Method Article

Charakterisierung auf molekularer Ebene mit robusten biochemischen Ansätzen eines neuen Kinase-Proteins

DOI:

10.3791/59820

⸱

June 30th, 2019

 ,  ,  , 
1Centre de Biophysique Moléculaire, CNRS, UPR 4301, University of Orléans and INSERM

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir charakterisierten ein neues Kinase-Protein mit robusten biochemischen Ansätzen: Western Blot-Analyse mit einem speziellen Antikörper an verschiedenen Zelllinien und Geweben, Wechselwirkungen durch Coimmunozipitungsexperimente, Kinase-Aktivität, die von Western Blot mit einem phosphospezifischen Antikörper und durch die ATP-Kennzeichnung von32P.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die umfangreiche Sequenzierung des gesamten Genoms hat viele Open Reading Frames (ORFs) identifiziert, die viele potenzielle Proteine liefern. Diese Proteine können wichtige Rollen für die Zelle spielen und neue zelluläre Prozesse entwirren. Unter den Proteinen sind Kiinasen wichtige Akteure, da sie zu Zellsignalwegen gehören und die Fähigkeit haben, viele Prozesse ein- oder auszuschalten, die für das Schicksal der Zelle entscheidend sind, wie Zellwachstum, Teilung, Differenzierung, Beweglichkeit und Tod.

In dieser Studie konzentrierten wir uns auf ein neues potenzielles Kinase-Protein, LIMK2-1. Wir haben seine Existenz durch Western Blot mit einem spezifischen Antikörper demonstriert. Wir haben seine Wechselwirkung mit einem vorgelagerten regulierenden Protein anhand von Coimmunopräzipitationsexperimenten bewertet. Coimmunoprecipitation ist eine sehr leistungsfähige Technik, die in der Lage ist, die Wechselwirkung zwischen zwei Zielproteinen zu erkennen. Es kann auch verwendet werden, um neue Partner eines Köderproteins zu erkennen. Das Köderprotein kann entweder über ein auf seine Sequenz konstruiertes Tag oder über einen Antikörper gereinigt werden, der speziell auf es abzielt. Diese Proteinkomplexe können dann durch SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamidE Gel) getrennt und mittels Massenspektrometrie identifiziert werden. Immunpräzipitor LIMK2-1 wurde auch verwendet, um seine Kinase-Aktivität in vitro durch die ATP-Kennzeichnung zu testen. Dieser etablierte Assay kann viele verschiedene Substrate verwenden, und mutierte Versionen des Köders können verwendet werden, um die Rolle spezifischer Rückstände zu beurteilen. Die Wirkung pharmakologischer Wirkstoffe kann ebenfalls bewertet werden, da diese Technik sowohl hochsensibel als auch quantitativ ist. Dennoch erfordert die Behandlung von Radioaktivität besondere Vorsicht. Die Kinase-Aktivität kann auch mit spezifischen Antikörpern bewertet werden, die auf die Phosphogruppe der modifizierten Aminosäure abzielen. Diese Arten von Antikörpern sind nicht für alle phosphomodifizierten Rückstände kommerziell erhältlich.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seit vielen Jahrzehnten werden zahlreiche Signalwege aufgeklärt und ihre Beteiligung an entscheidenden zellulären Prozessen wie Zellteilung, Differenzierung, Beweglichkeit, programmiertem Zelltod, Immunität und Neurobiologie gezeigt. Kinasen spielen eine wichtige Rolle in diesen Signalwegen, da sie oft ihre Aktivierung oder Inaktivierung fein regulieren und Teil vorübergehender vielseitiger Komplexe sind, die auf äußere Reize reagieren1,2,3. Mutation und Dysregulation von Kiinasen führen oft zu Krankheiten beim Menschen, und sie sind daher zu einem der wichtigsten Drogenziele in den letzten vierzig Jahrengeworden 4.

In diesem Zusammenhang ist es wichtig, die Kinase-Wechselwirkung mit ihren vorgelagerten Regulatoren oder nachgelagerten Substraten erkennen zu können und neue Partner zu identifizieren. Affinitätsreinigung und Immunpräzipitation sind sehr leistungsfähige Techniken zur Isolierung von Proteinkomplexen5. Das Köderprotein oder die Ködernase kann mit einer bestimmten Peptidsequenz markiert werden, die die Verwendung von kommerziellen Perlen kovalent gekoppelt mit Antikörpern ermöglicht, die auf das Peptid abzielen. Dieses Material ermöglicht eine hohe Reproduzierbarkeit in den Experimenten6,7,8. Endogene Proteine können auch mit Antikörpern immunpräzipiert werden, die direkt auf das Köderprotein abzielen. Die Antikörper können mit Protein A oder Protein G Agarose Perlen vernetzt oder einfach mit diesen Perlen vor der Zugabe von Lysat inkubiert werden. Lysepuffer müssen optimiert werden, um eine Proteinlösung ohne Wechselwirkung zu ermöglichen und den Proteinabbau zu vermeiden. Ein großer Nachteil dieses Ansatzes ist, dass die Wechselwirkung bei der Zelllyse erkannt wird; daher können vorübergehende oder schwache Wechselwirkungen zusammen mit solchen, die einen subzellulären Kontext erfordern, übersehen werden. Andere Techniken können verwendet werden, um direkt in der Zelle zu arbeiten, wie Proximity Ligation Assay (PLA)9, in vivo cross-linking-assisted affinity purification (XAP)10, Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) oder Förster Resonance Energy Transfer (FRET)11,12. Darüber hinaus ist die Immunpräzipitation nicht geeignet, die thermodynamischen Konstanten der Bindung zu bestimmen, für die physikalische Techniken wie Surface Plasmon Resonance, Isothermale Titrationskalorimetrie oder Mikroskalige Thermophorese erforderlich sind. 13,14.

Die Kinase-Aktivität kann mit mehreren Techniken bewertet werden. Dabei konzentrierten wir uns auf phosphospezifische Antikörperund in vitro-ATP-Etikettierung (Adenosin-TriPhosphat). Phosphospezifische Antikörper zielen auf die Phosphatmodifikation eines bestimmten Rückstands innerhalb eines Proteins ab. Sie können in Western Blot oder ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) nach der Zelllyse, für die Immunhistochemie und auch auf intakten Zellen mit Durchflusszytometrie oder Immunfluoreszenz verwendet werden. Ihre Nachteile können ihr Mangel an Spezifität sein, die mit einer mutierten Version des Zielproteins bewertet werden kann, und sie sind nicht kommerziell für alle Proteine verfügbar. Die In-vitro-ATP-Kennzeichnung ist eine sehr robuste, etablierte und hochempfindliche Methode15. Immunpräzipierte oder rekombinante Proteine können verwendet werden, und verschiedene Substrate können getestet werden. Die Wirkung von Arzneimitteln kann auch bewertet werden, da diese Methode quantitativ ist. Sein Hauptnachteil ist, dass die Radioaktivität, die mit dem Ansatz verbunden ist, einen vorsichtigen Umgang erfordert. Alternative Methoden sind auch möglich, basierend auf der Messung von fluoreszierenden oder lumineszierenden Peptidsubstraten und unter Ausnutzung veränderter fluoreszierender/lumineszierender Eigenschaften bei phosphorylierter Phosphorylierung. Solche Methoden ermöglichen auch einen hohen Durchsatz, der z. B. beim Screening von Molekülen erforderlich ist, die potenzielle Inhibitoren der Zielkinase sein können. Tatsächlich stellen Kinasen eine der größten Klassen von Arzneimittelzielen dar, die von Pharmaunternehmen verfolgt werden16.

In dieser Studie konzentrierten wir uns auf das LIMK2-1 Protein (LIMK2-1 steht für Lin11, Isle1, Mec3 Kinase isoform 2-1). Das LIMK2-Kinase-Protein wurde erstmals1995 17 beschrieben. Durch alternatives Spleißen werden drei Isoformen von LIMK2 hergestellt: LIMK2a, LIMK2b und LIMK2-1. Derzeit wurde LIMK2-1 nur auf mRNA-Ebene in einer einzigen Studie18beschrieben. Hierbei charakterisieren wir dieses potentielle neue Kinase-Protein auf molekularer Ebene mit robusten biochemischen Ansätzen. Erstens zeigen wir, dass LIMK2-1 tatsächlich synthetisiert ist. Ähnlich wie seine beiden Pendants LIMK2a und LIMK2b interagiert es mit der vorgelagerten Kinase ROCK (Rho-assoziierte Proteinkinase). Wir zeigen, dass LIMK2-1 eine Kinase-Aktivität auf Myelin Basic Protein (MBP) hat, aber nicht auf Cofilin, dem kanonischen Substrat von LIM-Kinasen.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zellvorbereitung zur Transfektion

VORSICHT: Alle Schritte der Zellkultur müssen in einem speziellen Labor durchgeführt werden, und Zellen werden in einem mikrobiologischen Schrank der Klasse 2 manipuliert.

  1. Samen HEK-293 (Human Embryonic Kidney) Zellen in 10 cm Platten in 10 ml DMEM (Dulbecco es Modified Eagles Medium) ergänzt durch 10% fetales Kalbsserum. Kultur für 3 bis 5Tage unter 5% CO2 , bei 37 °C, bis die Zellen 90% Zusammenfluss erreichen.
  2. Behandeln Sie platten von 10 cm mit Kollagen R, um die Zellhaftung an den Kunststoffplatten zu erhöhen.
    1. Fügen Sie 5 ml einer Lösung von Kollagen R, 200-fach in Phosphat-Saline-Puffer (PBS) in einer Platte von 10 cm verdünnt. Überlagern Sie die Flüssigkeit über die gesamte Oberfläche der Platte.
    2. Bei Raumtemperatur mindestens 1 h im Biosicherheitsschrank inkubieren.
    3. Entfernen Sie die Kollagenlösung, und entsorgen Sie sie. Fügen Sie 5 ml PBS hinzu, verteilen Sie es über die gesamte Oberfläche der Platte, entfernen Sie sie und entsorgen Sie sie. Wiederholen Sie diese Wäsche einmal.
    4. Fügen Sie 8 ml DMEM hinzu, ergänzt mit 10% fetalem Kalbsserum. Bewahren Sie die vorbereiteten Platten im Biosicherheitsschrank auf.
  3. Nehmen Sie DIE HEK-293-Platten aus Schritt 1.1 innerhalb des Biosicherheitsschranks. Entfernen Sie das Medium von den Platten und entsorgen Sie es in einem speziellen Bleichmüll. Fügen Sie 2 ml ergänztes DMEM hinzu, und spülen Sie die Zellen, um sie mit dem Fluss einer 1 ml Mikropipette zu lösen, wobei Darauf zu achten ist, dass Schaum vermieden wird.
  4. Sammeln Sie die Zellen in einem 15 ml Rohr und fügen Sie 4 ml ergänztes DMEM hinzu. Homogenisieren Sie mit einer 10 ml Pipette, indem Sie 3 Mal nach oben und unten pfeifen.
  5. Nehmen Sie 2 ml dieser Zelllösung und fügen Sie sie zu kollagenbehandelten Platten hinzu, die ergänztes DMEM ab Schritt 1.2.4 enthalten.
  6. Wachsen Sie 24 Stunden im Inkubator bei 5% CO2 und 37 °C. Die Zellen sollten zum Zeitpunkt der Transfektion 50-80% konfluent sein.

2. Transiente Transfektionen

  1. Entfernen Sie das Medium von den Platten, entsorgen Sie es in einem speziellen Bleichmüll und fügen Sie 10 ml frisch ergänztes DMEM hinzu. Legen Sie die Platten bei 37 °C wieder in den Inkubator, während Sie die Transfektionsmischung vorbereiten.
  2. In einem 15 ml-Rohr 450 l einer 10 mM Tris-HCl pH 7,5/1 mM EDTA (Tris steht für Tris(Hydroxymethyl)aminomethan und EDTA für Ethylenedinitrilotetraessigsäure) und 50 l einer 2,5 M CaCl 2-Lösung. Mix durch Inversion.
  3. Fügen Sie 10 g plasmidische DNA (Deoxyribonukleinsäure) hinzu, die aus einer Midi-Zubereitung auf einer flüssigen Bakterienkultur hergestellt wird, die mit dem speziellen Plasmid transformiert wird. Mix durch Inversion.
  4. Unter glatter Rührung auf einem Wirbel 500 l BES gepuffertes Saline-2x-Konzentrat hinzufügen (Zusammensetzung: BES, 10,7 g/L, NaCl, 16,0 g/L, Na2HPO4, 0,27 g/l; BES steht für N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonsäure, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine) langsam Tropfen für Tropfen.
  5. Mindestens 15 min (bis zu 45 min) bei Raumtemperatur im Biosicherheitsschrank inkubieren. Wirbel nicht, nicht mischen! Bewegen Sie die Rohre sehr vorsichtig, um die komplexe Bildung zwischen DNA und Calciumphosphat nicht zu stören.
  6. Nehmen Sie die Platten von Schritt 2.1 bis zum Sicherheitsschrank. Fügen Sie die DNA-Komplexe sehr sorgfältig, Tropfen für Tropfen, auf die Zellen auf der ganzen Oberfläche der Platte.
  7. 24 bis 72 Stunden im Inkubator bei 37 °C inkubieren. In der Regel wird die maximale Proteinexpression innerhalb von 48 Stunden erreicht.

3. Lysis

HINWEIS: Arbeiten Sie auf Eis und mit kalten Puffern, um den Proteinabbau zu verhindern.

  1. Vorbereiten des Lysepuffers: 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50 mM NaF, 10 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM Na3VO4, 20 mMP p-Nitrophenylphosphat, 20 mM , 1 g/ml Leupeptin und 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid). Für jede transfizierte Platte werden ca. 4 ml Lysepuffer benötigt.
  2. Entfernen Sie Platten mit transfizierten Zellen aus dem Inkubator. Legen Sie sie auf Eis.
    HINWEIS: Ab diesem Schritt ist es möglich, auf einer "normalen" Bank zu arbeiten.
  3. Entfernen Sie das Medium, und entsorgen Sie es in einem speziellen Bleichmüll.
  4. Zweimal mit 3 ml kaltem PBS waschen: 3 ml PBS auf der Seite der Platte Tropfen für Tropfen hinzufügen, um zu vermeiden, transfizierte Zellen zu lösen, über die gesamte Oberfläche der Platte zu verteilen, PBS zu entfernen und zu entsorgen; Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal. Entfernen Sie am Ende vorsichtig den Rest von PBS, indem Sie die Platte kippen, um eine Verdünnung des Lysepuffers für den nächsten Schritt zu verhindern.
  5. Fügen Sie 500 l kaltlysePuffer auf die transfizierten gewaschenen Zellen hinzu. Verteilen Sie es über die gesamte Oberfläche der Platte.
  6. 10 min auf Eis bebrüten. Von Zeit zu Zeit (mindestens zweimal) den Puffer wieder über die Oberfläche der Platte verteilen.
  7. Verschrotten Sie die Zellen und sammeln Sie sie in einem Mikrozentrifugenrohr.
  8. Zentrifuge für 10 min bei 10.000 x g bei 4 °C.
  9. Sammeln Sie Überstand in einem neuen Mikrozentrifugenrohr. Dieser Anteil entspricht dem Lysat (Vollzellextrakt). Entsorgen Sie das Pellet, das Zellmembranablagerungen entspricht.
  10. Sammeln Sie ein Aliquot dieser Fraktion in einem neuen Mikrozentrifugenrohr (ca. 50 l). Dieser Anteil entspricht der "TOTAL-Fraktion" oder "Zelllysat" oder "Ganzzellextrakt", die eine Analyse ermöglicht, ob transfizierte Proteine durch Western Blot exprimiert werden.
    HINWEIS: An dieser Stelle können Proben direkt für Western Blot-Analysen verwendet werden. Der Laemmli-Puffer muss der Probe zugesetzt werden, die dann bei 95 °C für 5 min erhitzt, bei 10.000 x g für 5 min zentrifugiert und auf entsprechende SDS-PAGE geladen wird. Proben können auch bei -80 °C gelagert werden.

4. Immunitizipation

  1. Heben Sie Agaroseperlen in Verbindung mit dem entsprechenden Antikörper sanft aus: HA (Human Influenza Hemagglutinin), Flag oder GFP (Green Fluorescent Protein) durch sanfte Inversion.
  2. Schneiden Sie das Ende einer 200-L-Spitze aus einer Mikropipette, damit Perlen in die Spitze gelangen können. Pipette die Perlen auf und ab mehrmals, um die Spitze zu sättigen, um sicherzustellen, dass das richtige Volumen der Perlen zu nehmen.
  3. Nehmen Sie 40 L Perlen in einem Mikrozentrifugenrohr ein.
  4. Fügen Sie den TENET-Puffer (30 mM Tris-HCl pH 7.5, 120 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100) um 500 l zu. Mix durch Inversion. Zentrifuge für 2 min bei 1.000 x g bei 4 °C. Entfernen Sie sorgfältig Überstand und entsorgen Sie es. Fügen Sie 500 L VON TENET hinzu. Mindestens 1 Stunde bei 4 °C auf einem rotierenden Rad inkubieren.
    HINWEIS: Dieser Schritt vor der Inkubation in TENET ermöglicht es, unspezifische Interaktionen zu reduzieren und so das Hintergrundsignal zu verringern.
  5. Waschen Sie die Perlen zweimal mit 500 l Lysepuffer.
    1. Zentrifuge 2 min bei 1.000 x g bei 4°C.
    2. Entfernen Sie sorgfältig Überstand Puffer, und verwerfen Sie es.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, während dieser Waschschritte keine Perlen zu aspirieren.
    3. Fügen Sie 500 L Lysepuffer hinzu. Homogenisieren Sie durch Invertieren des Rohres.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 4.5.1- 4.5.3.
  6. Zentrifuge für 2 min bei 1.000 x g bei 4°C. Entfernen Sie vorsichtig den Überstandspuffer, und verwerfen Sie ihn.
  7. Inkubieren Sie Perlen mit dem Lysat von Schritt 3.9 für 2 bis 4 Stunden bei 4 °C auf einem rotierenden Rad.
  8. Waschen Sie immunvorzipitierte Perlen.
    HINWEIS: An dieser Stelle können die immunpräzipierten Perlen fünfmal mit dem Lysepuffer gewaschen und dann mit dem Laemmli-Puffer eluiert werden. Das Eluat kann für Western Blot-Analysen verwendet oder bei -80 °C gelagert werden. Alternativ können Perlen zweimal mit dem Lysepuffer und dann dreimal mit dem Kinase-Puffer gewaschen werden, um die ATP-Kennzeichnung von32P durchzuführen.

5. Coimmunozipitationsanalysen

  1. Immunpräzipitierte Perlen ab Schritt 4.7 mit dem Lysepuffer waschen.
    1. Zentrifuge für 2 min bei 1.000 x g in einer gekühlten Zentrifuge bei 4 °C.
    2. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und entsorgen Sie ihn.
    3. Fügen Sie 500 L Lysepuffer hinzu. Homogenisieren Sie durch Invertieren des Rohres.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 5.1.1-5.1.3 viermal.
  2. Elution
    1. Zentrifuge für 2 min bei 1.000 x g in einer gekühlten Zentrifuge bei 4 °C.
    2. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und entsorgen Sie ihn. Entfernen Sie die letzten Tropfen des Überstandes mit einer Hamilton-Spritze, um das Streben der Perlen zu vermeiden, und entsorgen Sie den Überstand.
    3. 40 L 4x Laemmli Puffer hinzufügen (200 mM Tris/HCl pH 6.8, 4% SDS, 40% Glycerin, 0,5 M '-Mercaptoethanol, 0.02% Bromophenolblau). Homogenisieren Sie durch sanftes Antippen des Rohres.
    4. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    5. Zentrifuge für 5 min bei 10.000 x g bei Raumtemperatur.
    6. Mit einer Hamilton-Spritze den Überstand entfernen und in einem neuen Mikrozentrifugenrohr sammeln. Dieser Anteil entspricht dem "Eluat", das bei -80 °C gelagert oder direkt von Western Blot analysiert werden kann.

6. Kinase-Assay

  1. Bereiten Sie den Kinasepuffer vor: 50 mM HEPES-NaOH pH 7.5 (HEPES steht für 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsäure), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM MnCl2, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 20 mM bei Glycerophosphat, 1 g/mL Leupeptin und 1 mM PMSF. Für jede Immunpräzipitationsbedingung werden ca. 2 ml des Kinasepuffers benötigt.
  2. Waschen Sie immunpräzipierte Perlen aus Schritt 4.7 zweimal mit 500 l Lysepuffer.
    1. Zentrifuge für 2 min bei 1.000 x g in einer gekühlten Zentrifuge bei 4 °C.
    2. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und entsorgen Sie ihn. Fügen Sie 500 L Lysepuffer hinzu. Homogenisieren durch Inversion.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 6.2.1 und 6.2.2.
  3. Waschen Sie immunpräzipierte Perlen dreimal mit 500 l Kinasepuffer.
    1. Zentrifuge für 2 min bei 1.000 x g in einer gekühlten Zentrifuge bei 4 °C.
    2. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und entsorgen Sie ihn. Fügen Sie 500 l Kinase-Puffer hinzu. Homogenisieren durch Inversion.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 6.3.1 und 6.3.2 zweimal.
  4. Zentrifuge für 2 min bei 1.000 x g in einer gekühlten Zentrifuge bei 4 °C.
  5. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und entsorgen Sie ihn. Entfernen Sie die letzten Tropfen des Überstandes mit einer Hamilton-Spritze, um das Streben der Perlen zu vermeiden, und entsorgen Sie den Überstand.
  6. Fügen Sie den immunvoreiligen Perlen 40 L Kinasepuffer hinzu. Setzen Sie die Perlen wieder auf, indem Sie sanft auf das Rohr tippen.
  7. Bereiten Sie die Mischungfür die ATP-Etikettierung von 32 P in einem sicheren Verriegelungsrohr vor (Endvolumen beträgt 22,5 l, komplett mit Kinase-Puffer).
    1. Fügen Sie das erforderliche Volumen des Kinasepuffers hinzu, um ein Endvolumen von 22,5 l zu erreichen.
    2. Schneiden Sie das Ende einer 20-L-Spitze einer Mikropipette. Setzen Sie die immunpräzipierten Perlen aus Schritt 6.6 wieder auf, indem Sie mehrmals nach oben und unten pfeifen. Sammeln Sie 10 L dieser Perlen in das Safe-Lock-Rohr.
    3. Fügen Sie ATP aus einer 10-M-Lagerlösung hinzu, um eine Endkonzentration von 50 mM zu erreichen. Je nach Anzahl der behandelten Proben wird eine Verdünnung der ATP-Stammlösung im Kinase-Puffer vorgeschlagen, um pipette 1 bis 2 l zu ermöglichen, um sicherzustellen, dass das Volumen korrekt ist.
    4. Fügen Sie im vorliegenden Studienfall 2,5 g Substrat (Cofilin oder Myelin Basic Protein, MBP) hinzu.
  8. Fügen Sie 5 'Ci von '[32P] ATP (3.000 Ci/mmol) hinzu, um die Reaktion zu initiieren. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten langsam.
    VORSICHT: Ab diesem Zeitpunkt muss an einem Sicherheitsort für Radioaktivitätsmanipulationen mit vorsichtshalber Vorsicht, speziellem Schutz und geeigneten Kontrollen (radioaktive Schutzschilde, Geigerzähler, spezifische Abfallsammlung, persönliche Brust und Fingerabzeichen zur Erkennung radioaktiver Exposition, Filterspitzen).
  9. 20 min bei 30 °C inkubieren.
  10. Stoppen Sie die Reaktion mit 6 l 5x Laemmli Puffer.
  11. Erhitzen Bei 95° C für 5 min.
  12. Zentrifuge bei 10.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
  13. Laden Sie eine SDS-PAGE. Fahren Sie mit der Migration fort.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, dassdie Frontlinie des kostenlosen ATP das Gel nicht verlässt, um eine Kontamination des Migrationstanks zu vermeiden.
  14. Das Gel bei Raumtemperatur färben.
    1. Entfernen Sie das Gel von den Glasplatten.
    2. Fahren Sie mit drei Bädern im Wasser bei Raumtemperatur fort.
    3. Das Gel über Nacht mit Coomassie Blue bei Raumtemperatur färben.
    4. Das Gel mit mehreren Waschbädern mit Wasser bei Raumtemperatur entsalzen.
  15. Wickeln Sie das Gel mit Plastikfolie.
  16. Stellen Sie sie für eine oder mehrere Nächte auf einem Phosphorimager-Bildschirm zur Unterlegen.
  17. Lesen Sie den Bildschirm auf einem Phosphorimager, um beschriftete Bänder zu erkennen.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LIMK2-1 Protein wird synthetisiert
LIMK2-1 wird in Datenbanken erwähnt, aber bisher hat nur ein Papier die Existenz seiner mRNA18gezeigt. Im Vergleich zu seinen beiden Homologen LIMK2a und LIMK2b verfügt LIMK2-1 über eine zusätzliche C-Terminal-Domäne, die als Proteinphosphatase 1 Inhibitory Domain (PP1i) identifiziert wurde. Wir haben einen Antikörper entwickelt, der auf ein Peptid dieser Domäne abzielt, Aminosäuren 671-684 (

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hierbei haben wir robuste biochemische Werkzeuge eingesetzt, um auf molekularer Ebene ein neues Protein, LIMK2-1, zu charakterisieren, von dem angenommen wird, dass es sich um eine Kinase handelt, die auf ihrer Sequenz und ihren Homologen LIMK2a und LIMK2b20basiert.

Erstens haben wir die Existenz von LIMK2-1 auf Proteinebene anhand der Western Blot-Analyse mit einem spezifischen Antikörper nachgewiesen. Anschließend evaluierten wir seine Wechselwirkung mit der vorgelage...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde unterstützt von La Ligue contre le Cancer, l'Association Neurofibromatoses et Recklinghausen und la Région Centre Val de Loire. Vielen Dank an Aurélie Cosson und Déborah Casas für Flow-Zytometrie-Daten und an Keyron Hickman-Lewis für das gründliche Korrekturlesen des Manuskripts.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Antikörper Anti-AktinSigma-AldrichA1978für Western Blot
Antikörper anti-c-MycInvitrogenMA1-21316für Western Blot
Antikörper anti-cofilinZellsignaltechnologie3312/5175für Western Blot
Antikörper anti-GFPSanta Cruzsc-9996für Western Blot
Antikörper anti-HARoche Applied Science11687423001für Western Blot
Antikörper Anti-Phospho-CofilinZellsignaltechnologie3313für Western Blot
Antikörper Anti-PP1iEurogentecfür diese Studie entwickelt fürWestern Blot
AprotininEuromedexA-162Bfür Lysepuffer
ATPInvitrogenPV3227für γ[ 32P] Beschriftung
γ[ 32P] ATPPerkin ElmerNEG502Afür γ[ 32P] Markierung
von BES-gepufferter KochsalzlösungSigma-Aldrich14280für die Transfektion
β-GlycerophosphatSigma-AldrichG9422für Lyse- und Kinasepuffer
β-MercaptoethanolSigma-AldrichM3148für Laemmli
BSASigma-AldrichA3059für Blockierungspuffer
Bromophenol BlueSigma-AldrichB0126für Laemmli
CaCl2Sigma-AldrichC3881für die Transfektion
ZentrifugeSigma111-541
Collagen RPan BiotechP06-20166für Transfektion
Kontrolle siRNAAmbionAM4611für PP1i Antikörperspezifität
Coomassie PageBlue Protein-FärbelösungThermo-Fisher24620für die Gelfärbung
EDTASigma-Aldrich3690für Lysepuffer
ElektrophoreseeinheitBioradMini-Proteanfür Western Blot
EZview Rotes Anti-HA-AffinitätsgelSigma-AldrichE6779für Immunpräzipitation
GeneSys-SoftwareOzymefür den Erwerb von Western Blot
GeneTolls-SoftwareOzymefür die Western-Blot-Quantifizierung
GFP-Trap-Kügelchen,Chromtekfür die Immunpräzipitation
, GlycinEuromedex26-128-6405für Transferpuffer
GST-Cofilin,Upstate Cell Signaling12-556für γ[ 32P] Markierung
Hamilton Spritze 100 mLHamilton710zur schonenden Entfernung von Überständen aus den Kügelchen, ohne sie zu aspirieren
HEPESSigma-AldrichH3375für Kinasepuffer
ImageQuant TL SoftwareGE Healthcarefür die Erfassung und Quantifizierung von Radioaktivität
LIMK2 siRNAAmbions8191für PP1i Antikörperspezifität
LeupeptinSigma-AldrichSP-04-2217für Lyse- und Kinasepuffer
MBPUpstate Cell Signalisierung13-173für γ[ 32P] Markierung von
MgCl2Sigma-AldrichM8266für Kinasepuffer
MnCl2Sigma-Aldrich244589für Kinasepuffer
NaClEuromedex1112für Lyse und Kinasepuffer
NaFSigma-AldrichS-1504für die Lyse und Kinasepuffer
Okaidic SäureEuromedex0-2220für Lysepuffer
PMSFSigma-Aldrich78830für Lyse- und Kinasepuffer
p-NitrophenylphosphatEuromedex1026für Lysepuffer
PVDF-Membran Immobillon-PMerck-MilliporeIPVH00010 Porengröße 0,45 mmfür Western Blot
DrehradLabincofür die Perlinkubation
Safe lockeppendorf Eppendorf0030120.086für Kinase-Assay
SDSSigma-Aldrich5030für Laemmli und Migrationspuffer
NatriumorthovanadatLC LaboratoriesS8507für Lyse- und Kinasepuffer
NatriumpyrophosphatFluka71501für Lysepuffer
Super Signal West DuraProtein Biology34075für Western Blot
Syngene PxiOzymefür Western Blot
Gewebeextrakte

 		Biochain

 		P1234035 Gehirn
P12345152 Lunge
P1234149 Leber
P1234188 Bauchspeicheldrüse
P1234260 Hoden		für die Western-Blot-Analyse

 
TransfereinheitBioradMini-Trans-Blotfür Western Blot
TrisEuromedex26-128-3094 Bfür Lysepuffer
Tween-20Sigma-AldrichP7949für Blockierungspuffer
Typhoon FLA9500GE Healthcarezum Lesen von Autoradiographien
Typhoon TrioAmersham Biosciencezum Lesen von Autoradiographien
Whatman-PapierGE Healthcare3030-672für Western Blot
, , , ,

References

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  1. Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).
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