Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) sind grundlegend für die Erzeugung biologischer Effekte. Viele sind eng mit Krankheiten verbunden, und es wird zunehmend anerkannt, dass sie wichtige Angriffspunkte für die Wirkung von Medikamenten bieten1. Es stehen zahlreiche Techniken zur Verfügung, um diese Proteininteraktionen zu untersuchen, von denen einige in dieser Sammlung oder in anderen JoVE-Artikeln diskutiert werden. Jede Technik hat ihre eigenen Vorzüge und Grenzen2; Es gibt jedoch keine perfekte Technik für alle PPIs, da diese Wechselwirkungen in verschiedenen subzellulären Kompartimenten mit einem breiten Spektrum an Affinitäten (picomolar bis millimolaren) auftreten und möglicherweise nur vorübergehender Natur sind.
In-vitro-Kinase-Assays sind ein indirekter Ansatz zur Untersuchung von PPIs, mit dem analysiert werden kann, wie Kinasen ihre funktionelle Rolle beim Transfer einer Phosphatgruppe von ATP auf ein Substrat erfüllen. Cui et al.3 verwenden diese Technik, gekoppelt mit tryptischem Verdau und Massenspektrometrie, um die Cyclin-abhängigen Kinase-1-spezifischen Phosphorylierungsstellen an einem Fragment des humanen Zentromerproteins F (CENP-F) zu identifizieren. Für die funktionelle Verifizierung neuartiger Phosphorylierungsstellen verwenden die Autoren einen Bindungsassay, der CENP-F, das eine phosphomimetische Mutation enthält, und Karyopherin-α, einen nuklearen Transportrezeptor, kombiniert und so eine Kreuzvalidierung ermöglicht.
Die Coimmunpräzipitation ist eine weit verbreitete Methode zur Untersuchung von PPIs, bei der ein Antikörper verwendet wird, um ein bestimmtes Ziel zusammen mit allen anderen Proteinmolekülen, die mit ihm assoziiert sind, einzufangen. Zheng und Kollegen4 wenden diese Technik an, um Hypoxie-induzierbare Faktoren (HIFs) zu untersuchen, die als Heterodimere fungieren, die aus einer sauerstoffregulierten α-Untereinheit und einer konstitutiv exprimierten β-Untereinheit, auch bekannt als ARNT3, bestehen. Eine interessante Anmerkung zu ihrem Protokoll ist, dass die Zellen unter hypoxischen Bedingungen induziert und geerntet werden und endogene Proteine aus Kernfraktionen dann coimmunpräzipitiert werden. Wie die Autoren anmerken, besteht eine Einschränkung der Methode darin, dass sie nicht feststellen kann, ob PPIs direkt oder indirekt sind.
Nolan et al.5 stellen ein Protokoll zur Messung der Anzahl von Molekülen und ihrer Helligkeit in Fluoreszenzmikroskopiebildern "Number and Brightness" (N&B) vor, das zur Detektion der Protein-Homo-Oligomerisierung angewendet werden kann. Die Technik kann sowohl in vitro als auch in vivo angewendet werden und wurde angewendet, um den oligomeren Zustand von mVenus-markierten FKBP12F36V vor und nach der Zugabe eines dimerisierenden Arzneimittels genau zu quantifizieren. Die Autoren diskutieren die Vorzüge der Technik im Vergleich zu verwandten Technologien und betonen die Bedeutung der Korrektur von Bleiche und langfristigen Intensitätsschwankungen. Konfokale Mikroskope, die mit digitalen Detektoren ausgestattet sind, erleichtern die Quantifizierung, aber N&B ist auch mit analogen Detektoren möglich.
Die Affinitätsreinigung von Multiproteinkomplexen zusammen mit der Identifizierung ihrer Bestandteile ist eine weit verbreitete Technik, um die Funktionen solcher komplexierten Proteine zu verstehen. Im Protokoll von Luzarowski et al.6 wird diese Technik einen Schritt weiter geführt, indem sowohl PPIs als auch Protein-Metaboliten-Wechselwirkungen (PMIs) in transgenen Arabidopsis-Pflanzenzellen gleichzeitig charakterisiert werden. Markierte Nukleosiddiphosphatkinasen werden durch das Tandem-Affinitätsreinigungsverfahren (TAP) affinitätsgereinigt, wobei eingefangene Proteine und kleine Moleküle anschließend durch Massenspektrometrie identifiziert werden. Die Einzigartigkeit dieses Protokolls besteht in der Fähigkeit, sowohl hydrophobe als auch hydrophile Liganden zu identifizieren. Es handelt sich um ein Drei-in-Eins-Extraktionsprotokoll, das die Untersuchung von PPIs und PMIs ermöglicht und die Affinitätsreinigung auf die Pflanzung von Zellen anwendet.
Der Proximity-Ligationsassay hat den Vorteil, dass er zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen endogenen Proteinen in Zellen und Geweben eingesetzt werden kann. Karchugina und Chernoff7 verwenden die Technik, um das Vorhandensein von Heterodimeren der Kinasen MST1 und MST2 in humanen Schwann-Zellen (HSCs) und humanen embryonalen Nierenzellen (HEK-293) nachzuweisen. Ihr Artikel enthält mehrere wertvolle Hinweise, wie Sie die Technik erfolgreich durchführen können. Geeignete Primärantikörper, die in verschiedenen Spezies gegen jedes interagierende Protein gezüchtet werden, sind erforderlich, und da die Spezifität und Sensitivität der Antikörper entscheidend sind, sollten die Antikörperkonzentrationen fein abgestimmt werden. Die Autoren fanden Glaskammer-Objektträger geeignet für die Analyse mehrerer Zelllinien und Antikörperkombinationen, stellten jedoch fest, dass es zwingend erforderlich ist, den gesamten Silikoneinsatz zwischen den Vertiefungen zu entfernen, um Unterschiede im konfokalen Abstand während der Mikroskopie zu vermeiden. Darüber hinaus werden verschiedene Positiv- und Negativkontrollen verwendet, um die Ergebnisse zu validieren.
Die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) ist ein empfindlicher Assay, der verwendet werden kann, um eine Auflösung auf atomarer Ebene und quantitative Informationen über Proteinwechselwirkungen und Protein-Liganden-Wechselwirkungen zu liefern. Winkelaar und Kollegen8 verwenden die Technik, um die Interaktion von zwei Proteinen (Vimentin und Envoplakin) zu untersuchen, die in Desmosomen vorkommen, Zellstrukturen, die an der Zell-zu-Zell-Adhäsion beteiligt sind und typischerweise in Geweben zu finden sind, die starker mechanischer Belastung ausgesetzt sind. Die Autoren verwenden eine 15N-markierte Vimentin-Domäne und erfassen ein 2D-Spektrum mittels heteronukleärer Einzelquantenkorrelation (HSQC). In Gegenwart einer Domäne aus Envoplakin werden eine ausgedehnte Linienverbreiterung und ein Verschwinden des Peaks beobachtet, was mit einer Proteininteraktion übereinstimmt. Die Autoren untersuchen außerdem die Grundlagen der Interaktion mit Hilfe von Mutagenese und mikroskaliger Thermophorese (MST), um quantitative Informationen zu liefern.
Die Kleinwinkel-Röntgenstreuung (SAXS) ist eine Technik, die verwendet werden kann, um Informationen über die Größe und Konformationen eines Makromoleküls in Lösung zu liefern und eine molekulare Hülle aus großen, Mehrdomänen- oder Proteinkomplexen mit geringer Auflösung zu erzeugen. Im Protokoll von Mrozowich et al.9 wird die Technik verwendet, um eine niedrig aufgelöste Struktur von Nidogen-1 und Laminin γ-1 im Komplex zu erzeugen. Die Technik könnte für Forscher von Interesse sein, die PPIs in großen Proteinen mit mehreren globulären Domänen untersuchen, die für die NMR-Spektroskopie zu groß sind und für die Röntgenkristallographie nur schwer zu kristallisieren sind.
Es wird geschätzt, dass es etwa 650.000 Wechselwirkungen im menschlichen Interaktomgibt 10 – genug, um die Forscher auf diesem Gebiet noch einige Zeit zu beschäftigen. Eine neuere Entwicklung, die durch Fortschritte in der Mikroskopie, Massenspektrometrie und dem maschinellen Lernen ermöglicht wurde, ist die räumliche Proteomik, die in Zukunft große Erkenntnisse in diesem Bereich liefern könnte11. Diese Sammlung von PPI-Methoden wird Forschern helfen, diese wichtige Herausforderung zu bewältigen und gleichzeitig potenzielle Fallstricke zu vermeiden.