Methodenartikel

Vergleichende Lesionsanalyse durch einen gezielten Sequenzierungsansatz

DOI:

10.3791/59844

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5. November 2019

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1ARC-Net Research Centre, University and Hospital Trust of Verona, 2Department of Diagnostics and Public Health, Section of Pathology, University and Hospital Trust of Verona, 3Department of Medicine (DIMED), Surgical Pathology and Cytopathology Unit, University of Padua

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Identifizierung klonaler und subklonaler Veränderungen zwischen verschiedenen Proben eines bestimmten Patienten. Obwohl sich die hier beschriebenen Experimente auf einen bestimmten Tumortyp konzentrieren, ist der Ansatz im Großen und Ganzen auf andere solide Tumoren anwendbar.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Beurteilung der intratumoralen Heterogenität (ITH) ist von größter Bedeutung, um das Scheitern gezielter Therapien zu antizipieren und entsprechend wirksame Anti-Tumor-Strategien zu entwickeln. Obwohl aufgrund von Unterschieden in der Probenverarbeitung und der Tiefe der Abdeckung häufig Bedenken geäußert werden, hat die Sequenzierung solider Tumoren der nächsten Generation einen sehr variablen ITH-Grad über Tumortypen hinweg entwirrt. Die Erfassung der genetischen Verwandtheit zwischen primären und metastasierenden Läsionen durch die Identifizierung klonaler und subklonaler Populationen ist entscheidend für die Entwicklung von Therapien für Krankheiten im Vorstadium. Hier berichten wir über eine Methode zur vergleichenden Läsionenanalyse, die die Identifizierung klonaler und subklonaler Populationen zwischen verschiedenen Proben desselben Patienten ermöglicht. Der hier beschriebene experimentelle Ansatz integriert drei etablierte Ansätze: histologische Analysen, hochbedeckungsübergreifende Multi-Lesion-Sequenzierung und immuntypische Analysen. Um die Auswirkungen auf den Nachweis subklonaler Ereignisse durch unsachgemäße Probenverarbeitung zu minimieren, haben wir Gewebe einer sorgfältigen pathologischen Untersuchung und neoplastischen Zellanreicherung unterzogen. Qualitätskontrollierte DNA aus neoplastischen Läsionen und normalen Geweben wurde dann einer hohen Abdeckungssequenzierung unterzogen, die auf die Kodierungsregionen von 409 relevanten Krebsgenen abzielte. Während wir nur einen begrenzten genomischen Raum betrachten, ermöglicht unser Ansatz die Bewertung des Ausmaßes der Heterogenität zwischen somatischen Veränderungen (Einzelnukleotidmutationen und Kopien-Anzahl-Variationen) in unterschiedlichen Läsionen eines bestimmten Patienten. Durch die vergleichende Analyse von Sequenzierungsdaten konnten wir klonale und subklonale Veränderungen unterscheiden. Die Mehrheit der ITH wird oft auf Passagiermutationen zugeschrieben; Daher haben wir auch die Immunhistochemie verwendet, um funktionelle Folgen von Mutationen vorherzusagen. Obwohl dieses Protokoll auf einen bestimmten Tumortyp angewendet wurde, gehen wir davon aus, dass die hier beschriebene Methodik im Großen und Ganzen auf andere solide Tumortypen anwendbar ist.

Einleitung

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Das Aufkommen der Next Generation Sequenzierung (NGS) hat die Art und Weise, wie Krebs diagnostiziert undbehandelt1 revolutioniert. NGS gekoppelt mit multiregionaler Sequenzierung haben einen hohen Grad an intratumoraler Heterogenität (ITH) bei soliden Tumorenexponiert 2, was zum Teil das Versagen einer gezielten Therapie aufgrund des Vorhandenseins von Subklonen mit unterschiedlicher Arzneimittelempfindlichkeit erklärt2 . Eine wichtige Herausforderung, die sich aus genomweiten Sequenzierungsstudien stellt, ist die Notwendigkeit, zwischen Fahrgastmutationen (d. h. neutral) und Treibermutationen bei einzelnen Krebsarten zu unterscheiden3. Mehrere Studien haben in der Tat gezeigt, dass bei bestimmten Tumoren, Passagiermutationen machen die Mehrheit der ITH, während Fahrerveränderungen neigen dazu, unter Läsionen der gleichen person /4konserviert werden. Es ist auch wichtig zu beachten, dass große Mutationsbelastung (wie bei Lungenkrebs und Melanom gesehen) nicht notwendigerweise eine große subklonale Mutationsbelastung impliziert2. Daher kann ein hohes ITH-Niveau in Tumoren mit geringer Mutationsbelastung gefunden werden.

Metastasen sind für mehr als 90% der krebsbedingten Todesfälle weltweit verantwortlich5; Daher ist die Erfassung der mutationalen Heterogenität von Treibergenen zwischen primären und metastasierenden Läsionen entscheidend für die Entwicklung wirksamer Therapien für Krankheiten im fortgeschrittenen Stadium. Die klinische Sequenzierung wird in der Regel an Nukleinsäuren aus festem Gewebe durchgeführt, was die genomweite Erforschung aufgrund schlechter DNA-Qualität erschwert. Auf der anderen Seite besteht die Absicht der klinischen Sequenzierung darin, umsetzbare Mutationen und/oder Mutationen zu identifizieren, die die Reaktionsfähigkeit/Nichtreaktion auf ein bestimmtes therapeutisches Regime vorhersagen könnten. Nach dem jetzigen Stand kann die Sequenzierung auf einen kleineren Bruchteil des Genoms beschränkt werden, um klinisch relevante Informationen rechtzeitig zu extrahieren. Der Übergang von DNA-Profilen mit niedrigem Durchsatz (z. B. Sanger Sequencing) zu NGS hat es ermöglicht, Hunderte von krebsrelevanten Genen in einer hohen Tiefe der Abdeckung zu analysieren, was den Nachweis subklonaler Ereignisse ermöglicht. Hier berichten wir über eine Methode zur vergleichenden Läsionenanalyse, die die Identifizierung klonaler und subklonaler Populationen zwischen verschiedenen Proben desselben Individuums ermöglicht. Die hier beschriebene Methode integriert drei etablierte Ansätze (histologische Analyse, hochbedeckungsübergreifende Multi-Lesion-Sequenzierung und immuntypische Analysen), um die funktionellen Folgen der identifizierten Variationen vorherzusagen. Der Ansatz ist schematisch in Abbildung 1 beschrieben und wurde auf die Untersuchung von 5 metastasierenden Fällen von festen pseudopapillaren Neoplasmen (SPNs) der Bauchspeicheldrüse angewendet. Während wir die Verarbeitung und Analyse von formal fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebeproben beschreiben, kann das gleiche Verfahren auf genetisches Material aus frisch gefrorenem Gewebe angewendet werden.

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Protokoll

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Das in der Studie verwendete Material wurde im Rahmen eines spezifischen Protokolls gesammelt, das von der lokalen Ethikkommission genehmigt wurde. Schriftliche Informierte Einwilligung aller Patienten lag vor.

1. Histologische und immunphenotypische Revision von Gewebeproben

HINWEIS: Ein erfahrener Pathologe ist für die im Folgenden beschriebenen Aktivitäten verantwortlich.

  1. Histopathologische Revision ausgewählter Fälle nach etablierten diagnostischen Kriterien.
    1. Verwenden Sie das Mikrotome, um dicke Gewebeabschnitte aus repräsentativen FFPE-Gewebeblöcken zu schneiden und die Abschnitte auf Standard-Histologie-Dias zu montieren.
    2. Führen Sie Hämatoxylin- und Eosinfärbung für jede Folie mit einem automatisierten Gewebeschlitten-Färbe (Tabelle der Materialien).
    3. Überprüfen Sie die histopathologische Diagnose der ausgewählten Tumorfälle nach WHO-Diagnosekriterien.
      HINWEIS: In diesem Stadium könnte der Pathologe morphologisch unterschiedliche Bereiche des Tumors innerhalb desselben Gewebeabschnitts identifizieren. Es ist möglich, diese Flächen getrennt zu ernten (siehe Abschnitt 2). Die histologische Ähnlichkeit von Tumor und normalen Zellen für SPNs ist in Abbildung 2enthalten.
    4. Führen Sie immunhistochemische Färbung für etablierte Marker durch, um die histologische Analyse zu ergänzen und die immunphenotyppic Heterogenität zu schätzen.
      HINWEIS: Der Pathologe könnte immunophenotypisch unterschiedliche Bereiche des Tumors innerhalb desselben Gewebeabschnitts identifizieren. Es ist möglich, diese Flächen getrennt zu ernten (siehe Abschnitt 2).
  2. Bewerten Sie die neoplastische Zellullichkeit des Tumorgewebeabschnitts und planen Sie die manuelle Mikrodissektion entsprechend.
    HINWEIS: Dies ist eine pathologisch generierte Schätzung der Tumorzelllichkeit.
    1. Wenn der neoplastische Zellgehalt des Gewebeabschnitts höher als 70 % ist, ist die manuelle Mikrodissektion nicht obligatorisch; direkt zu Schritt 3.1 wechseln.
      ANMERKUNG: Ziel 70 % des neoplastischen Zellgehalts, um (i) eine ausreichende Empfindlichkeit für mutierte Allelfrequenzschätzungen zu gewährleisten und (ii) klonale Mutationen möglicherweise durch weniger empfindliche Methoden (z. B. Kapillarsequenzierung) zu validieren.
    2. Wenn der neoplastische Zellgehalt des Gewebeabschnitts unter 70 % liegt, ist eine Mikrodissektion erforderlich und wird zu Schritt 2 verschoben.
  3. Bewerten Sie Gewebeabschnitte aus dem FFPE-Block, in denen nichtneoplastisches Gewebe beprobt wurde. Dieses Gewebe wird als Quelle der Keimbahn-DNA verwendet.
    HINWEIS: Blut ist eine alternative Quelle der Keimbahn-DNA. Gehen Sie in diesem Fall mit der DNA-Extraktion wie in der Anmerkung von Schritt 4.1 empfohlen vor.
    1. Wenn im Gewebeabschnitt nur nicht-neoplastisches Gewebe sichtbar ist (Abbildung 2D), wird keine manuelle Mikrodissektion benötigt; direkt zu Schritt 3.1 wechseln.
    2. Wenn eine erhebliche Kontamination durch neoplastische Zellen im Gewebebereich vorhanden ist, ist eine manuelle Mikrodissektion erforderlich; zu Abschnitt 2 zu bewegen.

2. Manuelle Mikrodissektion

HINWEIS: Diese Methode ist auf verschiedene solide Tumortypen anwendbar und soll den Gehalt an neoplastischen Zellen von Gewebeproben erhöhen. Alternativ kann diese Methode verwendet werden, um morphologisch und/oder immunophenotypisch unterschiedliche Bereiche innerhalb desselben Gewebeabschnitts zu ernten.

  1. Schneiden Sie mit einem Mikrotome bis zu zehn 4 x 6 m dicke FFPE-Tumorgewebeabschnitte und montieren Sie sie auf ungeladenen Dias.
    HINWEIS: Wenn nur ein 1 mm2 Nest von Krebszellen in der Probe sichtbar ist, sollten 10 Gewebegische geschnitten und manueller Mikrodissektion unterzogen werden, um die angestrebte Menge an DNA (40 ng) zu erhalten; unter der Annahme, dass 1 mm2 Cluster zwischen 700 und 1000 Tumorkerne enthält.
  2. Inkubieren Sie Dias bei 60 °C für 10 min.
  3. Legen Sie die Dias in ein Rack und führen Sie die folgenden Wässer aus: Xylol für 20 min, 100% Ethanol für 10 min, 80% Ethanol für 10 min, 70% Ethanol für 10 min, destilliertes Wasser für 1 min, Hämatoxylin-Gegenfleck für 10 s, Leitungswasser für 1 min.
  4. Verwenden Sie auf einem standardinvertierten Mikroskop eine 27 G Nadel auf einer Spritze als Mikrodissektionswerkzeug und sammeln Sie repräsentative Cluster von Tumorzellen. Ernten Sie mindestens zehn 1 mm2 Zellhaufen, um die erforderliche DNA-Menge für die Sequenzierung zu gewährleisten.
    HINWEIS: Wenn morphologisch unterschiedliche Bereiche als verschiedene Einheiten analysiert werden sollen, verwenden Sie das Mikrodissektionswerkzeug, um diese Bereiche getrennt zu ernten.
  5. Die geernteten Cluster in 1,5 ml-Rohre (Materialtabelle) legen, die zuvor mit 20 l Protease K und 180 l Lysepuffer(Materialtabelle, beide im DNA-Extraktionskit enthalten) gefüllt waren, und durch Wirbel mischen.

3. Verarbeitung von Geweben ohne vorherige Mikrodissektion

HINWEIS: Dieses Verfahren wird für Gewebeblöcke verwendet, die nur nicht-neoplastische Zellen (Quelle der Keimbahn-DNA) oder mindestens 70% der morphologisch homogenen Krebszellen enthalten.

  1. Mit einem Mikrotom schneiden Bis zu sechs 4 x 5 m dicke Gewebeabschnitte aus ausgewählten FFPE-Gewebeblöcken. Legen Sie Geweberollen in 1,5 ml-Röhren, wie in Schritt 2.5 beschrieben.

4. DNA-Extraktion aus normalen und neoplastischen Zellen

  1. Reinigen Sie DNA aus normalem und neoplastischem Gewebe mit dem DNA FFPE Gewebeextraktionskit (Tabelle der Materialien) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    HINWEIS: Wenn Blut als Quelle von Keimbahn-Nukleinsäure verwendet wird, reinigen Sie die DNA mit einem DNA-Blutextraktionskit (Tabelle der Materialien).
  2. DNA-Quantifizierung und Qualitätskontrolle
    1. Um die Menge der Doppelsträngigen (dsDNA) zu quantifizieren, fügen Sie eine Aliquote der DNA-Probe zu einer Lösung hinzu, die einen fluoreszierenden Nukleinsäurefleck (Materialtabelle) enthält, und messen Sie die emittierte Fluoreszenz mit einem Benchtop-Fluorometer (Tabelle der Materialien ).
      HINWEIS: Der Test misst die Intensität des fluoreszierenden Signals, das von fluoreszierenden Farbstoffen aus dsDNA emittiert wird, und bestimmt die Menge der DNA mithilfe einer Standardkurve.
    2. Verwenden Sie ein Mikrovolumenspektrophotometer (Materialtabelle), um die Verhältnisse 260/280 und 260/230 der Probe zu messen, um die DNA zu qualifizieren. Die "reine" DNA sollte einen Wert von 260/280 von 1,8 und einen 260/230 im Bereich von 1,8 bis 2,2 haben.
      HINWEIS: Die spektrophotometrische Bewertung der Probe soll das Vorhandensein chemischer Verunreinigungen (z. B. Phenol) nachweisen, die sich auf nachgelagerte Reaktionen auswirken. Führen Sie bei Kontamination durch chemische Reagenzien eine Aufräumaktion mit einem säulenbasierten Kit durch.

5. Bibliotheksvorbereitung und Quantifizierung

HINWEIS: Das schematische Flussdiagramm der Bibliotheksvorbereitungs- und Quantifizierungsschritte ist in Abbildung 3dargestellt.

  1. DNA-Bibliotheksvorbereitung (4 Primerpools für jede Probe eingerichtet)
    ANMERKUNG: Die 4 Primerpools gehören zu dem Krebspanel, das inMaterialtabelle. Jeder Pool enthält Primerpaare, die für eine Multiplex-Zielauswahl von 409 Genen ausgelegt sind. Ein Link zur Liste der Gene, aus denen das NGS-Panel besteht, ist inMaterialtabelle.
    1. Bereiten Sie vier DNA-Zielverstärkungsreaktionen für jede Probe vor, eine pro Primerpool. Für jeden Primer-Pool (Tabelle der Materialien), fügen Sie in einem 0,2 ml Rohr ( Tabelle derMaterialien): 4 l Master-Mix ( Tabelleder Materialien, im Bibliotheks-Kit enthalten), 10 l high fidelity Primer Pool-Mix ( Tabelleder Materialien, enthalten in der Krebs-Panel-Bibliothek) und 6 L DNA (10 ng insgesamt).
    2. Amplify Zielregionen jedes Primerpools separat in vier 1,5 ml-Röhren mit folgendem Programm: halten bei 99 °C für 2 min (Aktivierung der Heißstartpolymerase), 16 Zyklen (Denaturierung bei 99 °C für 15 s, Anneal und bei 60 °C für 8 min) , bei 4 °C halten.
      HINWEIS: Haltepunkt. Zielverstärkungsreaktionen bei 4 °C über Nacht oder bei -20 °C länger lagern.
    3. Teilweise Verdauung von Amplicons endet
      HINWEIS: Das vom NGS-Herstellerkit zur Verfügung gestellte Handbuch sieht einen Schritt vor, in dem die verschiedenen Amplifikationsreaktionen jeder Probe vor der teilweisen Verdauung kombiniert werden. Vermeiden Sie diesen Schritt und verarbeiten Sie jede Amplifikationsverdauung getrennt.
      1. Fügen Sie jedem verstärkten Pool jeder Probe 2 L spezifischer Verdauungsmischung(Tabelle der Materialien, im Bibliothekskit enthalten) hinzu (das Gesamtvolumen jedes 0,2 ml-Rohrs beträgt 22 l). Wirbel gründlich und Zentrifugieren jedes Rohr Tröpfchen zu sammeln.
      2. Die Rohre in den Thermocycler laden und folgendes Programm ausführen: 50 °C für 10 min, 55 °C für 10 min, 60 °C für 20 min, 10 °C halten (für bis zu 1 h).
        HINWEIS: Haltepunkt. Platte bei -20 °C länger lagern.
    4. Ligate Adapter zu amplicons und reinigen.
      HINWEIS: Verwenden Sie für jedes Beispiel einen anderen Barcodeadapter, wenn Mehrere Bibliotheken auf einem einzigen Chip sequenziert werden. Alle vier Amplifikationsreaktionen aus derselben Probe müssen denselben Barcode erhalten.
      1. Vorbereiten von Adaptern(Tabelle der Materialien, Barcodes Adapter Kit). Für jeden Barcode X, bereiten Sie eine Mischung aus P1-Adapter und einzigartige Barcode-Adapter (Tabelle der Materialien) bei einer endgültigen Verdünnung von 1:4. Mischen Sie 4 l Wasser mit 2 L P1-Adapter und 2 l eindeutigen Barcode-Adaptern. Verwenden Sie 2 L dieses Barcode-Adapter-Mixfür nachgeschaltete Passagen.
      2. Führen Sie die Ligationsreaktion durch Hinzufügen zu jedem verstärkten Pool jeder Probe in dieser Reihenfolge: 4 l Schalterlösung(Tabelle der Materialien, im Bibliothekskit enthalten), 2 l Barcode-Adapter-Mix und 2 l DNA-Ligase(Tabelle der Materialien, enthalten in Bibliotheksbau) (Gesamtvolumen = 30 L).
      3. Wirbel gründlich und kurz Zentrifugieren, um Tröpfchen zu sammeln.
      4. Laden Sie jedes Rohr in den Thermischen Cycler und führen Sie folgendes Programm aus: 22 °C für 30 min, 68 °C für 5 min, 72 °C für 5 min, 4 °C halten (für bis zu 24 h).
        HINWEIS: Haltepunkt. Platte bei -20 °C länger lagern.
    5. Bibliotheksreinigung und -verstärkung
      1. Zentrifugieren Sie jedes Rohr und übertragen Sie dann jede Barcode-Probe in einem 1,5 ml-Rohr. Fügen Sie jedem Pool jeder Probe 45 L auf Perlen basierendes Reinigungsreagenz (Materialtabelle) hinzu. Pipetten Sie 5x nach oben und unten, um die Perlensuspension mit der DNA zu mischen.
      2. Inkubieren Sie die Mischung für 5 min bei Raumtemperatur (RT), dann legen Sie jedes Rohr in einem magnetischen Rack und inkubieren für 2 min. Vorsichtig entfernen und entsorgen Überstand, ohne das Pellet zu stören.
      3. Fügen Sie in jeder Tube 150 l frisches 70% Ethanol hinzu. Waschen Sie die Perlen, die jedes Rohr nebeneinander der beiden Positionen des Magneten bewegen. Entsorgen Sie den Überstand und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.
      4. Wiederholen Sie die in Schritt 5.1.5.3 beschriebenen Verfahren und halten Sie die Rohre dann im Magneten und trocknen Sie die Perlen bei RT 5 min.
      5. Entfernen Sie Rohre mit gereinigten Bibliotheken jedes Primerpools vom Magneten und fügen Sie 50 L Hochtreue-PCR-Mix (Materialtabelle) und 2 l Bibliotheksverstärkungs-Primer-Mix (Tabelle der Materialien, im Bibliothekskit enthalten) zum Perlenpellet von jede Röhre.
      6. Wirbel jeweils 1,5 ml Rohr und kurz Zentrifuge, um Tröpfchen zu sammeln.
      7. 1,5 ml Rohre für 2 min in den Magneten geben und den Überstand vorsichtig von jedem Rohr auf ein neues 0,2 ml-Rohr übertragen, ohne das Pellet zu stören.
      8. Erweitern Sie die Bibliotheken jedes Primerpools, die das folgende Programm ausführen: halten Sie bei 98 °C für 2 min, um das Enzym zu aktivieren, 5 Zyklen (Denatur bei 98 °C für 15 s, Neal und erstrecken sich bei 64 °C 1 min), halten Bei 4 °C. Proben bei -20 °C lagern.
    6. Reinigung der verstärkten Bibliothek
      1. Zentrifugieren Sie jedes Rohr, um den Inhalt am Boden zu sammeln und jede verstärkte Bibliotheksprobe in ein 1,5 ml-Rohr zu übertragen.
      2. Fügen Sie 25 L perlenbasiertes Reinigungsreagenz hinzu. Pipetten Sie 5x nach oben und unten, um die Perlensuspension mit der DNA zu mischen.
      3. Inkubieren Sie die Mischung für 5 min bei RT, und legen Sie dann Rohre in den Magneten für 5 min.
      4. Übertragen Sie den Überstand, der die Amplicons enthält, vorsichtig von jedem Rohr auf neue Rohre, ohne das Pellet zu stören.
      5. Fügen Sie dem Überstand jedes Rohres und jeder Pipette 60 L perlenbasiertes Reinigungsreagenz hinzu, um Perlensuspension und DNA zu mischen.
      6. Inkubieren Sie die Mischung für 5 min bei RT und legen Sie dann die Rohre in den Magneten für 3 min.
      7. Entsorgen Sie den Überstand aus jedem Rohr und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.
        HINWEIS: Die Amplicons sind an die Perlen gebunden.
      8. Fügen Sie in jeder Tube 150 l frisches 70% Ethanol hinzu. Waschen Sie die Perlen, die die Rohre in den beiden Positionen des Magneten nebeneinander bewegen. Entsorgen Sie den Überstand und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.
      9. Wiederholen Sie den Vorgang in Schritt 5.1.6.8 und trocknen Sie die Perlen bei RT 3 min. Vermeiden Sie übermäßiges Trocknen der Perlen.
      10. Entfernen Sie die Rohre vom Magneten und fügen Sie dem Pellet 50 L niedriger Tris EDTA (TE)(Materialtabelle, im Bibliothekskit enthalten) zum Pellet hinzu, um die Perlen zu dispergieren.
      11. Pipetten Sie die Mischung mehrmals nach oben und unten und inkubieren Bei RT für 2 min.
      12. Legen Sie die Rohre mindestens 2 min in den Magneten und übertragen Sie den Überstand, der die Amplicons enthält, vorsichtig in neue Röhren, ohne die Perlen zu stören.
  2. Bibliotheksquantifizierung
    1. Verwenden Sie ein Fragmentanalyseinstrument (Tabelle der Materialien), um einen DNA-Chip nach dem Hochempfindlichkeits-DNA-Kit-Protokoll auszuführen.

6. Bibliotheken Pooling und Sequenzierung laufen

  1. Verdünnen Sie jede Bibliothek auf 100 pM mit nukleasefreiem Wasser. Kombinieren Sie 10 l von jeder 100 pM-Bibliothek für einen einzigen Durchlauf in einem einzigen Rohr. Mischen Sie die kombinierten Bibliotheken durch Pipettieren und fahren Sie mit dem Templatieren und Sequenzieren fort.
  2. Geplante Lauferstellung
    HINWEIS: Ein typischer Lauf umfasst vier Proben, die auf zwei verschiedene Arten von Halbleiterchips (Ion PI Chip oder Ion 540 Chip) geladen werden können, basierend auf dem im Labor verfügbaren Sequenzer (Ion Proton System oder GeneStudio S5 System, Table of Materials). Diese Systeme erzeugen in der Regel 80 Millionen Lesevorgänge pro Durchlauf.
    1. Öffnen Sie den Torrent-Browser auf einem Computer, der mit dem Sequenzierungssystem verbunden ist (z. B. Ion Chef System), und planen Sie eine neue Ausführung mit der generischen Vorlage für die ausgewählte Anwendung (AmpliSeqDNA).
    2. Wechseln Sie zur Registerkarte Kits des Plans. Wählen Sie Ion Proton System oder Ion GeneStudio S5 System aus der Dropdown-Liste des Instruments basierend auf dem verwendeten Sequenzierungssystem aus.
    3. Wählen Sie je nach Sequenzierungssystem den passenden Chip (PI-Chip für Ion Proton Systems; 540 Chip für Ion GeneStudio S5 Systems) aus der Dropdown-Liste Chip Type aus.
    4. Wählen Sie Ion AmpliSeq 2.0 Library Kit aus der Dropdown-Liste "Bibliothekskit".
    5. Wählen Sie die Schaltfläche Ion Chef für Template Kit und dann das entsprechende Chef Kit (Ion PI Hi-Q Chef Kit für PI Chip oder Ion 540 Kit-Chef für 540 Chip) aus der Dropdown-Liste Template Kit aus.
    6. Wählen Sie das entsprechende Sequenzierungskit (Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit for PI Chip oder Ion S5 Sequencing Kit für 540 Chip) aus der Dropdown-Liste des Sequenzierungskits aus, und wählen Sie dann IonXpress aus der Dropdown-Liste Barcode Set aus.
    7. Wechseln Sie zur Registerkarte Plugin und wählen Sie das Coverage Analysis Plugin aus.
    8. Wechseln Sie zur Registerkarte Plan. Wählen Sie das GENOM GRCh37/hg19 aus der Dropdown-Liste Referenzbibliothek aus. Wählen Sie in der Dropdown-Liste Zielregionen das entsprechende Bedienfeld aus, das sequenziert werden soll.
    9. Legen Sie die Anzahl der zu sequenzierenden Barcodes und das Etikett der Bibliotheksprobenröhren in die entsprechenden Felder fest.
    10. Legen Sie den Barcodenamen und den Beispielnamen für jede Bibliothek fest.
  3. Beispielbibliotheken Verdünnung und Laden.
    1. Verdünnen Sie die Bestandsbibliothek mit nukleasefreiem Wasser auf 25 pM für PI-Chip oder 32 pM für 540 Chip.
    2. Pipetten Sie 50 l jeder verdünnten Bibliothek an den Boden des entsprechenden Bibliotheksprobenrohrs.
    3. Schalten Sie das Sequenzierungssystem ein, und befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, um alle erforderlichen Reagenzien zu laden und den Ausführungsplan zu importieren.
    4. Laden Sie das Beispielrohr der Bibliothek, das die gepoolten Bibliotheken enthält, und starten Sie das Programm zur klonalen Verstärkung.
      HINWEIS: Das Ion Chef System erfordert, dass pro Lauf zwei Chips zubereitet werden.
  4. Sequenzierung auf Ion Proton oder Ion GeneStudio S5.
    1. Aktivieren Sie das Sequenzierungssystem, und befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Sequenzierung zu initialisieren und den Ausführungsplan zu importieren.
    2. Laden Sie den Sequenzierungschip, nachdem Sie ihn aus dem Sequenzierungssystem entfernt haben.
      HINWEIS: Vor dem Aufnehmen eines Chips geerdet werden, um Spanschäden durch elektrostatische Entladung zu vermeiden. Die Spanhandhabung/-positionierung sowie Beispiele für erfolgreiche/erfolglose Beladung sind in Abbildung 4dargestellt.
    3. Schließen Sie den Spanfachdeckel und warten Sie, bis das Chipstatus-Symbol "Bereit" anzeigt.
    4. Leeren Sie den Abfallbehälter, wenn der erste Lauf abgeschlossen ist, und sequenzieren Sie dann den verbleibenden Chip so schnell wie möglich.

7. Mutationen und Kopiernummernvariationen (CNVs) Analyse

ANMERKUNG: Die Ausrichtung der Sequenzierungsdaten auf das menschliche Referenzgenom GRCh37/hg19 wird automatisch durchgeführt, sobald sie im Plan festgelegt sind (Schritt 6.2.8).

  1. Verwenden Sie die Ausgabe des Coverage Analysis Plugins (Tabelle der Materialien), um die Abdeckungstiefe und Homogenität zu überprüfen.
  2. Führen Sie die Variantenaufruf mit dem Torrent-Variante-Aufrufer-Plugin (Tabelle der Materialien) durch, wählen Sie je nach Bedarf die Keimbahn oder den somatischen Workflow aus.
  3. Laden Sie gefilterte Varianten Variant Call Format (VCF) Dateien herunter. Kommentieren Sie Varianten mit der Software Variant Effect Predictor (VEP)6 und der NCBI RefSeq-Datenbank.
  4. Laden Sie Sequenzierungsdaten auf die Ion Reporter Software mit dem Ion Reporter Uploader-Plugin und verwenden Sie den Workflow comprehensive Cancer Panel tumor-normal pair, um die Daten zu analysieren, um CNVs zu schätzen.
  5. Filtern Sie Mutationen und CNVs manuell auf Basis von von der Software zugewiesenen Scores und verifizieren Sie sie visuell mit dem Integrativen Genomics Viewer (IGV)7.
    1. Überprüfen Sie die Ausrichtung visuell auf ungewöhnliche Lesevorgänge (z. B. durch Fehlprimierung, Überverstärkung oder Lesen von Softclipping), die artefactual-Aufrufe erzeugen können.
    2. Überprüfen Sie CNVs, indem Sie die normalisierte Abdeckung für alle Amplicons eines bestimmten Gens mit der normalisierten Abdeckung der Baseline überprüfen.
      HINWEIS: Dies hilft, falsche Anrufe aufgrund der Segmentierungssoftware zu korrigieren, die manchmal eine CNV auf der Grundlage einer symmetrisch abnormalen Abdeckung von wenigen Amplicons am Ende eines Gens und am Anfang des aufeinanderfolgenden Gens aufruft.
  6. Indexierung somatischer Mutationen
    1. Für jeden Fall ruft indexmutation aus der Sequenzierung von normalem Gewebe/Blut, Primärtumor und Metastasen auf.
    2. Flagge als Keimbahn und verwerfen Sie die Rufe, die auch aus der Sequenzierung von Daten der Keimbahn-DNA ersichtlich sind.
    3. Flagge als klonal / Gründer die Mutationen, die unter allen Läsionen eines bestimmten Patienten geteilt werden.
    4. Flagge als subklonal/progressor die Mutationen, die bei einigen, aber nicht allen Läsionen eines bestimmten Patienten nachgewiesen werden.

8. Immunphäobotypische Analyse: Immunhistochemie für relevante Proteinexpression

HINWEIS: Die Immunhistochemie wurde verwendet, um die funktionellen Folgen der Inaktivierung von Mutationen in Tumorsuppressorgenen zu validieren.

  1. Schneiden Sie mit einem Mikrotome 3 x 4 m dicke FFPE-Gewebeabschnitte und montieren Sie sie auf geladenen Dias und inkubieren Sie Dias bei 60 °C für 10 min.
  2. Legen Sie die Dias in ein Rack und führen Sie die folgenden Schritte aus: Xylol für 10 min, Xylol für 10 min, 95% Ethanol für 4 min, 95% Ethanol für 4 min, 70% Ethanol für 4 min, 70% Ethanol für 4 min, destilliertes Wasser für 4 min.
  3. Antigenabruf auf der Grundlage der Indikation der Antikörperhersteller (Materialtabelle).
    1. Legen Sie die Dias in ein Rack mit der spezifischen Antigen-Retrieval-Lösung und tauchen Sie bei Unterkochtemperaturen in ein Wasserbad ein.
    2. Entfernen Sie die Rutschen aus dem Bad und führen Sie Leitungswasser, um für 10 min abzukühlen.
  4. Legen Sie Dias in ein neues Rack mit 3% H2O2 in 1x Tris-gepufferte Salin (TBS) für 20 min bei RT, um endogene Peroxidasen zu inaktivieren.
  5. Legen Sie Dias in ein neues Rack und waschen Sie 3x mit TBS und 0,1% von Tween 20 (TBST).
  6. Verwenden Sie einen PAP-Stift(Tabelle der Materialien), um einen hydrophoben Kreis um das auf Slide-Montierte Gewebe zu zeichnen.
  7. Legen Sie die Dias in eine feuchte Kammer und führen Sie die Blockierung für 1 h bei RT mit 5% Rinderserumalbumin (BSA) in TBST als Blockierlösung durch.
  8. Inkubieren Sie Dias mit primären Antikörpern (Materialtabelle) in einer feuchten Kammer über Nacht bei 4 °C. Primären Antikörper mit Blockierlösung wie empfohlen verdünnen.
  9. Legen Sie Dias in ein neues Rack und waschen Sie 3x mit TBST.
  10. Inkubieren Sie Dias mit spezifischen sekundären Antikörpern (Anti-Maus oder Anti-Kaninchen) (4-5 Tropfen für 1 Rutsche) für 30 min bei RT in einer feuchten Kammer.
  11. Dias in ein neues Rack legen und 3x mit TBST und danach in destilliertem Wasser waschen.
  12. Bereiten Sie 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) Lösung Verdünnung 1 Tropfen in 1 ml Verdünnungspuffer (Tabelle der Materialien). Inkubationsschlitten maximal für 5 min Kontrolle unter dem Mikroskop.
  13. Verwenden Sie eine Positivsteuerung, um die Inkubationszeit zu berechnen, indem Sie die Entwicklung der Reaktion unter dem Mikroskop verfolgen.
    HINWEIS: Jeder Antikörper benötigt eine bestimmte Inkubationszeit.
  14. Inaktives DAB (Stop ChromogenFällung) durch Untertauchen von Dias in destilliertes Wasser.
  15. Gegenfleck gleitet, indem sie in ein neues Rack mit Hämatoxylin für 10 s und dann mit Leitungswasser abspülen.
  16. Legen Sie die Dias in ein Rack und führen Sie die folgenden Schritte aus: 70% Ethanol für 4 min, 70% Ethanol für 4 min, 95% Ethanol für 4 min, 95% Ethanol für 4 min, Xylol für 10 min, Xylol für 10 min.
  17. Siegel-Dias setzen ein paar Tropfen Montagemedium (Tabelle der Materialien) auf jedem Gewebeschlitten und Abdeckung mit Deckel.
  18. Drücken Sie auf den Deckelschlupf, um überschüssige Medien- und Luftblasen vom Gewebe weg und aus dem Deckelrutsch und lufttrocken zu bewegen.
  19. Bewerten und bewerten Sie die Färbeergebnisse unter einem invertierten Mikroskop mit einem erfahrenen Pathologen.
    HINWEIS: Das Bewertungssystem hängt von den spezifischen Antigenen ab, für die informationen in der Literatur bereits vorhanden sein könnten. Wenn Informationen in der Literatur nicht verfügbar sind, leiten Sie ein Bewertungssystem ab, das die Expression des Antigens im normalen Gewebe als Referenz verwendet.

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Ergebnisse

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Der Studienworkflow ist in Abbildung 1dargestellt. Multiläsionen (n = 13) Sequenzierung von 5 SPN-Fällen, die auf die Kodierungssequenzen von 409 krebsbedingten Genen abzielen, identifizierten insgesamt 27 somatische Mutationen in 8 Genen (CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1und FGFR3). Mutationen wurden als Gründer/Klonal definiert, wenn sie unter allen Läsionen eines bestimmten Patienten geteilt wurden, und Pro...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Unsere Methode ermöglicht die Identifizierung molekularer Veränderungen, die an der Progression solider Tumoren beteiligt sind, durch die Integration vertikaler Daten (d. h. Morphologie, DNA-Sequenzierung und Immunhistochemie) aus unterschiedlichen Läsionen eines bestimmten Patienten. Wir demonstrierten die Fähigkeit unserer Methode, klonale und subklonale Ereignisse in einem mutationsstillen Tumortyp (d.h. SPN, fest-pseudopapillares Neoplasma der Bauchspeicheldrüse) zu erkennen, indem wir die Kodierungssequenzen von 409...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Studie wurde vom italienischen Cancer Genome Project (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana Ricerca Cancro (AIRC; Zuschuss Nr. 12182 an AS und 18178 an VC), RP7 European Community Grant (Cam-Pac No 602783 to AS). Die Förderorganisationen spielten weder bei der Erhebung, Analyse und Interpretation von Daten noch beim Schreiben des Manuskripts eine Rolle.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2100 BioanalysegerätAgilent TechnologienG2939BA  Automatisiertes Elektrophorese-Tool
Agencourt AMPure XP BausatzFisher ScientificNC9959336Perlentechnologie für die Aufreinigung von PCR-Produkten; Reinigungsreagenz auf Perlenbasis
Agilent DNA-Kit mit hoher EmpfindlichkeitAgilent Technologien5067-4627Quantifizierung von Bibliotheken
Anti-BAP1Santa Cruz BiotechnologieSC-28383Antikörper
Anti-GLUT1Thermo ScientificRB-9052Antikörper
Anti-KDM6AZelluläre Signalübertragung#33510Antikörper
Anti-p53NovocastraNCL-L-p53-DO7Antikörper
Anti-Β CateninSigma-AldrichNr. C7207Antikörper
Blockierende LösungHausgemacht-5 % Rinderserumalbumin (BSA) in TBST
Inaktivierungslösung für endogene PeroxidasenHausgemacht-3% H2O2 in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) 1x
Leica CV ultraLeica70937891Entellan mountin media
Epitop-Retrieval-Lösung 1Leica BiosystemsAR9961Epitop-Rückgewinnungslösung auf Citratbasis mit einem pH-Wert von 6,0
Epitop-Retrieval-Lösung 2Leica BiosystemsAR9640EDTA-basierte Epitop-Rückgewinnungslösung mit pH 9,0
Eppendorf 0,2 ml PCR Röhrchen, klarEppendorf951010006Rohre
Eppendorf DNA LoBind Röhrchen, 1,5 mLEppendorf22431021Rohre
EthanolDIAPATHNr. A0123IHC-Deparaffinierungsreagenz
ImmEdge Stift  Hydrophob  Barriere  FederVector LaboratorienH&schüchtern; 4000Hydrophober Stift
ImmPACT DAB  PeroxidaseVector LaboratorienSK&schüchtern; 4105HRP-Substrat
ImmPRESS Anti­ Kaninchen  Ig  Reagenz  PeroxidaseVector LaboratorienMP&schüchtern; 7401&schüchtern; 50Sekundärer Antikörper
ImmPRESS Anti­ Maus  Ig  Reagenz  PeroxidaseVector LaboratorienMP&schüchtern; 7402&schüchtern; 50Sekundärer Antikörper
Integrativer Genomik-Viewer (IGV)Breites Institut-https://software.broadinstitute.org/software/igv/home
Ion AmpliSeq Umfassendes KrebspanelThermofisher Scientific4477685Multiplex-Zielauswahl von 409 krebsbezogenen Genen. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0Thermofisher Scientific4480441Vorbereitung von Amplikon-Bibliotheken mit Hilfe von Ion AmpliSeq-Panels
Ion Chef InstrumentThermofisher Scientific4484177Automatisierte Bibliotheksvorbereitung, Vorlagenvorbereitung und Chip-Laden
Ion PI Chip Kit v3 oder Ion 540 ChipThermofisher ScientificA26771 oder A27766Barcode-Chips für die Sequenzierung
Ion PI Hi-Q Chef Kit oder Ion 540 Kit-ChefThermofisher ScientificA27198 oder A30011Vorbereitung der Vorlage
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit oder Ion S5 Sequencing KitThermofisher ScientificA26433 oder A30011Sequenzierung
Ion Proton oder Ion GeneStudio S5 SystemThermofisher Scientific4476610 oder A38196Sequenzierungssystem
Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel Tumor-Normal-PaarThermofisher Scientific4487118Arbeitsablauf
Ion Reporter Software - Uploader-PluginThermofisher Scientific4487118Datenanalyse-Tool
Ion Torrent Suite Software - Coverege Analyse-PluginThermofisher Scientific4483643Plugin, das den Grad der erzeugten Sequenzabdeckung beschreibt
Ion Torrent Suite Software - Variant Caller PluginThermofisher Scientific4483643Plugin, das in der Lage ist, Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), Insertionen und Deletionen in einer Probe über eine Referenz zu identifizieren
Ion Xpress Barcode Adapter 1-96 KitThermofisher Scientific4474517Einzigartige Barcode-Adapter
NanoDrop 2000/2000c SpektralphotometerThermofisher ScientificND-2000Nachweis der DNA-Reinheit
NCBI-Referenzsequenz-Datenbank (RefSeq)NCBI (englisch)-https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/
Platinum PCR SuperMix High FidelityFisher Scientific12532-016 oder 12532-024SuperMix für die PCR-Amplifikation; High-Fidelity-PCR-Mix
QIAamp DNA Blut Mini KitQuiagen51106 0R 51104DNA-Blutextraktionskit
QIAamp DNA FFPE-GewebeQuiagen56404DNA-FFPE-Gewebeextraktionskit
Qubit 2.0 FluorometerThermofisher ScientificFrage 32866DNA-Quantifizierung
Qubit dsDNA BR Assay-KitThermofisher ScientificFrage 32850Kit für die DNA-Quantifizierung auf dem Qubit 2.0 Fluorometer
TBSTHausgemacht-Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) und 0,1 % von Tween 20
Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek FolieSakura Europa6172Automatisiertes Färbeinstrument für Gewebeobjektträger
Software für den Variant Effect Predictor (VEP)EMBI-EBI-http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Werkzeuge/VEP
Xilene, Mischung aus IsomerenCarlo Erba492306IHC-Deparaffinierungsreagenz

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
  2. McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168 (4), 613-628 (2017).
  3. Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
  4. Makohon-Moore, A. P., et al. Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer. Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).
  5. Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. On the origin of cancer metastasis. Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).
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  8. Amato, E., et al. Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas. The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).
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  11. Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692(2013).
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  13. Priestley, P., et al. Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors. bioRxiv. , (2018).

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