Manipulation von Farbmusterern bei Jumping-Spidern für den Einsatz in Behavioral Experiments

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Farbmuster von Springspinnen und anderen sehr kleinen Arthropoden mit Farbe zu manipulieren, um Fragen im Zusammenhang mit sexueller Selektion, sexuellem Kannibalismus, Raubbau, Aposematismus oder einem anderen Bereich der Tierfärbung zu untersuchen.

Zusammenfassung

Im Bereich der Verhaltensökologie sind viele Experimente darauf ausgelegt, die evolutionären Zwecke von bunten Merkmalen im Kontext sexueller Selektion und Raubbau zu untersuchen. Methoden sind vielfältig, bestehen aber meist aus der Veränderung der Farbmuster von Individuen mit verschiedenen Farbstoffen. Solche Techniken wurden in vielen Wirbelsteuernstonen eingesetzt, vor allem bei Vögeln, sind aber wegen der Schwierigkeit, die Farbe in kleinen Organismen effektiv zu manipulieren, für Wirbellose unterentwickelt geblieben. Stattdessen haben Wissenschaftler, um das Auftreten von Wirbellosen zu manipulieren, in der Regel die Beleuchtungsumgebung verändert, um bestimmte Wellenlängen herauszufiltern. Eine solche Methode betrifft jedoch nicht nur das phänotypische Merkmal von Interesse, sondern das gesamte Erscheinungsbild des Individuums und seiner Umgebung. Hier, indem wir die Techniken, die früher auf bunten Vögeln verwendet wurden, scalieren, präsentieren wir Möglichkeiten, die Farben der kleinen Arthropoden zu manipulieren, indem wir ebenso emblematische, aber untersuchte Arten verwenden: Die bunten Springspinnen.

Einleitung

Tiere haben oft aufwendige Farbmuster, die sie während sexueller Begegnungen, agonistischer Begegnungen oder zur Abschreckung von Raubtieren zeigen. Diese Eigenschaften können Informationen an Empfänger weitergeben, wie zum Beispiel die individuelle Qualität des Signaler als Kumpel1, die Kampffähigkeit^alsKonkurrent 2 oder die Schmackhaftigkeit alsBeutestubjekt. Um die adaptiven Ziele von bunten Eigenschaften zu verstehen, haben die Forscher Experimente entworfen, bei denen Farben auf verschiedene Weise manipuliert werden. Einige Forscher haben farbige Decoy-Reize wie Modelle^4,5, 6^{, 7,8,Fotos9}, oder Videos 10,11^{, 12,} die den Empfängern in Verhaltensexperimenten präsentiert werden. Andere, vor allem bei der Verwendung von Wirbellosen, haben die Beleuchtung manipuliert, um das Aussehen der Farben^vonlebenden Personen 13, 14^,15,16 , ¹⁷. All diese Manipulationen haben, obwohl sie genial sind, den Nachteil, dass sie potenziell wichtiges natürliches Verhalten entfernen und/oder viel mehr beeinträchtigen als das Merkmal des Interesses. Bei großen Wirbeltieren, wie Vögeln, manipulieren Forscher sehr oft Farbe direkt an lebenden Tieren (rezensiert in Hill und McGraw, 2006¹⁸). Einzelne Federn oder Schnäbel wurden direkt mit Markierungen^{2, 19,20,}21, 22^,23,24, Heilstoffperoxid^,die häufig in Haarrechtwärtern 25^,26^{, 27 oder}verschiedenen Farben^,einschließlich Nagellack 28,^verwendetwerden. Bei Wirbellosen sind solche Studien, die Farbmuster direkt an lebenden Tieren manipulieren, vergleichsweise selten, haben aber immer noch einen immensen Einblick in die Funktion und Entwicklungder Farbe 29,30^,31gegeben. ^{,32,33, 34,35, 36,37,}38^,39. Selbst Arthropodenstudien scheinen in Richtung größerer Taxa voreingenommen zu sein, die leichter zu handhaben und zu lackieren sind, so dass Farbmuster bei sehr kleinen Arten relativ unteruntersucht werden.

Hier beschreiben wir eine delikate Farbmanipulationstechnik, die für sehr kleine tierische Taxa entwickelt wurde. Konkret geht es bei dieser Methode darum, die Gesichtsfärbung männlicher Springspinnen unter dem Mikroskop zu manipulieren, um die Bedeutung solcher farbenfrohen Merkmale im Kontext von Mate-Wahl und sexuellem Kannibalismus zu untersuchen. In diesem Fall haben wir Habronattus pyrrithrix (gesammelt aus Phoenix, AZ, USA) als Modellart verwendet (Abbildung1). Wir haben die Ergebnisse der experimentellen Arbeit mit einigen dieser Techniken an anderer^Stelle38^,39veröffentlicht, aber hier beschreiben wir die Methoden detaillierter als bisher, in einer Weise, die sie für andere zugänglich machen sollte. Der Versuch, sie zu replizieren oder für den Einsatz auf anderen sehr kleinen Taxa anzupassen. Solche Protokolle sollten Versuchsmöglichkeiten für Tiere eröffnen, die so bunt sein können wie die emblematischsten Vögel, die aber meist unteruntersucht werden.

Protokoll

1. Gerätevorbereitung

1. Wählen Sie die passenden Farben aus.
   1. Für eine erfolgreiche Anwendung verwenden Sie Farben, die schnell trocknen und eine leicht mit dünner manipulierbare Textur haben. Zu den Produkten, die erfolgreich eingesetzt wurden, gehören nicht-wasserdichte Wimpern, die mit Wasser verdünnt werden können, und Emaillefarben, die mit Emaille-Dünner verdünnt werden können (Materialtafel).
   2. Wenn man Spinnen bemalt, sollte man bedenken, dass der Panzer der meisten Arten ein gehärtetes Exoskelett hat, während sich der weiche Bauch oft ausdehnt und mit der Fütterung von⁴⁰verengt.
      1. Emailfarben erzeugen eine feste, gehärtete Beschichtung auf der lackierten Oberfläche; Deshalb auf harte Teile der Kutikel (z.B. Karpfen, Beine, Pedimpapfen) auftragen. Solche Emaille-Beschichtungen sind bei Spinnentücher weniger wirksam, da sie sich von der Spinne abschälen, da der Bauch mit der Fütterung die Form ändert.
      2. Im Gegensatz dazu produzieren die Lickiner keine gehärtete Beschichtung, sondern sickern in die farbigen Körperwaagen ein; Verwenden Sie sie als solche sowohl auf harten als auch auf weichen Körperteilen (einschließlich Spinnentabinchen).
         NOTE: In den kommenden Schritten wird die feinste Technik präsentiert, die darin besteht, das Gesicht und die Pedipalps der Spinnen zu bemalen; Es wird Emaille-Farbe verwendet, was aufgrund der Farbvielfalt der verfügbaren Emaille-Farbe die verallgemeinerendste Methode ist.
   3. Bevor Sie Farben an lebenden Tieren testen, sollten Sie, wenn möglich, zunächst die spektralen Eigenschaften der Farbe (einfach auf Papier oder eine andere Oberfläche aufgetragen) mit einem UV-VIS-Reflektionsspektrophotometer messen, um sicherzustellen, dass es keine unerwünschten UV-Spitzen im Spektrum gibt, die Wäre für den Menschen unsichtbar, aber möglicherweise für die untersuchten Arten sichtbar.
2. Verwenden Sie ein Sektmikroskop, das mit einer Kamera und einem Computer verbunden ist, um leichter Fotos vom Ausgang der Manipulation zur Dokumentation und zur Erhöhung der Replikationsfähigkeit (Materialtabelle)zu machen.
   1. Schalten Sie das Mikroskop, den Computer und die Software ein, die die Kameraeingabe verarbeitet.
   2. Wählen Sie den entsprechenden Zoom aus, in dem das endgültige Bild aufgenommen wird.
   3. Einen Insektenmontage-Pin oder einen kleinen Nagel (mit dem Kopf nach außen) in eine Kugel aus nicht härtendem Modellierton (ungefähr die Größe einer Traube) stecken. (Die zu lackierende Live-Spinne wird in Schritt 3.1 unten vorübergehend auf den Kopf dieses Pins montiert). Legen Sie den Modellierton und den Pin unter das Mikroskop, um die Ziele so anzupassen, dass sie sich grob auf den Kopf des Pins konzentrieren (wo die Spinne montiert werden soll).
   4. Achten Sie darauf, dass die Ziele für die Augen des Malers in der richtigen Entfernung sind und dass die Kamera das Sichtfeld während der Malerei nicht behindert (wie es der Fall ist, wenn die Kamera in einem der Schechungen montiert ist, was die Tiefenwahrnehmung behindert).
3. Übertragen Sie die Spinne in eine saubere Plastik-Schnappkappen-Vial (ca. 12 Dramen, ohne Webbing oder tote Beute).
4. Bereiten Sie Montage-und Lackieranlagen vor.
   1. Legen Sie einen extra dünnen Insektenmontagstift in eine Kugel aus nicht härtendem Modellierton (zusätzlich zu dem, der in Schritt 1.2.3 verwendet wird) und legen Sie sie auf die linke Seite des Mikroskops (für Rechtshänder). Mit diesem Pin werden die Positionen der Beine und Pedimpfe der Spinne (je nach Bedarf) während der Malerei sanft angepasst.
   2. Holen Sie sich ein kleines Stück saugfähiges Papier (wie ein Papiertuch), ein Stück weißes Druckerpapier, die Farben zum Auftragen (hier, Emailfarbe), separate Behälter von Farbe dünner (eine für jede Farbe plus eine transparent und sauber gehalten), individuelle Mikrobürsten für jede Farbe (Siehe Materialtabelle), und eine Mikrobürste, die nur mit sauberem Dünner verwendet werden soll, alle in einer organisierten Art und Weise auf der rechten Seite des Mikroskops (für Rechtshänder).
   3. Mit einem Zahnstocher einen Tropfen Farbe in eine offene Plastikschale (wie eine kleine Petrischale oder eine Ampelkappe) geben und die Lackdünner, zum Beispiel mit einer kleinen Spritze, hinzufügen. Mischen Sie die beiden mit dem Zahnstocher auf die richtige Konsistenz (wenn die Farbe komplett homogenisiert, aber nicht zu runzig ist), indem Sie sie mit einem Mikropinsel auf dem weißen Druckerpapier testen.
      Hinweis: In bestimmten Fällen, wenn die Farbe schnell trocknet, bereiten Sie sie mit etwas flüssiger als für die Anwendung gewünscht, und lassen Sie die Pinsel im Farbtopf dünner einweichen, bis sie später verwendet werden (Schritt 4).
   4. Legen Sie einen erbsengroßen Tropfen wasserbasierten Klebstoff (siehe Materialtabelle) auf eine Ecke des Druckerpapiers.
      Achtung: Das muss die letzte Phase der Vorbereitung sein und der nächste Schritt muss unmittelbar danach geschehen, damit der Klebstoff nicht austrocknet.

2. Die Vernebung der Spinne

1. Mit der Spinne in der Ampulle und einer Hand über die Öffnung gewürscht, um Flucht zu verhindern , langsam CO-2-Gas hinzufügen, bis sich das dritte Beinpaar der Spinne auf 180 Grad ausdehnt.
2. Verwenden Sie eine Zeit der Exposition gegenüber CO₂ von etwa 20 Sekunden bis 1,5 Minuten, je nach der durchschnittlichen Größe der Art und der einzelnen Spinne. Wir haben festgestellt, dass die Verlängerung des dritten Paar von Beinen ein zuverlässiger Indikator für den richtigen Grad der Anästhesie in H. pyrrithrix,aber dies ist wahrscheinlich unterschiedlich in der Art. Wenn Sie diese Techniken zum ersten Mal mit einer anderen Spezies verwenden, testen Sie zuerst die Anästhesie auf ein paar Proben, um ihre Reaktion zu beurteilen.
3. Geben Sie Spinnen so wenig CO_{2 wie} möglich, um das erforderliche Maß an Anästhesie zu erreichen. Während die kurzen Perioden der Anästhesie, die hier beschrieben wurden, keine Sterblichkeit hervorbrachten (und keine spürbaren Verhaltensunterschiede von nicht-anästhetisierten Spinnen), geben alle Tiere in einem Experiment gleiche Anästhesie (einschließlich Schein-Kontrollen).
4. Halten Sie die Ampulle geschlossen, nachdem Sie CO_{2 hinzugefügt} haben, um die Spinne unter Narkose zu erhalten; Also, diese Zeit bei der Berechnung, wie lange die Spinne auf CO_{2 ausgesetzt}ist.
5. Sobald die Spinne aus der Ampulle entfernt wurde, um mit der Farbmanipulation zu beginnen, wird sie für etwa 1 bis 2 Minuten vollständig betäubt bleiben; Die folgenden Schritte (Abschnitte 3-6) führen daher umgehend durch. Versuchen Sie aufgrund dieses begrenzten Zeitfensters zuerst die folgende Malmethode mit toten Exemplaren (für die Praxis), bevor Sie versuchen, lebende Spinnen zu malen.

3. Montage der Spinne unter dem Mikroskop

1. Fügen Sie eine sehr kleine Menge Kleber auf den Kopf des Befestigungsstifts oder Nagels in den Modellierton, der im Sichtfeld des Mikroskops vorbereitet wird.
   Hinweis: Verwenden Sie die kleinste Menge an Klebstoff, die es erlaubt, die Spinne an Ort und Stelle zu halten, um sicherzustellen, dass i) die Spinne nicht von der Nadelspitze rutscht (wenn zu viel Klebstoff verwendet wird), und ii) die Spinne schafft es, sich nach dem Aufwachen zu befreien.
2. Die Betäubungsmittel gleiten sanft von ihrer Ampulle auf den Tisch mit ihrer ventralen Seite nach oben.
   Hinweis: Da die Abdomänen der Spinnen weich sind, sollte darauf geachtet werden, die Spinnen nicht zu zapfen oder auf den Tisch zu werfen, da dies zu Verletzungen führen kann.
3. Drücken Sie den Nadelkopf (mit Kleber) sanft auf das Spinnendsternum (den zentralen Bereich, in dem sich die Beine der Spinne am Körper befestigen) so, dass die Spinne leicht abprallt und ihre Beine unter dem kleinen Druck ausdehnt. Für eine zusätzliche Kontrolle des Drucks, halten Sie den Modellierton mit beiden Händen, mit beiden Händen fest gegen den Tisch gebeugt.
4. Positionieren Sie den Modellierton unter das Mikroskop, so dass der zu lackierende Bereich nach oben und im Fokus steht.

4. Die Spinne malen

1. Die Farbkonsistenz bewerten, bevor Sie den Pinsel an der Spinne berühren.
   1. Die Farbkonsistenz zu erhalten (mit dem saugfähigen Papier die Bürsten abwischen, wenn sie in der dünneren gehalten wurden), bei Bedarf noch einmal einstellen und immer zuerst versuchen, Farbe auf das Druckerpapier aufzutragen, um die in den Bürstenhaaren enthaltene Farbmenge zu kontrollieren.
   2. Mit der rechten Hand und beim Blick durch das Mikroskop, bringen Sie die Spitze der Bürste in den Bereich des Sehens, und stellen Sie sicher, (ein zweites Mal), dass die Pinselhaare nicht zu viel Farbe enthalten, in diesem Fall wischen Sie einen Teil davon auf das Druckerpapier.
2. Testen Sie die Farbkonsistenz auf der Spinne.
   1. Berühren Sie die Spinne mit dem Pinsel auf der größten Fläche, die überlackt werden muss. Dies wird den Maler darüber informieren, ob die Konsistenz und Menge der Farbe stimmt (d.h.wenn die Farbe leicht und langsam in die Haar-und Skalen der Spinne eindringt).
      1. Wenn keine Farbe aufgetragen wird, den Pinsel in die Farbe einweichen und zu Schritt 4.1 zurückkehren, um die Prozedur zu wiederholen.
      2. Wenn die Farbe schnell einweicht und auf einen Bereich überschwappt, der nicht mit Farbe bedeckt sein sollte, und wenn man davon ausgeht, dass die Ausbreitung minimal ist und der Einzelne noch am Experiment teilnehmen könnte, wischen Sie den Pinsel auf das saugfähige Papier und kehren Sie zu Schritt 4.1 zurück, um sich zu wiederholen. Das Verfahren.
         Achtung: Diese Art von Flüssigkeitsverschmutzungen kann nicht behoben werden. Wenn die Verschmutzungen die Chelicerae oder die Augen oder andere Teile erreichen, die für den Einzelnen tödlich oder giftig sein könnten, sollten Sie erwägen, die Spinne sofort in den Gefrierschrank zu legen, um sie zu euthanieren, bevor sie aufwacht, und die Spinne vom Experiment auszuschließen.
3. Malen Sie alle Bereiche, die Farben nach den Schritten 4.1 und 4.2 benötigen.
   1. Wenn Sie das Gesicht der Spinne bemalen, benutzen Sie den extra dünnen Stift mit der linken Hand, um die Vorderbeine und Pedipalpen zu halten (so dass sie aus dem Weg des Pinsels sind). Dies geschieht am besten beim Blick durch das Mikroskop, um die Anhängsel der Spinne nicht zu beschädigen. Darüber hinaus, wenn das Malen der Farbe der Spinne, und je nach den Pinseln verwendet, um zu malen, erwägen die Malerei beiden Seiten des Gesichts, bevor Sie versuchen, den zentralen Teil zwischen den Augen zu malen-beide bemalten Bereiche können durch das Halten der Bürste parallel zur Spinnenwand verbunden werden Und induzierte Kapillarwirkung.
      Hinweis: Wenn man das Gesicht der Spinne bemalt, ist es am einfachsten, zuerst die Seite zu malen, die der dominanten Hand am nächsten ist, und dann die Kugel aus Ton (mit der montierten Spinne) unter dem Mikroskop um die andere Seite zu drehen, gefolgt von der Mitte.
   2. Wenn Sie Putzpalmen oder Beine bemalen, achten Sie darauf, keine Gelenke zu berühren, wenn die Farbe eine härtende Farbe ist (wie zum Beispiel die Emailfarbe), und stellen Sie sicher, dass Sie keine Farbe auf die Spermienorgane des Mannes auftragen (auf der Unterseite des distalen Segments der Pedimpps).

5. Das Spinnenbild

1. Schalten Sie das Ziel in den Kameramodus um.
2. Nehmen Sie ein Bild mit der Computersoftware, um sicherzustellen, dass der gewählte Zoom derjenige ist, der auf dem Mikroskop ausgewählt wurde, so dass eine Skalenleiste hinzugefügt werden kann.

6. Die Spinne aus dem Stiel oder Nagel befreien

1. Wenn sich die Spinne in Bewegung setzt, halten Sie den Stift so fest, dass die Vorderbeine der Spinne die Spiderpiale berühren.
2. Lassen Sie die Spinne sich selbst lösen, und wenn nötig, neigen Sie den Stift sanft, um die Spinne zu helfen, sich vom getrockneten Kleber zu ziehen.
   1. Wenn die Spinne aufwacht, bevor das Gemälde fertig ist, lassen Sie die Spinne mindestens 15 Minuten erholen, bevor sie wieder betäubt werden. Wenn dies geschieht, stellen Sie sicher, dass alle Gruppen die gleichen Niveaus der Anästhesie erhalten (einschließlich schambehandelter Personen, falls zutreffend).
      Hinweis: Spinnen scheinen ihr normales Verhalten nach Manipulation (< 15 min) schnell wieder aufzunehmen, aber wir empfehlen eine standardisierte Ruhezeit von 12 Stunden, bevor sie die Spinne in einem Verhaltenstest verwenden.

7. Analyse des Verhaltens der Spinnen

1. Vergleichen Sie das Verhalten von nicht manipulierten, schambehandelten und manipulierten Probanden, um die mögliche Toxizität der Anwendung zu beurteilen (die je nach Spezifik, Farbe, Anwendungsgebiet und Studienart variieren kann). Relevantes Verhalten zum Vergleich könnte Aktivitätsrate, Art der durchgeführten Aktivität, Erfolg bei der Durchführung bestimmter Aktivitäten (z. B. die Erfassung von Beute), etc. umfassen.
   1. Verwenden Sie schambehandelte Spinnen als Teil des experimentellen Entwurfs (zum Beispiel den Empfang der Lackaufbringung auf einem nicht sichtbaren Bereich oder das Auftragen von neutralen Farben auf die gleichen Bereiche), um nur die Farbe des Individuums zu verändern, während Sie für die Kontrolle über die Andere Faktoren (z.B. Handlingzeit, Geruch, Oberflächenstruktur, etc.).
      Hinweis: Wenn das Malen von Beinen oder Pedipalpen, betrachten Sie die Möglichkeit, dass dies mit sensorischen Haaren stören kann (auf Spinnenbeinen und Pedipalpen, sieheFoelix 2010 40) und, in diesen Fällen, musterbehandelte Männchen sollten neutrale Farben auf die Gleiche Bereiche wie eine Kontrolle.
   2. Vergleichen Sie bei der Entwicklung neuer Methoden lackierte Spinnen mit nicht manipulierten Spinnen, um zu beurteilen, ob sich farbig manipulierte Individuen noch normal verhalten.

8. Messung der Reflexionseigenschaften der Farbmanipulation am gemalten Motiv

1. Sobald die Sterbezeit (nachdem Spinnen in ein Experiment verwickelt waren oder speziell zu diesem Zweck euthanisiert wurden, siehe Anm. unten), messen Sie die spektralen Eigenschaften der Farbmanipulation mit einem Standard-tragbaren UV-VIS-Spektrophotometer (Materialtabelle) ), besonders für Bereiche, die größer als 1 mm im Durchmesser sind.
2. Verwenden Sie für kleinere Bereiche ein maßgeschneidertes Mikrospektrophotometer (ein UV-VIS-Spektrophotometer, das durch ein Mikroskop geleitet wird), um einfachere und präzisere Messungen zu ermöglichen, obwohl die Optik des Mikroskops UV-Licht ausschneidet, was bedeutet, dass die Messungen auf die Menschensichtbar Wellenlängen (siehe Taylor et al. 2011⁴¹).
3. In Fällen, in denen farbmanipulierte Bereiche extrem klein sind und UV-Reflexionsdaten benötigt werden, verwenden Sie handelsübliche UV-VIS-Mikrospektrophotometer, obwohl sie teurer sind (vgl. Taylor et al. 2014⁴²).
   Hinweis: Die Lichtquelle von UV-VIS-Spektrophotometern enthält UV-Licht und kann für die Augen der Tiere (auch für unsere) gefährlich sein, daher sollten Spektralmaßnahmen erst dann durchgeführt werden, wenn die Tiere euthaniert und nicht nur betäubt werden. Bei Emaille-lackierten Spinnen kann dies geschehen, nachdem die Spinnen in Experimenten eingesetzt wurden, da die Farbe nicht abgenutzt wird (siehe repräsentative Ergebnisse unten). Für wasserbasierte Farbe, die manchmal nach Tagen oder Wochen verblassen kann, könnte eine Reihe von Spinnen geopfert werden, um zu messen, wenn ihr Gegenüber in ein Experiment involviert sein würde (um Daten zu erfassen, die die tatsächliche Farbmanipulation widerspiegeln, die in der Experiment). Die Meldung der spektralen Eigenschaften der Farben wird eine Replikation durch andere Forscher ermöglichen, die die Farbmanipulation replizieren wollen, aber keinen Zugriff auf die gleichen spezifischen Farbprodukte haben.

Ergebnisse

Wirksamkeit von Farbmanipulationen

Mit diesen Techniken sind verschiedene Grade der Farbmanipulation wirksam, einschließlich des Verdeckens von Farben vollständig oder die Verringerung oder Verbesserung ihrer Intensität. Das zeigt sich sowohl an Fotografien als auch an Messungen der spektralen Reflexion (Abbildung 2, Abbildung 3und Abbildung 4). Hier zeigen wir farblich manipulierte männliche Habronattus pyrrithrix im Vergleich zu natürlichen rotgesichteten Männchen. Spektraleigenschaften wurden mit einem UV-VIS-Spektrophotometer (siehe Materialtabelle) gemessen, das farbige Flächen mit einem Durchmesser von bis zu 1 mm präzise messen kann. Die Messungen wurden im Verhältnis zu einem diffusen Reflexionsstandard in der Weißnorm durchgeführt (siehe Materialtabelle).

In seltenen Fällen (5 von 108 Männchen, die mit schwarzem Eyeliner 1 bemalt waren (siehe Materialtafel), begannen die wasserlöslichen Wimperner nach ein oder zwei Wochen die Gesichter der Spinnen abzutragen. Dies wurde bei der anderen Eyeliner-Marke nicht beobachtet (Eyeliner 2; siehe Materialtabelle). In beiden Fällen wurden Spinnenkäfige drei-bis fünfmal pro Woche mit Wasser besprüht. Unterschiedliche Wartungsbedingungen können den Verschleiß von wasserbasierter Farbe beeinflussen. Die Emailfarbe war noch für alle manipulierten Männchen (n=221) intakt, auch für die noch lebenden nach 6 Monaten.

Mögliche Toxizität der Farbmanipulation

Man sollte vermeiden, Farbe auf die Augen der Spinnen zu bekommen, um ihre Sehkraft nicht zu behindern, noch auf ihre Chelicerae, Mundpartien und andere Öffnungen, und möglicherweise andere weiche Körperteile, um eine mögliche Einnahme und Vergiftung zu verhindern. Man sollte auch vorsichtig sein mit der Malerei Gelenke oder Teile, die sensorische Haare (wie die Beine und Pedipalpen) enthalten, um ihre Beweglichkeit oder Sinnessystem nicht einzuschränken. Wenn solche Farbmanipulationen an diesen Körperregionen jedoch notwendig sind, oder wenn es Zweifel an der Möglichkeit subtiler negativer Effekte gibt, ist es am besten, Farben auf Individuen in allen Behandlungskategorien anzuwenden. Auf diese Weise würde man vermeiden, dass die sensorischen Systeme von Individuen auf eine Weise unbeabsichtigt manipuliert werden, die nur gegen eine der Behandlungen voreingenommen sein könnte. In einem Experiment mit Männern, die in Abbildung4 manipuliert wurden, ging es zum Beispiel darum, die Anzahl der roten Flecken, die von Männern während der Balz angezeigt werden, zu erhöhen und zu verringern. Da einige Männchen ihre natürlichen roten Gesichter mit grauer Emailfarbe verdecken würden (um die Menge an Rot zu verringern), wurden die anderen Männchen, für die wir ein rotes Gesicht pflegen wollten, über ihrem natürlich roten Gesicht mit dem gleichen Produkt wie das graue Gesicht gemalt Männer. Da wir dem Stammtisch bei bestimmten Männchen rote Flecken hinzufügen wollten, um die Anzahl der angezeigten roten Farbflecken zu erhöhen, wurde graue Farbe verwendet, um den Kinderarzt anderer Männchen zu bedecken, so dass alle Männchen auf diesem empfindlichen Bereich bemalt werden konnten (siehe Abbildung4). . Obwohl es besser ist, ist diese Strategie nicht immer machbar. In einem anderen Experiment wurde zum Beispiel die rote Färbung entfernt, indem ein schwarzer Eyeliner verwendet wurde, der die gleiche spektrale Eigenschaft wie die zugrunde liegende Schale des Männchens gab, während die anderen männlichen Farben intakt und natürlich blieben (Abbildung2). In diesem Fall, für natürlich aussehende Männer, wurde die gleiche Menge an Eyeliner auf den Bereich auf der Oberseite ihres Karapace direkt hinter ihren vorderen medianischen Augen (ein Bereich, der nicht deutlich sichtbar für Frauen), um für den potenziellen Geruch oder die allgemeine Toxizität der ergebnis. Der Ort, an dem die Farbe aufgetragen wird, kann jedoch Spinnen unterschiedlich beeinflussen. Um daher subtile Unterschiede in der Art und Weise oder den Ort, an dem die Farbe aufgetragen wurde, auf die Integrität der Spinne haben kann, kann das Verhalten beider Arten von Männern in einem Kontext, der für unsere Hypothesen relevant war (in Bezug auf Paarwahl und sexuellen Kannibalismus) Vergleichbar. Männchen wurden in Anwesenheit eines Weibchens zweimal gestellt, und wir verglichen ihre Verzögerung, um aktiv zu werden, ihre Verzögerung zu hofieren, und die Gesamtdauer, die sie mit allgemeinen linearen gemischten Effekt-Modellen verbrachten (mit der Funktion lmer mit dem R-Paket lme4 43 In der R-Version 3.5.2⁴⁴ mit der weiblichen Identität als Zufallseffekt und unter Verwendung des maximalen Wahrscheinlichkeitskriteriums, um p-Werte zu erhalten). In diesem Fall zeigen alle Vergleiche keine Unterschiede zwischen den Behandlungen (siehe Tabelle 1) und man kam daher zu dem Schluss, dass wir keine Voreingenommenheit zugunsten der einen oder anderen Behandlungskategorie eingeführt haben.

In beiden Fällen sollten die Forscher bei sehr ähnlichen Behandlungskategorien (Abbildung 4) oder nur mit Schein-behandelten Individuen (Abbildung 2 und Abbildung 3) untersuchen, wie ihre Modellarten von der Farbe beeinflusst werden, die sie verwenden, und sicherstellen, dass Sie verhalten sich nach wie vor ähnlich und ökologisch relevant. Man könnte Daten aufzeichnen, um die möglichen Auswirkungen der Toxizität so weit wie möglich zu bewerten, etwa durch den Vergleich der Aktivitätsraten zwischen behandelten und nicht manipulierten Personen. Unsere Spinnen, die wie in Abbildung 4 mit Emailfarbe bemalt wurden, wurden mit nicht manipulierten Männchen in einem ansonsten identischen Kontext verglichen. Konkret wurden Männer einzeln in einen weiblichen Käfig eingeführt und ihre Verzögerung, um die Vial zu verlassen, Verzögerung zu Höflichkeit und Höflichkeit Rate (vor der Kopulation, und vor dem Angriff oder Kannibalen) verglichen. Es wurden keine Unterschiede festgestellt (bei der Verwendung ähnlicher linearer Mixed-Effekt-Modelle wie oben) und wir kamen daher zu dem Schluss, dass sich unsere bemalten Männchen natürlich verhalten haben (Tabelle 2).

Schließlich ist es wichtig zu beachten, dass alle Spinnen in den Experimenten (in der Regel Frauen), die kannibalisierten farbig manipulierten Männchen nie unter negativen Auswirkungen zu leiden schien. Spinnen verdauen ihre Beute nach außen und lassen die bemalten Bereiche der Kutikel meist zurück. Wenn man diese Methode jedoch auch an andere Systeme anpasst, bei denen farbig manipulierte Tiere konsumiert werden, sollte man die potenziellen Risiken der Toxizität abschätzen.

Bild 1 . Erwachsene männliche Habronattus pyrrithrix illustriert , wie winzig ihre farbigen Körperregionen sind. Fotografiert von Lyle Buss. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Bild 2 . Experimentelle Farbmanipulationen, die verwendet werden, um rote Gesichtsfärbung in Habronattus pyrrithrixzu verbergen. (A) Die intakte rote Gesichtsfärbung vor der Farbmanipulation. (B) Die Gesichtsfärbung desselben Männchens nach dem Verdecken der natürlichen roten Färbung mit schwarzem Eyeliner 1. C) Repräsentative Reflexionsspektren für das natürliche rote Gesicht, die natürliche schwarze Schale und das rote Gesicht, das mit schwarzem Eyeliner lackiert ist. Modifiziert von Taylor und McGraw 2013³⁹. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Bild 3 . Experimentelle Farbmanipulation verwendet, um die Größe und Rötung der roten Gesichtslecken-Spocken von männlichen Habronattus Pyrrithrix zu reduzieren. (A) Die intakte rote Gesichtsfärbung vor der Farbmanipulation. B) Die Gesichtsfärbung des gleichen Männchens nach dem Auftragen verdünnter schwarzer Eyeliner (Urban Decay) auf den vorderen Teil des Gesichts, und nicht verdünnter schwarzer Eyeliner entlang der Ränder des Gesichtsprichs, um die Größe der roten Fläche zu reduzieren. (C) Mittlere Spektralkurven von schambehandelten Kontrollmännchen (n = 21) und farblich manipulierten Männchen (n = 21), verglichen mit dem Bevölkerungsgemein (n=57) und den 10 trabinsten Männchen aus einer früheren Studie⁴¹. Abbildung von Taylor et al. 2014³⁸. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Bild 4 . Experimentelle Farbmanipulation verwendet, um die Farbe des roten Gesichtspflachen von Männern zu verändern Habronattus pyrrithrix. Habronattus pyrrithrix Männchen mit (A) rot, (B) rot und grau bemalt, und (C) graue Emailfarbe über ihr natürliches rotes Gesicht und natürlich cremefarbene Pedimpps. (D) Mittlere Spektralkurven für unmanipulierte Männchen (n = 9) und Männchen mit ihrem Gesicht, das mit rotem Emailfarbe bedeckt ist (n = 9). Durch das Auftragen eines helleren Rot über das Gesicht der Spinne haben wir die rote Gesichtsfärbung effektiv verbessert. Da die Emaille-Farbe die darunterliegende Waage vollständig abdeckt, könnte die Farbe auch komplett verändert werden, wie es bei dem grauen Emaille der Fall ist. E) In diesem Experiment wurden rote und graue Emailfarben ausgewählt, um für die volle Helligkeit (totale Reflexion über den Bereich der Wellenlängen, die für diese Spinnen sichtbar sind) abgestimmt zu werden. Unterschiede in der Skala der Y-Achsen in D und E sind auf verschiedene Techniken (wie Abstand zur Probe und Größe der gemessenen Bereiche) zur Messung von Farbproben auf Papier (E) vs. direkte Messungen von Farben auf dem Gesicht der Spinne (D) zurückzuführen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 

N	Abhängige Variable	seiten	T	mit rotem kopf	± SE	Schwarz-Gesicht	± SE	nFID
202b	Männliche Verspätung, um Gericht zu verlassen	0,35	-0,93	140,0	23,9	109,8	23,9	102
179c	Männliche Verspätung vor Gericht	0,74	0,33	983.4	127,1	1031.0	126,5	95
204a	Männliche Balzanstrengung	0,52	0,63	181.2	24,4	203.0	24,4	102
204a	Männliche Balzanstrengung vor jedem Angriff	0,41	0,68	89,0	15,7	97,5	15,7	102

Tabelle 1. Wirkung der Farbmanipulation des männlichen Gesichts auf das Verhalten, wenn sie mit schwarzem Eyeliner vs. Schein-behandeltem gemalt wird (Abbildung 2). Die Struktur jedes Modells wird angegeben, ebenso die mittleren Schätzungen in Sekundenschnelle (± SE) für jede Behandlungsgruppe. N = Anzahl der Männer, p und t = p-Wert und t-Wert für die männliche Behandlung, nFID = die Anzahl der Ebenen in der zufälligen Wirkung weibliche Identität. ^Ein Von den 104 durchgeführten männlichen Tests wurden 102 erfolgreich aufgenommen, was zu 204 einzigartigen Männern führte. ^B2 Männchen wurden vom Weibchen kannibalisiert, bevor es die Petrischale immer wieder verlassen hatte. ^C25 Männchen wurden von der Frau kannibalisiert, bevor sie jemals das Weibchen hofierten.

N	Abhängige Variable	seiten	T	Unmanipuliert	± SE	Gemalt	± SE
32a	Männliche Verspätung, um Gericht zu verlassen	0,87	-0.17	380.8	143.1	345,4	152.4
31b	Männliche Verspätung vor Gericht	0,93	-0.09	502.6	105,8	488.1	116,6
31b	Männliche Balzanstrengung	0,74	-0,33	2324.3	455,0	2102.1	484.4
31b	Männliche Balzanstrengung vor jedem Angriff	0,68	0,42	1495,1	450.8	1770,1	479,9

Tabelle 2. Wirkung der Farbmanipulation des männlichen Gesichts auf das Verhalten, wenn sie mit roter oder grauer Emailfarbe (n = 15, Abbildung 4) vs. unmanipulierten Männchen (n = 17) bemalt wird. Die Struktur jedes Modells wird angegeben, ebenso die mittleren Schätzungen in Sekundenschnelle (± SE) für jede Behandlungsgruppe. N = Anzahl der Männer, p und t = p-Wert und t-Wert für die männliche Behandlung. ^Eine17 unmanipulierte Männchen wurden mit einer Untermenge aller gemalten Männchen in unserem Experiment verglichen (n = 221). Konkret wurden sie mit 15 bemalten Männchen (5 rote (Abbildung 2A), 5 rot und grau (Abbildung 2B) und 5 Grau (Abbildung 2C)) verglichen, die im gleichen Kontext (in Anwesenheit eines Weibchens) und im gleichen bestimmten Zeitraum getestet wurden. Das ist wichtig, weil gegen Ende des Experiments (im August und September 2018) unmanipulierte Männchen getestet wurden, was dem Ende ihrer natürlichen Brutsaison entspricht und bei dem die Männchen in der Regel weniger aktiv sind. Wenn wir alle anderen Variablen gleich halten, können wir die Malbehandlung vergleichen, ohne andere Voreingenommenheiten einzuführen. ^B Ein Männchen (alle grau) wurde kannibalisiert, bevor es jemals das Weibchen hofierte.

Diskussion

Hier zeigen wir, dass die Farben von winzigen Körperteilen von Arthropoden effektiv mit Farbstoffen wie Make-up und Emailfarben manipuliert werden können.

Der erste entscheidende Schritt, um solch heikle Manipulationen zu erreichen, besteht darin, Kleintiere, die in der Regel nicht in der Hand zurückgehalten werden können, zu immobilisieren. Hier, um empfindliche Bereiche wie das Gesicht der Springspinne malen zu können, haben wir Individuen mit CO₂ betäubt und auf dem Kopf eines Pins montiert. Dies ermöglicht es, in der Nähe der Augen der Spinne mit weniger Stress zu arbeiten, als die Spinne wahrscheinlich erleben würde, wenn sie wach wäre (mit Licht aus dem Mikroskop, das während des Malprozesses in ihre Gesichter scheint).

Die Methode erfordert auch, dass man qualitativ hochwertige Mikrobürsten und vor allem geeignete Farbstoffe erhält. Der schwierigste Schritt bei der Farbaufbringung ohne Verschmutzungen, aber mit guter Abdeckung ist es, die richtige Konsistenz zu bekommen. Daher müssen die Farbstoffe leicht mit einem dünneren verdünnt und leicht ausgetrocknet werden, um sich zu verdicken. Es könnten verschiedene Arten von Farben verwendet werden; Hier werden die Ergebnisse mit wasserlöslichen (nicht-wasserdichten) Augenlidern und Emailfarben präsentiert. Nicht-wasserdichte Augenlider haben den Vorteil, dass sie leicht verflüssigt werden, wenn sie mit Wasser vermischt werden. Dies geht jedoch mit der Verdünnung der Pigmentierung (die nicht oder nicht wünschenswert sein kann (siehe z.B . Abbildung3). Emailfarben haben eine Konsistenz, die sich leicht durch das Hinzufügen von Emaille dünner steuern lässt, während sie trotzdem die volle Abdeckung bietet. Diese Eigenschaft besteht jedoch aus der Möglichkeit, die Haar-oder Skalenstruktur des gemalten Körperteils zu erhalten. Außerdem sind Emailfarben lange haltbar. Der Nachteil dabei ist, dass Emailfarbe und dünner Gerüche während der Anwendung und vor dem Trocknen ausstrahlen. Eine weitere Schwierigkeit in Bezug auf die Farbstoffe kann sein, den richtigen Farbton zu finden, mit den richtigen spektralen Eigenschaften. Es ist zum Beispiel schwierig, den roten Eyeliner parallel zum schwarzen Eyeliner zu verwenden, da Eyeliner oft rosa als rot sind. Es ist auch schwer, Make-up-Pulver (oder Pigmente) zu bekommen, die keinen Glitzer enthalten (der manchmal nur unter dem Mikroskop sichtbar ist). Viele Make-up-Produkte reflektieren auch UV-Licht, das zwar für die Experimentatoren unsichtbar ist, aber für die untersuchten Tiere auffällig sein könnte.

Die Farbgebung von Arthropoden durch direkte Aufbringung von Farbstoffen auf ihre Körperteile zu manipulieren, bringt im Vergleich zu anderen Methoden Vorteile und Unannehmlichkeiten mit sich. Seine Haupteinschränkung besteht darin, dass man die Möglichkeit von subtilen Toxizitätseffekten nicht unbedingt abtun kann. Man kann jedoch sicherstellen, dass man keine Vorurteile gegen eine Behandlungsgruppe einführt, indem man Farbe auf alle Behandlungskategorien aufträgt, and/oder man kann testen, ob die Lackaufbringung das Interesse stört. Mit den hier vorgestellten Methoden haben wir genügend Beweise gesammelt, um zu suggerieren, dass die Lackierung zu vernachlässigbaren bis unnegativen Auswirkungen geführt hat (Tabelle 1 und Tabelle 2). Der Hauptvorteil dieser Methode ist, dass winzige Farbflecken gezielt, ihre Farbe ' entfernt ' (siehe Abbildung 2), stumler (Abbildung 3) oder heller (Abbildung4), in Isolation vom Rest der Körperfarkose und der individuellen umgebung. Dies steht im Kontrast zur gängigsten Alternativmethode, die darin besteht, die Lichtverhältnisse zu manipulieren und so das visuelle Erscheinungsbild des Ganzen und seiner Umgebung zu verändern. In der Tat, auch wenn nicht speziell manipulierende Lichtverhältnisse, kann man erfolgreich die Farbe manipulieren und sehen, begrenzte oder gar keine Auswirkungen dieser Manipulation, wenn die Beleuchtung Umgebung nicht angemessen ist³⁹. Daher ist es wichtig, die Lichtumgebung zu messen und zu berücksichtigen, in der alle Experimente durchgeführt werden (d.h. die Bestrahlung messen) und sicherzustellen, dass sie eng mit den natürlichen Lichtverhältnissen in Einklang gebracht wird (zum Beispiel mit Hilfe von Vollspektrumleuchten, die nachahmen. natürliches Licht, wenn in Gefangenschaft). Insgesamt ermöglicht dieses Protokoll durch den Einsatz von Mikrobürsten und einem Mikroskop eine präzisere Manipulation von winzigen Farbflecken als die meisten anderen direkten Farbmethoden, die bisher auf Wirbellosen verwendet wurden. Die meisten früheren Studien haben Tiere mit Farbflecken verwendet, die relativ groß sind im Vergleich zu den Gesichtern von Springspinnen (z. B.Manipulation von Schmetterlingsflügelfarben 29^{,34,35, die}Körper von Erwachsenen Hämatterans (' wahre Bugs ')30^,36 und Heuschrecken31, oder die Beine der relativ großen Wolfspinnen32^{, 33,37)}. Die hier vorgestellten Methoden eröffnen Möglichkeiten, die erstaunliche Vielfalt der Farbflecken auf Taxa zu untersuchen, die aufgrund ihrer geringen Größe unterstudiert werden.

Ähnliche Techniken könnten auf andere Arthropoden angewendet werden, die immobilisiert oder betäubt werden können, und für Bereiche, in denen Farbe die Beweglichkeit oder Gesundheit des Individuums nicht beeinträchtigen würde (d.h. Bereiche wie Gelenke, Strukturen wie Haare oder Ararolia, die benötigt werden Für geeignete Fortbewegung, Mundpartien oder andere Öffnungen wie Atemstrukturen). Diese Techniken können auch erweitert werden, um eine größere Palette von Farben, Farben und Make-up, die weit verfügbar sind.

Schließlich könnten diese empfindlichen Techniken nicht nur dazu verwendet werden, Farbe an kleinen Organismen zu manipulieren, sondern auch Muster (wie Streifen) in relativ größeren Organismen zu manipulieren. Dies sollte für eine Vielzahl von Forschern von Vorteil sein, die unsere Methoden an ihre eigenen Studien über sexuelle Selektion, Kommunikation, aposematische Beutemensignale und andere Kontexte anpassen können, in denen Tiere Farbe verwenden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
CO2-Tank	AirGas (Radnor, PA)	#CD 50	to anästhesiegroße Spinnen
Emaillefarbe Verdünner	Testors (Vernon Hills, IL)	75611792569	zu verdünnen Emailfarbe
Flache Emaillefarbe	Testors (Vernon Hills, IL)	rot: 075611115009, schwarz: 075611114903, weiß: 075611116808	kann mit Emaillefarbe verdünnt werden Lichtmikroskop
	Zeiss (Jena, Deutschland)	stemi 508	zum präzisen Malen kleiner Flächen
Lichtmikroskop-Kamera	Zeiss (Jena, Deutschland)	Axiocam 105 color	zum Aufnehmen von Bildern vor und nach der Manipulation für die Dokumentation
Lichtmikroskop-Kamerasoftware	Zeiss (Jena, Deutschland)	Zen 2 blue edition	zur Verarbeitung von Bildern, die vor und nach der Manipulation aufgenommen wurden
Flüssiger Liner Eyeliner, Schattierung " Perversion"	Urban Decay (Costa Mesa, CA)	(eingestellt)	nicht wasserfester Eyeliner, der mit Wasser verdünnt werden kann; Eyeliner 2
MegaLiner flüssiger Eyeliner, schwarz	WetnWild (Los Angeles, CA)	SKU# 871Ein	nicht wasserfester Eyeliner, der mit Wasser verdünnt werden kann; Eyeliner 1
Micro Brushes	MicroMark (Berkeley Heights, NJ)	#84648	für präzises Malen kleiner Flächen
Nicht aushärtendes Modellieren Ton	Van Aken International Claytoon (North Charleston, SC)	18165	zum Einstecken von kleinen Nageln oder Insektenstiften und zum flexiblen Einstellen ihrer Winkel
Nagel- oder Insektenbefestigungsstifte	BioQuip (Rancho Dominguez, CA)	#1208B7	zum Aufkleben von Spinnen sowie zum Entfernen von Spinnen Kleine
Kunststoffbehälter wie die Deckel von Insektensammelfläschchen mit Schnappverschluss	BioQuip (Rancho Dominguez, CA)	#8912	zum Mischen von Farbe und Verdünner auf die richtige Konsistenz
Kleine Spritze	Fisher Scientific	1482910F	zum Übertragen einer kleinen Menge Emailleverdünner
Spectralon weiß Standard	Labsphere Inc. (North Sutton, NH)	WS-1-SL	zur Messung der spektralen Eigenschaften von Farben
UV-VIS-Spektralphotometer	Ocean Optics (Dunedin, FL)	USB 2000 (Spektralphotometer) mit PX-2 (Lichtquelle)	zur Messung der spektralen Eigenschaften von Farben
Wasserlöslicher Schulkleber	Elmer's (High Point, NC)	#E304	zur Montage der Spinnen auf einem Nagel/Stift
Holzzahnstocher	Up& Up, Target Corporation (Minneapolis, MN)	#253-05-0125	zum Übertragen von Tropfen von Emaillefarbe