Wahl zu erholen hat mehrere signifikante Einschränkungen. Erstens dürfen nur lösliche Proteine, die als "Köder" für die Durchflusszytometrie bezeichnet werden können, verwendet werden. Für die in den repräsentativen Ergebnissen dargestellten Sorten verwendeten wir eine Reihe synthetisierter überlappender Peptide aus Tau-Proteinen, da sich die Verwendung des gesamten Proteins als schwierig erwies. Die Verwendung linearer Peptide ist wahrscheinlich nicht optimal, da sie die Identifizierung von Antikörpern gegen nichtlineare oder strukturelle Epitope einschränken kann. Wir konnten jedoch mehrere eindeutige Antikörper gegen Tau identifizieren, die derzeit einer weiteren Bewertung unterzogen werden^8,9. Eine weitere Einschränkung ist der geringe Durchsatz der molekularbiologischen Wiederherstellung und des Klonens von IgGs. Die anfängliche Sortierstrategie ermöglicht das Screening von Millionen von Zellen, aber die anschließende molekularbiologische Verarbeitung besteht aus mehreren Stufen. Die laufenden Optimierungsbemühungen zur Integration neuerer Technologien, wie Gibson Assembly^10, haben mehrere Schritte optimiert, aber der Engpass bleibt das Klonen einzelner schwerer und leichter Kettenpaare.

Die "BSelex"-Methode verwendet die BCR, die auf der Oberfläche von Speicher-B-Zellen ausgedrückt wird, um Zellen zu identifizieren, die Antigenreaktivität anzeigen, und diese einzelnen Zellen dann über Diedurchflusszytometrie^11,12wiederherzustellen. Aufgrund dieser Abhängigkeit vom BCR ist die Methode auf das Speicher-B-Zellkompartiment beschränkt und erfasst keine Antikörpersekretionszellen (ASCs) wie Plasmablasten. Dieser Ansatz kann jedoch vorteilhaft sein, um ein breiteres Repertoire an antigenspezifischen Immunglobinen im Vergleich zu ASCs wiederherzustellen. Grippeimpfstudien zeigen, dass reaktive ASCs zwar von einer kleinen Anzahl erweiterter B-Zellklone dominiert werden können, die antigenspezifische Memory-B-Zellpopulation jedoch selten klonal^{ist 12}. Der T-Zell-Rezeptor (TCR) auf der Oberfläche von T-Zellen besitzt Ähnlichkeiten mit dem B-Zell-Rezeptor in Genanordnung und Rekombination, um die Vielfalt zu maximieren. Einzelzellige Ansätze, die dem in der hier vorgestellten Methode ähneln, wurden zur Bewertung des T-Zellrepertoires entwickelt, einschließlich der Wiederherstellung und des einzelzelligen Klonens von Alpha- und Betaketten¹³. Die TCR-Erkennung erfordert jedoch, dass Peptide von MHC-Molekülen präsentiert werden, was den markierten Köderansatz zur Identifizierung peptidspezifischer T-Zellen erheblich erhöht. Im Gegensatz zu B-Zellen durchlaufen T-Zellen keine Affinitätsreifung des gesamten variablen Bereichs, so dass die Identifizierung des kurzen CDR3-Bereichs und eine flankierende Sequenz alles ist, was für die Identifizierung und Rekonstitution erforderlich ist. Schließlich beschreibt diese Methode die Identifizierung von IgG-Molekülen mittels Durchflusszytometrie, aber es ist auch möglich, alternative phänotypische Marker zu verwenden, um B-Zellen verschiedener Isotypen zu identifizieren.

Derzeit werden Methoden entwickelt, um die enorme Menge an Daten, die aus der Sequenzierung der nächsten Generation gesammelt werden, mit der funktionellen Analyse der Antigenspezifität zu verbinden, aber diese Methoden werden noch verfeinert. Trotz ihrer Einschränkungen wurde die hier beschriebene Methode verwendet, um Antikörper mit potenziellem therapeutischen Wert sowohl für infektiöse als auch für nicht-infektiöse Krankheiten^zuidentifizieren 8^,14,15, und stellt eine zuverlässige Ansatz zur Rückgewinnung relevanter antigenspezifischer IgGs vom Menschen, ohne umfassende Manipulation von B-Zellen oder umfangreiche Zellkultur.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
MoFlo Astrio EQ, Zellsortierer	MoFlo		Zellsortierung
Biotinylierte Peptide	New England Peptid		Zellsortierung "Köder"
Micro Bio-spin P30 Gelsäule	BioRad	#7326223
Streptavidin (R-PE)	Thermo Scientific	SA10041
Streptavidin (APC)	Thermo Scientific	S32362
CD22 MicroBeads, human	Miltenyi	#130-046-401
LS-Säulen	Miltenyi	#130-042-401
Vorabscheide-Filter	Miltenyi	#130-041-407
PerCp-Cy5.5 Maus Anti-Mensch CD19	BD Biosciences	BD#340951
PE-Cy7 Maus Anti-Mensch CD27	BD Biosciences	#560609
FITC Maus Anti-Human-IgG	BD Biosciences	#560952
DAPI	Life Technologies	#D21490
RNaseOUT	Life Technologies	#10777-019
Rinderserumalbumin, Fraktion V	Sigma	#A4503 RPMI-Medien
	Hyclone	#SH30096.01
HI FBS (Fötales Rinderserum)	Invitrogen	#10082147
Mastercycler Gradient	Eppendorf	Modell #6325	PCR-Maschine
PCR 96-Well-Platten	Phenix	MPS-500
PCR Plattenmatten	Phenix	SMX-PCR96
Advantage UltraPure PCR Desoxynukleotid-Mix	Clontech	#639125
Superscript IV Erststrang-Synthesesystem	Invitrogen	#18091050
Phusion High Fidelity Polymerase	Thermo Scientific	F-531-L
Platinpolymerase	Invitrogen	#10966108
Nukleasefreies Wasser	QIAGEN	#129114
Oligonukleotid-Primer	IDT	sortiert	Primer für alle PCR-Schritte
Gel Extraktionskit	QIAGEN	#28706
PCR-Aufreinigungskit	QIAGEN	#28106
Miniprep Kit	QIAGEN	#27106
NEBuilder HiFi-DNA-Assemblierung Klonierungskit	New England Biolabs	E5520S	Gibson-Assemblierung
Expi293 Expressionsmedien	Invitrogen	#A14351-01
ExpiFectamine 293 Transfektionskit	Invitrogen	#A14525
Opti-MEM Media	Invitrogen	#31985070
CO2 Inkubator (Multitron)
Oktett  RED384 System	Pall/ Forte Bio
Pierce Streptavidin Coated High Binding Capacity Clear 96-Well-Platten	Thermo Scientific	#15500
Corning Costar 96-Well-Polystyrol-Platte mit hoher Bindung Half Area	Corning	#3690
Ziegen-Anti-Human-IgG-Fab-Sekundärantikörper	Jackson Labs	#109-036-097
Ziegen-Anti-Maus-HRP-Sekundärantikörper	Jackson Labs	#115-035-072
SureBlueTM TMB Mikrowell-Peroxidase-Substrat (1-Komponenten)	KPL	#52-00-03
TMB-Stopp-Lösung	KPL	#50-85-06