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Methodenartikel

Anbau des Marine Pelagischen Tunikas Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) für experimentelle Studien

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DOI:

10.3791/59832

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9. August 2019

 ,  , 
1Skidaway Institute of Oceanography, University of Georgia, 2Hampton University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Doliolide, einschließlich der Art Dolioletta gegenbauri, sind kleine gelatinöse Marine Zooplankton von ökologischer Bedeutung auf produktiven subkontinentalen Regalsystemen weltweit gefunden. Die Schwierigkeit, diese empfindlichen Organismen zu kultivieren, schränkt ihre Untersuchung ein. In dieser Studie beschreiben wir Anbauansätze für das Sammeln, Aufzucht und die Pflege des Doliolid Dolioletta gegenbauri.

Zusammenfassung

Gelatinezooplanktons spielen eine entscheidende Rolle in den Ökosystemen der Ozeane. Jedoch, Es ist in der Regel schwierig, ihre Physiologie zu untersuchen, Wachstum, Fruchtbarkeit, und trophische Wechselwirkungen in erster Linie aufgrund methodischer Herausforderungen, einschließlich der Fähigkeit, sie zu kulturisieren. Dies gilt insbesondere für die Doliolid, Dolioletta gegenbauri. D. gegenbauri kommt weltweit häufig in produktiven subtropischen Kontinentalschelfsystemen vor, oft in Blütenkonzentrationen, die einen großen Teil der täglichen Primärproduktion verbrauchen können. In dieser Studie beschreiben wir Anbauansätze für das Sammeln, Aufziehen und Pflegen von D. gegenbauri zum Zweck der Durchführung von Laborstudien. D. gegenbauri und andere doliolid Arten können live mit schräg geschleppten konischen 202 m Mesh Planktonnetzen von einem treibenden Schiff gefangen werden. Kulturen werden am zuverlässigsten etabliert, wenn die Wassertemperaturen unter 21 °C liegen und von unreifen Gonozooiden, reifenden Phorozooiden und großen Krankenschwestern gestartet werden. Kulturen können in abgerundeten Kulturgefäßen auf einem sich langsam drehenden Planktonrad gepflegt und auf einer Ernährung von kultivierten Algen im natürlichen Meerwasser für viele Generationen aufrechterhalten werden. Neben der Fähigkeit, Laborkulturen von D. gegenbaurizu etablieren, zeigen wir, dass der Sammelzustand, die Algenkonzentration, die Temperatur und die Exposition gegenüber natürlich bedingtem Meerwasser für die Kultur entscheidend sind. Gründung, Wachstum, Überleben und Reproduktion von D. gegenbauri.

Einleitung

Zooplankton ist die größte tierische Biomasse im Ozean, sind Schlüsselkomponenten in marinen Nahrungsbahnen und spielen eine wichtige Rolle in den biogeochemischen Zyklen der Ozeane1,2. Zooplankton, obwohl aus einer großen Vielfalt von Organismen besteht, kann grob in zwei Kategorien unterschieden werden: gelatinös und nicht-gelatinelatinus mit wenigen Zwischentaxa3,4. Im Vergleich zum nicht-gelatinösen Zooplankton ist das gelatinöse Zooplankton aufgrund seiner komplexen Lebensgeschichten5besonders schwer zu untersuchen und ihre empfindlichen Gewebe werden beim Erfassen und Handling leicht beschädigt. Gelatinezooplankton-Arten sind daher notorisch schwer zu kulturierieren im Labor und im Allgemeinen weniger untersucht im Vergleich zu nicht-gelatinösen Arten6.

Unter den gelatinösen Zooplanktongruppen sind die Thaliaceans eine reichliche und ökologische Bedeutung im Weltmeer. Thaliaceans sind eine Klasse von pelagischen Tunikaten, die die Ordnungen Salpida, Pyrosomida und Doliolida7enthalten. Doliolida, kollektiv als Doliolide bezeichnet, sind kleine fassförmige freischwimmende pelagische Organismen, die in produktiven neritischen Regionen subtropischer Ozeane hohe Mengen erreichen können. Doliolids gehören zu den am häufigsten vorkommenden aller Zooplanktongruppen4,8. Als Suspensionszubringer sammeln Doliolids Lebensmittelpartikel aus der Wassersäule, indem sie Filterströme erzeugen und auf Schleimnetzen erfassen9. Taxonomisch werden Doliolide in das Phylum Urochordata10eingestuft. Die Thaliazer sind neben ihrer ökologischen Bedeutung als Schlüsselkomponenten mariner pelagischer Systeme von Bedeutung für das Verständnis der Ursprünge der kolonialen Lebensgeschichte10,11 und der Evolution. der Akkorddaten5,7,10,12,13,14.

Die Lebensgeschichte der Dolioliden ist komplex und trägt dazu bei, dass es schwierig ist, sie durch ihren Lebenszyklus zu kultivieren und zu erhalten. Einen Überblick über den dolioliden Lebenszyklus und die Anatomie finden Sie in Godeaux et al.15. Der doliolidische Lebenszyklus, der einen obligatorischen Wechsel zwischen sexuellen und asexuellen lebensgeschichtlichen Stadien beinhaltet, ist in Abbildung 1dargestellt. Eier und Spermien werden von den hermaphroditischen Gonozooiden, dem einzigen einsamen Stadium des Lebenszyklus, produziert. Gonozooiden geben Spermien in die Wassersäule frei und Eier werden intern befruchtet und freigesetzt, um sich zu Larven zu entwickeln. Larven schlüpfen und metamorphosen zu Oozooiden, die 1-2 mm erreichen können. Unter der Voraussetzung, dass die bedingungenund die Ernährung förderlich sind, werden Oozooide innerhalb von 1-2 Tagen bei 20 °C zu frühen Krankenschwestern und initiieren die kolonialen Stadien des Lebenszyklus. Oozooiden produzieren asexuell Knospen auf ihrem ventralen Stolon. Diese Knospen verlassen den Stolon und wandern zum dorsalen Cadophor, wo sie sich in drei gepaarten Reihen aneinanderreihen. Die zentralen Doppelreihen werden zu Phorozooiden und die äußeren zwei Doppelreihen zu Trophozooiden. Letztere versorgen sowohl die Krankenschwester als auch die Phorozooiden mit Nahrung16,17. Die Trophozooide versorgen die Krankenschwester mit Nahrung, da sie alle inneren Organe verliert. Mit zunehmender Fülle von Trophozooiden kann die Größe der Krankenschwester im Labor 15 mm erreichen. Während die Phorozooide wachsen, schlucken sie zunehmend planktonische Beute und erreichen eine Größe von 1,5 mm, bevor sie als Individuen17freigelassen werden. Eine einzige Krankenschwester kann > 100 Phorozooide während ihrer Lebensdauer18freisetzen. Nachdem die Phorozoiden aus dem Cadophor befreit wurden, wachsen sie weiter und sind die zweite koloniale Phase des Lebenszyklus. Sobald sie 5 mm groß sind, entwickelt jeder Phorozooid einen Haufen Gonozooide auf seinem ventralen Pedunkel. Diese Gonozooide können Partikel aufnehmen, wenn sie eine Länge von 1 mm erreichen. Nachdem die Gonozooiden 2 bis 3 mm groß sind, werden sie aus dem Phorozooid befreit und werden zum einzigen Einzelstadium des Lebenszyklus. Sobald sie 6 mm groß werden, werden Gonozooide geschlechtsreif17. Gonozooide können 9 mm oder mehr länge werden. Gonozooide sind hermaphroditisch, Spermien werden zeitweise freigesetzt, während die Befruchtung der Eier intern erfolgt16,17. Wenn der Gonozooid 6 mm groß ist, gibt er bis zu 6 befruchtete Eier frei. Erfolgreiche Kultivierung erfordert die Unterstützung der spezifischen Bedürfnisse jeder dieser einzigartigen Lebensgeschichte-Stadien.

Aufgrund der ökologischen und evolutionären Bedeutung der Thaliaceaner, einschließlich der Dolioliden, sind die Kultivierungsmethoden erforderlich, um das Verständnis der einzigartigen Biologie, Physiologie, Ökologie und Evolutionsgeschichte dieses Organismus zu fördern19 . Doliolids haben als experimentelle Modellorganismen in der Entwicklungsbiologie und der funktionellen Genomik erhebliche Versprechen, weil sie transparent sind und wahrscheinlich die Genome20,21gestrafft haben. Der Mangel an zuverlässigen Anbaumethoden behindert jedoch deren Nutzen als Labormodelle. Obwohl eine Handvoll Laboratorien Ergebnisse veröffentlicht haben, die auf kultivierten Dolioliden basieren, wurden zu unserem Wissen Anbauansätze und detaillierte Protokolle bisher nicht veröffentlicht. Basierend auf jahrelanger Erfahrung und Versuchs- und Fehlerkultivierungsversuchen bestand der Zweck dieser Studie darin, Erfahrungen zu überprüfen und Protokolle für die Sammlung und Kultivierung von Dolioliliden, insbesondere der Art Dolioletta gegenbauri,auszutauschen.

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Protokoll

1. Vorbereitung von Aufzuchteinrichtungen Für D. gegenbauri

HINWEIS: Alle benötigten Materialien und Ausrüstungen sind in der Materialtabelleaufgeführt.

  1. Bereiten Sie 1 M Natriumhydroxid (NaOH), 0,06 M Kaliumpermanganat (KMnO4) Lösung vor. Um diese Lösung vorzubereiten, lösen Sie 400 g NaOH in 10 L entionisiertes Wasser auf. 100 g KMnO4 in die NaOH-Lösung geben und gut vermischen.
  2. Eine 0,1 M Natriumbisulfitlösung (NaHSO3) vorbereiten, indem Sie 100 g NaHSO3 in 10 L entionisiertes Wasser auflösen und gut vermischen.
    VORSICHT: Diese Reagenzien sind Reizstoffe, die atemsordenprobleme verursachen können, wenn sie eingeatmet werden. Platzieren Sie in einem gut belüfteten Bereich wie einer Dunstabzugshaube. Vermeiden Sie Hautkontakt. Tragen Sie Schutzhandschuhe, Schutzkleidung, Augenschutz und Gesichtsschutz bei der Handhabung.
  3. Vor der Etablierung und Aufzucht doliolid Kulturen im Labor, reinigen und sterilisieren die Kulturgläser.
    1. Spülen Sie 1,9 L und 3,8 L KulturGläser mindestens 3 mal mit entionisiertem Wasser. Lassen Sie die Schraubverschlüsse trocknen, da die Kappen in den folgenden Reinigungsschritten nicht enthalten sind.
    2. Reinigen und sterilisieren 1,9- und 3,8 L Glaskulturgläser, indem Sie sie in die NaOH/KMnO 4-Lösung eintauchen. Lassen Sie die Gläser über Nacht einweichen.
    3. Entfernen Sie die Gläser aus der NaOH/KMnO 4-Lösung und tauchen Sie die Gläser in die Natriumbisulfitlösung (NaHSO3) ein. Lassen Sie die Gläser über Nacht einweichen.
    4. Entfernen Sie die Gläser aus der NaHSO3 Lösung und spülen Sie sie gründlich mit entionisiertem Wasser ab. Lassen Sie die Gläser trocknen.
  4. Legen Sie das Planktonrad (Abbildung 2) in einen temperaturgeregelten Raum (Umweltkammer). Die Temperatur auf 20 °C ausdemieren. Eine ausführlichere Beschreibung des kundenspezifischen Planktonrades finden Sie in der Ergänzenden Abbildung 1.

2. Phytoplanktonkultur

  1. Erhalten Sie Algenkulturen vom National Center for Marine Algen and Microbiota (NCMA) oder anderen Quellen, die als Nahrung für D. gegenbauriverwendet werden. Mischungen von zwei Flagellate-Arten, darunter Isochrysis galbana (CCMP 1323), Rhodomonas sp (CCMP 740) und ein kleines Diatom, Thalassiosira weissflogii (CCMP 1051) wurden aus der NCMA gewonnen und in früheren Laboren verwendet. Studien, um Doliolids erfolgreich zu hinterziehen17.
  2. Bereiten Sie L1 und L1-Si Wachstumsmedien22 wie von der NCMA empfohlen vor.
  3. Folgen Sie den Anweisungen des Lieferanten, um die neuen Algenkulturen zu initiieren.
  4. Um die Bestandskulturen mit strengen axtischen Kulturtechniken zu erhalten, übertragen Sie alle zwei Wochen 0,5 ml alter Seneszenkultur auf 25 ml frische Wachstumsmedien in sterilen 55 ml Glaskulturröhren.
    HINWEIS: Es ist nicht möglich, lebende Algenkulturen zu speichern, ohne sie regelmäßig zu übertragen. Wenn Kulturen über einen längeren Zeitraum nicht verwendet werden und es nicht möglich ist, Kulturen für die Dauer des Nichtnutzungszeitraums aufrechtzuerhalten, wird empfohlen, diese gemeinsamen Algenkulturen aus ihren ursprünglichen Quellen (z. B. NCMA) wieder zu erwerben.
  5. Bereiten Sie größere Mengen Anbauplankton für die Fütterung von Dolioliden in sauberen 500 ml Kunststoffgewebekulturkolben vor, die 200 ml Wachstumsmedien enthalten.
    1. Phytoplankton aus axtischen Beständen (4 ml) in 200 ml Wachstumsmedien (1:50 Verdünnung) impfen.
    2. Bei 20 °C mit einem 12:12 h-Licht:dunkel-Zyklus unter kühlweißer Lichtbeleuchtung von 65-85 x E/m2inkubieren. Legen Sie Kulturkolben flach, um die Beleuchtung zu maximieren. Sanft wirbeln Kultur täglich.
    3. Bestimmen Sie die Konzentration von Zellen mit einem Partikelzähler oder Mikroskop, um das Wachstum der Kulturen zu überwachen.
      HINWEIS: Nach 7-10 Tagen nach der Impfung enthalten die Flagellate-Kulturen 105-106 Zellen/ml und die Diatomkultur 104-105 Zellen/ml. Diese Konzentrationen reichen aus, um die dolioliden Kulturen zu erhalten.
    4. Initiieren Sie mindestens alle zwei Wochen neue Fütterungsbestände, um genügend Algenbiomasse für die Unterstützung aller Kulturaktivitäten bereitzustellen.

3. Sammlung von wilden Dolioliden und Meerwasser für die Kultur

ANMERKUNG: Abbildung 3ist ein Überblick über die Sammlungs- und Anbauansätze. Eine Beschreibung des spezialisierten Sammelplanktonnetzes und des Kabeljauends ist in Abbildung 4enthalten.

  1. Suchen Sie Doliolid, indem Sie sie entweder mit Planktonnetzen oder In-situ-Bildgebungssystemen erkennen23.
    HINWEIS: Da Doliolids selten in Oberflächengewässern vorhanden sind und nicht durch Fernerkundungstechnik nachweisbar sind, geleitet von der erforderlichen Kenntnis der für Doliolids günstigen Bedingungen (siehe Diskussion), muss das Vorhandensein von Dolioliden bestimmt werden. vor der Probenahme.
  2. Sammeln Sie partikelreiches Meerwasser, bevor Sie lebende Doliolide sammeln, um eine D. gegenbauri-Kultur zu ins Leben zu schaffen.
    1. Setzen Sie Niskin-Flaschen, die auf einer CTD-Rosette oder einer gleichwertigen Ausrüstung montiert sind, ein, um Wasser von dem Ort zu sammeln, an dem sich Doliolid befinden, und aus der Tiefe, die die höchsten Schätzungen von Chlorophyll enthält, eine Konzentration, die durch in situ Fluorometrie geschätzt wird.
      HINWEIS: Chlorophyll eine Konzentration wird als Indikator für Partikelkonzentrationen verwendet. Auf dem Südatlantik-Bight (SAB) Mittelkontinentalschelf ist das untergrundige Chlorophyll in der Regel nahe am Boden, aber an anderen Stellen ist es möglicherweise nicht.
  3. Sobald Doliolide gefunden sind, erholen Sie unbeschädigte Doliolid-Zooiden mit dem spezialisierten Planktonnetz und Kabeljau-Ende. Bevor Sie das Netz einsetzen, füllen Sie das Kabeljau-Ende mit Meerwasser.
    1. Von einem treibenden Schiff, niedriger und heben Sie das Netz durch die Wassersäule mit einem schrägen Abschleppwinkel von 15 - 25° und vertikale Einsatz- und Abrufgeschwindigkeit nicht größer als 15 m/min.
  4. Sobald das Netz an Bord ist, übertragen und teilen Sie den Inhalt des Kabeljau-Endes vorsichtig in 3, 5-Gallonen (ca. 20 l) Plastikeimer, die jeweils 10 l Oberflächenmeerwasser enthalten, das von der Website gesammelt wird.
    HINWEIS: Neue Plastikeimer sollten durch die Zugabe von Meerwasser Tage vor der lebenden doliolid Sammlung konditioniert werden. Ziel ist es, die Auslaugung von Chemikalien aus Kunststoff zu reduzieren. Wenn kein Meerwasser zur Verfügung steht, verwenden Sie gereinigtes (z. B. Milli Q) oder Leitungswasser frei von giftigen Verunreinigungen, um die Eimer zu konditionieren.
  5. Isolieren Sie Doliolid-Zooiden von anderen Plankton.
    1. In kleinen Chargen (ca. 2 l) gemischte Bretter aus dem Netzschleppinhalt (jetzt in 20 L Kunststoffeimer) in einen 2 L Glasbecher übertragen.
    2. Mit einer Breitbohrglaspipette (8 mm ID x 38 cm Länge), vorsichtig siphon und übertragen aktiv schwimmendoliolid Zooiden aus dem Becher in saubere Glaskultur Gläser mit partikelreichem Meerwasser gesammelt mit Niskin-Flaschen, aus denen Doliolids waren befindet.
    3. Lassen Sie die Doliolid-Zooiden vorsichtig unter der Oberfläche des Meerwassers frei.
      HINWEIS: Sammeln Sie Gonozooide, Phorozooide, die angehängte Gonozooide enthalten, und Krankenschwesternstadien, die angehängte Trophozooide enthalten (Abbildung 1).
  6. Fügen Sie nach der Zugabe von Dolioliden Rhodomonas sp. Kultur zu einer Endkonzentration von 5 x 103 – 104 Zellen/ml hinzu (50 ml einer Kultur, die 5 x 104 – 1 x 105 Zellen/ml in einem 3,8 l Glas enthält). Dabei soll festgestellt werden, ob die Doliolid aktiv gefüttert werden. Wenn Doliolids Rhodomonas sp.einnehmen, erscheint ihr Verdauungstrakt rot in der Farbe. Entfernen Sie Zooide, die nicht zu füttern scheinen.
  7. Um zu verhindern, dass Doliolide an der Luft-Wasser-Schnittstelle eingeschlossen werden, vermeiden Sie den Kopfraum in den Kulturgläsern, indem Sie die Gläser vollständig mit ungefiltertem partikelreichem Meerwasser füllen und ein Stück Plastikfolie über die Glasöffnung legen (89 mm breit).
    1. Vermeiden Sie die Schaffung von Luftblasen, die auch die Tiere beschädigen können. Schrauben Sie die Kappe vorsichtig auf das Glas und invertieren Sie das Glas vorsichtig, um festzustellen, ob Blasen vorhanden sind. Wenn Blasen vorhanden sind, entfernen Sie sie.
    2. Nachdem die Gläser gefüllt sind, wischen Sie das überschüssige Wasser von der Außenseite des Glases ab.
  8. Montieren Sie jedes Glas auf das Planktonrad (Abbildung 2), indem Sie das Glas auf die mit Gummirohren überzogenen vertikalen Metallstangen und zwischen einer Schlauchklemme aus Edelstahl legen.
    1. Stellen Sie sicher, dass die Rückseite des Glases gegen den Gummischlauch gepolstert ist. Ziehen Sie die Schlauchklemme um das Glas, indem Sie die Schraube einstellen.
    2. Stellen Sie sicher, dass sich das Glas nicht bewegt, sobald es sicher an Ort und Stelle befestigt ist. Lassen Sie die Gläser bei 0,3 Rpm drehen, um die Doliolids in Suspension zu halten.
      VORSICHT: Es ist wichtig, das Glas nicht zu festziehen, um zu verhindern, dass das Glas knackt.
  9. Halten Sie auf dem Schiff die Kulturgefäße auf dem Planktonrad bei 20 °C in dim light, bis sie in die Laborkulturanlage gebracht werden können.
  10. Nach der Rückkehr ins Labor die Gläser mit Doliolids in die vorbereitete Kultureinrichtung zu übertragen. Montieren Sie Gläser am Planktonrad (siehe Schritt 3.8) und lassen Sie die Gläser bei 0,3 Rpm weiter drehen.
    HINWEIS: Die gesamte Aufzucht von Doliolids in dieser Studie wurde bei 20 °C durchgeführt.

4. Erhaltung der D. gegenbauri-Kulturen

  1. Vom Schiff bis zum Labor, lassen Sie die Tiere in den Originalgläsern an die Laborbedingungen für 3 Tage zu akklimatisieren.
    1. Verwenden Sie während der Eingewöhnungszeit eine Breitbohrglaspipette, um 10% des Wassers mit ungefiltertem partikelreichem Meerwasser aus der Sammelstelle jeden Tag für 3 Tage auszutauschen.
    2. Halten Sie mehrere Copepods im Glas, aber entfernen Sie alle anderen Zooplankton, große Fäkalienpellets und große aggregierte Partikel, die das Filtergerät des Doliolidvers verstopfen können (Schleimnetz). Wenn die Kultur aus frühen Krankenschwestern besteht, halten Sie ein großes Gonozooid (ca. 6 mm) im Glas.
      HINWEIS: Es ist nicht wichtig, welche Copepod-Arten in die Kultur aufgenommen werden, aber in diesem Experiment wurden die am häufigsten vorkommenden Arten verwendet, von denen aus die Doliolids gefangen wurden.
  2. Nach der Akklimatisierungsphase doliolid zooids und copepods aus dem Originalglas in ein sauberes Anbauglas mit 80% Glasfaserfilter (GF/F) gefiltertem Meerwasser und 20% des Meerwassers aus dem Originalglas übertragen. Bereiten Sie gefiltertes Meerwasser vor, indem Sie Meerwasser durch ein GF/F mit einer Nominnoporengröße von 0,7 m Filterpapier filtern.
  3. Erhalten Sie die neue Kultur, indem Sie alle 3 Tage 10 % des Wassers mit GF/F gefiltertem Meerwasser austauschen und Aggregate und Fäkalienpellets entfernen. Wöchentlich Tiere in ein neues Glas überführen, wie in Schritt 4.2 beschrieben.
  4. Füttern Sie Doliolid, indem Sie die Phytoplanktonkonzentrationen in den Kulturgläsern zwischen 40 - 95 °C/L aufrechterhalten.
    HINWEIS: Diese Konzentrationen imitieren Umweltbedingungen, die bekanntermaßen die Blütenbedingungen für D. gegenbauri17unterstützen. Die Mischung der Algenarten variiert je nach Lebensstadium und Anzahl der Zooide in jedem Glas. In den frühen Lebensphasen nur 1:1-Mischung (durch Kohlenstoffgehalt) der Kryptomonadenalgen(Isochrysis galbana und Rhodomonas sp.) hinzufügen. Größere Beutearten können leicht die Fütterungsapparate von kleinen Krankenschwestern und die Entwicklung von Trophozooiden verstopfen. Fügen Sie das Diatom Thalassiosira weissflogii in die Algenmischung, auch bei gleichem Kohlenstoffgehalt, bei der Fütterung größerer Krankenschwestern, Phorozooide und Gonozooide.
    1. Überwachen Sie die Algenkonzentrationen vor und nach der Fütterung, um die Entscheidung zu bestimmen, wie häufig und wie viel Algen den Kulturen hinzugefügt werden sollen. Verwenden Sie einen Partikelzähler, um Algenkonzentrationen zu bestimmen, da die Algenkonzentrationen in den Kulturgläsern relativ verdünnt sind.
  5. Entfernen Sie genügend Zooide, um Algenkonzentrationen von 40 – 95 gC/L beizubehalten, damit die verbleibenden Doliolide genügend Nahrung zum Wachsen haben.
    HINWEIS: Das schwierigste Lebensstadium, das unter Laborbedingungen erfolgreich aufrechterhalten werden kann, sind die sich entwickelnden Larven und Oozooiden (frühe Krankenschwester). Während dieser Phase der Kultur, halten Sie eine große Gonozooid (ca. 6 mm) zusätzlich zu mehreren Copepoden im Glas mit sich entwickelnden Larven und Oozooiden (ca. 20 pro 3,8 l Glas).
  6. Übertragen Sie mindestens 4 Krankenschwestern in ein neues Kultivierungsgefäß, sobald mindestens 8 Trophozooide auf dem Cadophor der Krankenschwester sichtbar sind (Abbildung 1B).
    HINWEIS: Trophozooide verdoppeln sich alle 1 – 2 Tage bei 20 °C. Trophozooide sind groß genug, um mit bloßem Auge sichtbar zu sein.
    1. Entfernen Sie zwei der Krankenschwestern, sobald Krankenschwestern entwickeln 20 Trophozooide.
    2. Entfernen Sie eine Krankenschwester, wenn die Krankenschwestern entwickeln > 30 Trophozooide auf ihren Cadophoren. Erlauben Sie der verbleibenden Krankenschwester, Phorozooide auf ihrem Cadophor zu entwickeln.
    3. Entfernen Sie die Krankenschwester, sobald die Krankenschwester bis zu 30 Phorozooide freisetzt.
  7. Reduzieren Sie die Anzahl der Tiere im Glas, sobald die Phorozooide 3 mm groß werden.
    1. Entfernen Sie alle bis auf vier Phorozooide, wenn die Phorozooide größer werden (> 5 mm) und haben gonozooid Cluster entwickelt.
    2. Reduzieren Sie die Kultur auf zwei Phorozooide, wenn die Anzahl der Gonozooiden-Cluster an Größe zunimmt und zu füttern beginnt.
    3. Entfernen Sie die Phorozooiden, sobald die Phorozooiden bis zu 30 Gonozooide freisetzen.
  8. Reduzieren Sie die Anzahl der Gonozoiden von 30 Zooiden auf 2 pro Glas. Befruchtete Eier in das Glas geben lassen.
    1. Entfernen Sie eine Gonozooid verlassen eine einzelne Gonozooid im Glas, sobald die Oozooiden entwickeln.
      HINWEIS: Ausrangierte Krankenschwestern, Phorozooide und Gonozooide können verwendet werden, um zusätzliche Kulturen auszusäen und weitere Experimente durchzuführen.

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Ergebnisse

Nach den beschriebenen Verfahren zur Erhebung und Kultivierung des Doliolids, D. gegenbauri in Abbildung 3beschrieben, ist es möglich, eine Kultur von D. gegenbauri während seiner komplexen Lebensgeschichte zu erhalten (Abbildung 1) und für viele Generationen erhalten. Obwohl hier der Anbau von D. gegenbauri beschrieben wird, sollten diese Verfahren auch für den Anbau anderer Doliolidarten relevant sein.

Die...

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Diskussion

Die Fähigkeit zur Kultur von Doliolids wurde in den letzten Jahrzehnten etabliert und zur Unterstützung der Forschung in mehreren Bereichen genutzt. Experimentelle Studien in unseren Laboratorien haben die Veröffentlichung von mindestens 15 wissenschaftlichen Studien unterstützt, die sich auf die Fütterung und das Wachstum konzentrierten18,26, Reproduktion18,28, Diät6, <...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu erklären.

Danksagungen

Wir sind dankbar für die vielen Personen, die im Laufe der Jahre an diesem Projekt gesammeltes Wissen, einschließlich G.-A. Paffenhöfer und D. Deibel, die diese Protokolle ursprünglich entwickelt haben. Auch M. Köster und L. Lamboley haben wesentlich zur Entwicklung dieser Verfahren beigetragen.  Die in Tabelle 1 enthaltenen Schätzungen der dolioliden Fülle wurden von N.B. Lépez-Figueroa und Der E.E. Rodriguez-Santiago erstellt. Diese Studie wurde teilweise von der US National Science Foundation awards OCE 082599, 1031263 an MEF, den Kooperationsprojekten OCE 1459293 und OCE 14595010 an MEF und DMG und dem National Oceanic and Atmospheric Administration Award NA16SEC4810007 an DMG unterstützt. Wir danken der fleißigen und professionellen Crew der R/V Savannah. Lee Ann DeLeo bereitete die Figuren vor, Charles Y. Robertson korrekturlas das Manuskript und James (Jimmy) Williams fertigte das Planktonrad

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Algenkulturröhrchen (55 mL sterile Einweg-Glaskulturröhrchen)BeliebigNAFür Algenkulturen
AutoklavBeliebigNAZum Sterilisieren von Geräten und Meerwasser für Algenkulturen
Becher (2 L Glas)BeliebigNAZum Sortieren von verdünntem Plankton Netzinhalt
Eimer (5 Gallonen, ~20L)BeliebigNAZum Verdünnen des Inhalts des Planton-Netzes - sollte vor dem ersten Gebrauch mit Seewasser konditioniert werden
Ballonflaschen (20 L) BeliebigNAZum Aufbewahren von Meerwasser
Doliolid Kulturglas aus Glas (1,9 l Enghalsglas mit Deckel)QorpakGLC-01882Behälter für Kultur
Doliolid Glas Kultivierungsglas (3,8 l Enghalsglas mit Deckel)QorpakGLC-01858Behälter für Kultur
Klimakammer (Temperaturgesteuerte Umweltkammer)BeliebigNAZur Aufnahme von Planktonrädern und Kulturpflege
Filtergeräte für 47 mm FilterBeliebigNAZur Filterung von Meerwasser für Kulturen
Mikrofaserfilter aus Glas, 47 mmWhatman1825-047Zur Filterung von Meerwasser für Kulturen
Glaspipette (Borosillikat Glaspipette (Glasrohr), AD 10 mm, ID 8 mm, Wandstärke 1 mm)Science CompanyNC-10894Kundenspezifischer Schnitt und Kanten
poliert Schlauchschellen, Edelstahl, #104 (178 mm)AlleNAZum Halten von Zuchtgläsern an das Planktonrad
Isochrysis galbana Stamm CCMP1323National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA)Stamm CCMP1323Zur Fütterung von Dolomitenkulturen
L1 Media Kit, 50 LNationales Zentrum für Meeresalgen und Mikrobiota (NCMA)MKL150LZur Kultivierung von Algen
Lampe (Fluoreszierende Tischlampe mit verstellbarem Arm)BeliebigeNAZur Beleuchtung von Dolioliden in Gläsern und Bechern
Beleuchteter temperaturgesteuerter InkubatorBeliebigeNAFür Algenkulturen
Mikropipetten und sterile Spitzen (0-20 & Mikro; L, 20-200 &Mikro; l, 200-1000  &Mikro; l)BeliebigeNAFür Algenkulturen
Plankton Net (202 µ m 0,5 m, 5:1 Länge) mit Steertring und   4 L Steert für AquarienSea-Gear Corporation90-50x5-200-4A/BBZum Sammeln von lebenden Dolomiten (siehe Abbildung 4)
Plankton WheelNANASonderanfertigung (siehe Abbildung 2)
PlastikfolieBeliebigNAZum Abdecken der Innenseite des Deckels von Dolioliden-Kulturgläsern
KaliumpermanganatFisher ScientificP279-500Reagenz zum Reinigen von Gläsern und Glaswaren
Stamm CCMP740National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA)Stamm CCMP740Zur Fütterung von Dolomitenkulturen
GummischlauchNANA ZumHalten von Kulturgläsern an das Planktonrad (kann aus Tygonschläuchen hergestellt werden)
NatriumbisulfitFisher ScientificS654-500Reagenz zum Reinigen von Gläsern und Glaswaren
NatriumhydroxidFisher ScientificBP359-212Reagenz zum Reinigen von Gläsern und Glaswaren
Sterile serologische Pipetten (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)BeliebigeNAFür Algenkulturen
Thalassiosira weissflogii Stamm CCMP1051National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA)Stamm CCMP1051Zur Fütterung von Doliolidenkulturen
Gewebekulturflaschen (250 mL)BeliebigeNAFür Algenkulturen

Referenzen

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