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Ex Vivo-Methode zur Beurteilung der spontanen Motilität des Mausreproduktivtrakts und eines MATLAB-basierten Uterus Motion Tracking Algorithmus für die Datenanalyse

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DOI:

10.3791/59848

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1. September 2019

 ,  ,  ,  , 
1The Department of Anatomy, Cell Biology & Physiology, Indiana University School of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Uteruskontraktionen sind wichtig für das Wohlbefinden von Frauen. Jedoch, pathologisch erhöhte Kontraktilität kann zu Dysmenorrhoe führen, vor allem bei jüngeren Frauen. Hier beschreiben wir eine einfache Ex-vivo-Zubereitung, die eine schnelle Beurteilung der Wirksamkeit von glatten Muskelrelaxantien ermöglicht, die zur Behandlung von Dysmenorrhoe verwendet werden können.

Zusammenfassung

Dysmenorrhoe, oder schmerzhafte Krämpfe, ist das häufigste Symptom mit Menses bei Frauen verbunden und seine Schwere kann frauenalltag behindern. Hier präsentieren wir eine einfache und kostengünstige Methode, die für die Erprobung neuer Medikamente zur Verringerung der Gebärmutterkontraktilität entscheidend wäre. Diese Methode nutzt die einzigartige Fähigkeit des gesamten Mausfortpflanzungstraktes, spontane Beweglichkeit zu zeigen, wenn sie ex vivo in einer Petrischale mit sauerstoffhaltigem Krebspuffer gepflegt wird. Diese spontane Beweglichkeit ähnelt der wellenartigen myometrialen Aktivität der menschlichen Gebärmutter, die als Endometriumwellen bezeichnet wird. Um die Wirksamkeit der Methode zu demonstrieren, verwendeten wir ein bekanntes Uterusrelaxant-Medikament, Adrenalin. Wir zeigen, dass die spontane Beweglichkeit des gesamten Mausfortpflanzungstraktes in diesem Petrischalenmodell schnell und reversibel durch 1 M Adrenalin gehemmt werden kann. Die Dokumentation der Veränderungen der Gebärmutterbeweglichkeit kann leicht mit einem gewöhnlichen Smartphone oder einer ausgeklügelten Digitalkamera durchgeführt werden. Wir entwickelten einen MATLAB-basierten Algorithmus, der bewegungstracking ermöglicht, um spontane Veränderungen der Gebärmuttermotilität zu quantifizieren, indem die Rate der Uterushornbewegungen gemessen wird. Ein großer Vorteil dieses ex vivo Ansatzes ist, dass der Fortpflanzungstrakt während des gesamten Experiments intakt bleibt und alle intrinsinininären zellulären Wechselwirkungen bewahrt. Die Hauptbeschränkung dieses Ansatzes ist, dass bis zu 10-20% der Uteri keine spontane Beweglichkeit aufweisen können. Bisher ist dies die erste quantitative Ex-vivo-Methode zur Beurteilung der spontanen Gebärmuttermotilität in einem Petrischalenmodell.

Einleitung

Als wichtiges weibliches Organ ist die Gebärmutter entscheidend für die Fortpflanzung und für die Ernährung des Fötuswesentlich 1. Die Gebärmutter besteht aus drei Schichten: Perimetrium, Myometrium und Endometrium. Das Myometrium ist die Hauptkontraktile Schicht der Gebärmutter und spielt eine Schlüsselrolle bei der Fötuslieferung. Das Endometrium ist die innerste Schicht, die die Gebärmutterhöhle auskleidung und für die Embryoimplantation unerlässlich ist. Bei nicht schwangeren Frauen im reproduktiven Alter wird die Endometriumschicht monatlich zu Beginn des Menstruationszyklus vergossen. Das Myometrium hilft in diesem Vergießensprozess durch die Aufrechterhaltung der spontanen myometrialen Kontraktionen, die für die Reinigung des nekrotischen Endometriumgewebes aus der Gebärmutter benötigt werden1.

Leider, erhöhte myometriale Kontraktilität kann zu negativen Nebenwirkungen wie Dysmenorrhoe führen, oder schmerzhafte Menstruationskrämpfe. Dies ist insbesondere bei jungen Frauen und nulliparösen Frauen2zu beobachten. Jedoch, Dysmenorrhoe ist für jede Frau anders und hängt von der Stärke ihrer myometrialen Kontraktionen; stärkere Kontraktionen sind oft mit dem Gefühl von schweren Krämpfenverbunden 3. Myometriale Kontraktilität kann mit Gebärmutter-Ultraschall visualisiert werden und wird oft als Endometriumwellen erkannt. Verbesserte Freisetzung von Prostaglandinen während der Menstruation4 in der Gebärmutter unteren endometrialen Sloughing wird geglaubt, um zu einer erhöhten myometrialen Hyperkontraktilität beitragen, was zu Ischämie und Hypoxie der Gebärmuttermuskulatur und damit erhöhte Schmerzen3.

Schwere Dysmenorrhoe kann die tägliche Aktivität einiger Frauen behindern und 3 bis 33% der Frauen haben sehr starke Schmerzen, die dazu führen könnten, dass eine Frau für 1 bis 3 Tage jeden Menstruationszyklus bettlägerig ist5. Dysmenorrhoe ist die Hauptursache für gynäkologische Morbidität bei Frauen im reproduktiven Alter unabhängig von Alter, Nationalität und wirtschaftlichem Status5. Die geschätzte Prävalenz von Dysmenorrhoe ist sowohl hoch als auch variabel und reicht von 45 % bis 93 % bei Frauen im reproduktiven Alter5.  Dysmenorrhoe-assoziierte Schmerzen hat einen Einfluss auf das tägliche Leben von Frauen und kann zu schlechten akademischen Leistungen bei Jugendlichen führen, niedrigere Qualität des Schlafes, Einschränkung der täglichen Aktivitäten, und Stimmungsschwankungen5.

Viele Frauen, die schwere Dysmenorrhoe erleben, greifen auf rezeptfreie Medikamente zurück, um ihre Schmerzen zu lindern. Solche rezeptfreien Medikamente enthalten Cyclooxygenase-Inhibitoren (COX), die die Bildung von Prostaglandinen verhindern6. Jedoch, COX-Hemmer sind mit unerwünschten kardiovaskulären Ereignissen verbunden, und etwa 18% der Frauen mit Dysmenorrhoe sind nicht auf diese Inhibitoren reagieren7. Daher gibt es einen Bedarf an neuen Medikamenten, um Menstruationskrämpfe zu reduzieren. Da die Kontraktilität der Gebärmutter zur Pathogenese der Dysmenorrhoe beiträgt, kann eine mögliche Strategie die Verwendung von Gebärmutterrelaxantien sein.

Es ist vorteilhaft, die Auswirkungen von potenziellen Entspannungsmedikamenten in einem Modell natürlich vorkommender spontaner myometrialer wellenähnlicher Kontraktionen zu quantifizieren. Bisher wurde jedoch keine effiziente Ex-vivo-Methode zum Testen von muskelentspannenden Medikamenten in der intakten Gebärmutter beschrieben. Derzeit werden isometrische Spannungsmessungen verwendet, um entspannende Arzneimitteleffekte zu bewerten. Während solcher Messungen wird ein Gebärmuttermuskelstreifen in einem Gewebebad in konstanter Länge unter Vorspannung gehalten, während die Kraft von Gebärmuttermuskelkontraktionen vor und nach der Oxytocin-Stimulation in Gegenwart oder Abwesenheit eines Relaxmittels aufgezeichnet wird. Obwohl dieser Ansatz sehr nützlich ist, erfordert er teure Ausrüstung. Darüber hinaus ähneln isometrische Kontraktionen nicht den spontanen myometrialen wellenartigen Kontraktionen, die natürlicherweise in der intakten Gebärmutter auftreten. Einzigartig ist, dass die uterine myometrialen Wellen bei Nagetieren als Gebärmutterhornmotilität visualisiert werden können, wenn der gesamte Fortpflanzungstrakt (Ovarien, Eileiter, Gebärmutter und Vagina) in einer Pufferlösung gehalten wird. Hier stellen wir eine ex vivo Methode zur Überwachung der spontanen Beweglichkeit der intakten Mausgebärmutter vor, die in einer Petrischale mit sauerstoffhaltigem Krebspuffer platziert wird. Wir beschreiben auch einen Motilitätsquantifizierungsalgorithmus, der den MATLAB Motion Tracker verwendet. Dieser neuartige Ansatz bietet eine einfache und kostengünstige alternative, um das Entspannungspotenzial natürlich vorkommender Heilmittel und synthetischer Verbindungen zu testen.

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Protokoll

Alle Verfahren mit Tieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der Indiana University School of Medicine (Indianapolis, IN) genehmigt. In der Studie wurden 2-5 Monate alte F2-129S-C57BL/6 geschlechtsreife weibliche Mäuse verwendet.

ACHTUNG: Sorgen Sie für Sicherheit, indem Sie einen Labormantel, eine Maske und Handschuhe bei der Arbeit mit Tieren und biogefährlichen Materialien tragen.

1. Lösungsvorbereitung

  1. Bereiten Sie den Krebs Puffer vor, der enthält: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1.2 mM NaH2PO4, 0.56 mM MgCl2, 25 mM NaHCO3, und 5 mMM Glucose, pH 7.4. Kontinuierlich sauerstoffhaltigen den Krebspuffer mit einem Gemisch aus komprimierten Gasen, die 5% CO2 und 95% O2 enthalten, während die Puffertemperatur bei 37 °C mit einem zirkulierenden Wasserbad beibehalten wird.
  2. Dulbeccos Phosphat-Gepufferte Saline (DPBS), dieenthält: 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136,89 mM NaCl, und 8,1 mM Na2HPO4, pH 7,4.

2. Tierzubereitung

  1. Anästhesisieren von Mäusen mit Inhalation von Isofluran (3%) mit Abgasaufräumarbeiten. Gewährleisten Sie eine angemessene Anästhesie durch Bewertung der Entzugsreflexe. Drücken Sie den hinteren Zehen, um zu bestätigen, dass keine Bewegungen ausgelöst werden, was auf den Verlust von Reflexreaktionen hindeutet. Nach der tiefen Anästhesie erreicht ist, einschläfern Sie das Tier durch Enthauptung.
    HINWEIS: Isofluran kann zu einer glatten Muskeldilatation führen. Daher sollte das Fortpflanzungstraktpräparat mindestens 15-30 min vor Beginn der Ex-vivo-Experimente ausgiebig gewaschen und im Krebspuffer inkubiert werden. Isofluran kann Reizungen und Beschwerden verursachen, wenn es in Kontakt mit der Haut ist, also gehen Sie mit Vorsicht vor.
  2. Legen Sie den Körper auf ein großes Wägeboot, das mit einem Papiertuch ausgekleidet ist.
    HINWEIS: Schwangere weibliche Labormitarbeiter sollten nicht in Experimente mit Isofluran beteiligt sein, weil es fetales Gewicht verringern, fetale Skelettverknöcherung verringern und das Risiko einer spontanen Abtreibung erhöhen kann8,9. CO2-Inhalation kann als Ersatz zur Einschläferne von Mäusen verwendet werden.

3. Bestimmung der Estrous-Zyklusstufe

  1. Heben Sie mit kleinen Zangen die Klitoris an, um Zugang zum vaginalen Ostium zu erhalten, und legen Sie langsam eine Mikropipettespitze mit 10 L DPBS in die Vagina ein.
    1. Stellen Sie sicher, dass die Mikropipettespitze in einem Winkel von 10 - 30° durch das Ostium eingeführt wird, um eine Punktion der Vaginalwand zu vermeiden. Die Flüssigkeit sollte nach dem Einsetzen noch in der Spitze sichtbar sein. Wenn die Flüssigkeit nicht sichtbar ist, wurde die Spitze zu weit in die Vagina eingeführt, und der parazervikale Bereich der Vagina könnte perforiert worden sein.
    2. Ziehen Sie leicht auf die vaginalen Ostiummuskeln mit der Spitze der Mikropipette nach unten, damit Luft aus der Vagina austritt.
  2. Spülen Sie die Vaginalhöhle langsam, indem Sie 2-3 Mal mit 10 l DPBS nach oben und unten pfeifen und die gezogene Zellsuspension auf einem Glasschlitten platzieren.
  3. Verwenden Sie ein invertiertes Phasenkontrastmikroskop, um die Estre-Zyklusphase durch zytologische Analyse zu bestimmen. Das Verfahren wird wie an anderer Stelle beschrieben10,11durchgeführt. Stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension nicht austrocknet, bevor eine zytologische Analyse durchgeführt werden kann. Die Suspension kann bei Bedarf mit frischem DPBS verdünnt werden.

4. Maus Reproductive Tract Ddissektion

  1. Ordnen Sie die Maus in einer Supine-Position und verbreiten Sie ihre Extremitäten, um die abdominopelvic Region auszusetzen.
  2. Sprühen Sie mit 70% Ethanol, um den Abdominopelzbereich zu befeuchten und zu desinfizieren.
  3. Mit Zangen, vorsichtig heben Sie die Haut, die der Klitoris überlegen ist. Machen Sie kleine Querschnitte auf den seitlichen Aspekten des unteren Bauchbereichs, bis zu den oberen Extremitäten, um das Peritoneum auszusetzen (Abbildung 1A). Während dieses Vorgangs bildet sich eine externe Klappe. Da ständig kleine Schnitte gemacht werden, wird die Klappe immer größer.
  4. Schneiden Sie vorsichtig durch das Peritoneum, um den Magen-Darm-Trakt zu belichten (Abbildung 1B). Es ist wichtig zu beachten, dass die Gebärmutterhörner oft direkt unter dem Peritoneum liegen können, also machen Schnitte vorsichtig und berühren Sie die Hörner nicht, da dies die Gebärmutterbeweglichkeit beeinflussen kann.
  5. Entfernen Sie mit Zangen die Faszien und das Fettgewebe, das den Magen-Darm-Trakt bedeckt. Entfernen Sie die folgenden Magen-Darm-Traktsegmente aus der Bauchhöhle: das Zwölffingerdarm, Jejunum, Ileum, Cecum, aufsteigender und querer Dickdarm (Abbildung 1C).
  6. Um die Fortpflanzungsorgane zu lokalisieren, identifizieren Sie zuerst die Harnblase (Abbildung 1C, "4"), die aufgrund der Voiding nach der Euthanasie ein deflationiertes Aussehen haben kann. Die Vagina wird direkt unter der Harnblase sein.
  7. Finden Sie die Schamsymphyse am Zusammenfluss der Schamknochen (caudally an der Blase).
  8. Entfernen Sie die Schamsymphyse mit Hilfe einer Schere, indem Sie vorsichtig Schnitte an den Seiten durch das interpubische Fibrocartilagingewebe machen, um Zugang zu erhalten und einen Weg für die Vagina-Extraktion zu bieten (Abbildung 1D).
  9. Schneiden Sie das Perineum zwischen dem Anus und dem unteren Teil der Vulva.
  10. Mit Zangen, heben Sie die Vagina und langsam verbrauchen das Rektum.
  11. Identifizieren Sie zwei Uterushörner, die sich in eine Gabel verzweiten, rostral zur Vagina. Suchen Sie ein verworrenes Eileiter und Eierstock am Ende jedes Horns, das unter den verbleibenden Magen-Darm-Traktsegmenten verborgen sein kann. Verwenden Sie kleine Sezieren Schere, um alle Bänder zu entfernen, die mit verbinden und unterstützen die Hörner, Eileiter, und Eierstöcke in der Bauchhöhle.
  12. Entfernen Sie den Fortpflanzungstrakt, der die Vagina, Gebärmutter, Eileiter und Eierstöcke umfasst, aus der Bauchhöhle.
  13. Übertragen Sie den isolierten Fortpflanzungstrakt (Abbildung 1E) in eine 100 mm Petrischale, gefüllt mit 10 ml DPBS. Komprimieren Sie die Uterushörner nicht, um eine Beschädigung des Myometriums zu vermeiden.
  14. Verwenden Sie Zangen und chirurgische Scheren, um jedes Binde- und Fettgewebe zu entfernen, das die Gebärmutterhörner und Vagina sowie jedes Fell im Schambereich umgibt, das die Bildqualität behindern könnte. Entfernen Sie das breite Band, um die Beweglichkeit der Gebärmutterhörner zu ermöglichen.
  15. Waschen Sie den isolierten Fortpflanzungstrakt zweimal mit frischem DPBS und übertragen Sie ihn in eine 35 mm Petrischale, die mit 3 ml sauerstoffhaltiger Krebslösung gefüllt ist.

5. Gewebe-Bildgebung

  1. Legen Sie die Petrischale mit dem Fortpflanzungstrakt in sauerstoffhaltigen Krebspuffer auf eine schwarze Oberfläche. Bewahren Sie das Gericht bei Raumtemperatur auf.
    HINWEIS: Es ist möglich, ein Infrarot-Wärmepad zu verwenden, um das Gewebe bei 37 °C zu halten.
  2. Lassen Sie 15-30 min für spontane Kontraktionen beginnen. Zeichnen Sie spontane Gebärmuttermotilität für 10 min von einer axialen Ebene mit jeder Art von digitalen Video-Ausrüstung.
  3. Übertragen Sie die Zubereitung in eine Petrischale mit dem sauerstoffhaltigen Krebspuffer, ergänzt durch eine Testverbindung. Zeichnen Sie die spontane Gebärmutterbeweglichkeit für ca. 10 min von einer axialen Ebene mit jeder Art von digitalen Videogeräten auf.
  4. Waschen Sie den gesamten Fortpflanzungstrakt in 100 mm Petrischale mit 10 ml DPBS, um die Reversibilität der Behandlung zu beurteilen.
  5. Die Zubereitung mit dem frisch sauerstoffhaltigen Krebspuffer in eine Petrischale geben. Zeichnen Sie die spontane Gebärmutterbeweglichkeit für ca. 10 min von einer axialen Ebene mit jeder Art von digitalen Videogeräten auf.
  6. Übertragen Sie die Zubereitung auf eine weitere 35 mm Petrischale, gefüllt mit sauerstoffhaltigem Krebspuffer, ergänzt mit dem Fahrzeug für die Testmasse, um sicherzustellen, dass es keine mechanisch induzierten Veränderungen der spontanen Gebärmutterbeweglichkeit gibt. Dies ist ein wichtiges Steuerelement.
  7. Übertragen Sie das Videomaterial auf eine Computerfestplatte.

6. Datenanalyse

  1. Erstellen Sie Clips mit einer beliebigen Videobearbeitungssoftware aus dem Ursprünglichen Videomaterial, das die Steuerungs-, Behandlungs- und Waschepisoden enthält.
  2. Verwenden Sie die MATLAB-Software und das bereitgestellte Skript (siehe Online-Ergänzungsmaterial), um die spontane Gebärmuttermotilität zu quantifizieren.
    HINWEIS: Computer Vision Toolbox Add-on für MATLAB muss installiert werden, damit das Skript voll funktionsfähig ist.
    1. Öffnen Sie das MATLAB-Skript, wechseln Sie zur Registerkarte Editor, und klicken Sie auf Ausführen.
    2. Wählen Sie die erste Videodatei aus, und klicken Sie auf Öffnen.
    3. Geben Sie im Popup-Dialogfeld eine Beschriftung für die Videodatei ein, und klicken Sie auf OK.
    4. Geben Sie das Zeitintervall (s) ein, das für die Berechnung der Hornbewegung erforderlich ist.
    5. Verwenden Sie den Mauszeiger, um zwei Punkte auf dem ersten Frame des Videos auszuwählen. In einem Popup-Fenster wird bestätigt, dass die ausgewählten Punkte für die Nachverfolgung verwendet werden sollen. Klicken Sie auf Start, um den Echtzeitverfolgungsprozess zu initiieren, der im Popupfenster angezeigt wird. Alternativ können Sie auf Punkte auswählen klicken, um die beiden Punkte erneut auszuwählen.
    6. Überwachen Sie die Genauigkeit des Tracking-Prozesses im Popupfenster.
    7. Beobachten Sie ein Rate vs. Zeitstreudiagramm und Entfernung vs. Zeitstreudiagramm in einem neuen Pop-up-Fenster. Speichern Sie die beiden Figuren, indem Sie Datei | Speichern Sie wie im selben Fenster, um die Daten zu dokumentieren.
    8. Suchen Sie einen Ordner mit dem Namen PointTrackerData, der automatisch von MATLAB erstellt wird, in demselben Verzeichnis, in dem sich das MATLAB-Skript befindet. Identifizieren Sie eine Excel-Datei mit dem Namen label_Data, die Datenpunkte enthält, die aus dem Video in zwei separaten Arbeitsblattregisterkarten gesammelt wurden.
      HINWEIS: Jede alternative Motion-Tracking-Software kann verwendet werden, um spontane Gebärmuttermotilität zu quantifizieren.
  3. Verwenden Sie eine geeignete Software (z. B. Excel oder SigmaPlot 13), um die statistische Analyse durchzuführen.

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Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt repräsentative Bilder, die während des gesamten Instandiverdisanzverfahrens aufgenommen wurden, das in diesem Protokoll beschrieben wird. Um eine Kontamination des Puffers mit Fell zu vermeiden, was die Videoqualität verringern würde, befeuchteten wir den Mauskörper mit 70% Ethanol. Der wichtigste Maßstab für den Abschnitt des Protokolls ist die Suche nach der Harnblase. Die Gebärmutter und Vagina wird niedriger als die Harnblase befinden.

Um das...

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Diskussion

Hier beschrieben wir eine Methode zur Beurteilung der spontanen Kontraktilität des gesamten Nagetier-Reproduktionstraktes, die die Eierstöcke, Eileiter, Gebärmutterhörner und die Vagina umfasst. Wir verwendeten eine ähnliche Methode, um die entspannende Wirkung von Phenylephrin auf die spontane Gebärmuttermotilität13zu demonstrieren, aber in der Vergangenheit waren wir nicht in der Lage, quantitative Analyse der Daten zu liefern. In dieser Arbeit haben wir einen Algorithmus für die quantitative Mo...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch interne IU-Mittel unterstützt. AGO konzipierte die Studie. XC und AGO waren an der Gestaltung der beschriebenen Experimente beteiligt.  FL und AGO analysierten und interpretierten die Daten. KLL, JOB, FL führten alle Ex-vivo-Experimente durch. FL schrieb das MATLAB-Skript. KLL, JOB und AGO schrieben das Manuskript.  Alle Autoren lasen und genehmigten die endgültige Fassung des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AdrenalinhydrochloridSigma-Aldbsp; E4642 
Dulbecco's PBSFisher Sceintific 17-512Q
Ethanol 200 PROOFDecon Laboratories2701
NaClSigma-AldrichS7653
GlukoseSigma-AldrichG7528
KClSigma-AldrichP9333
CaCl2 · 2H2OSigma-AldrichC5080
NaH2PO4Sigma-AldrichS0751
MgCl2  · 6H2OSigma-AldrichM9272
NaHCO3Sigma-AldrichS6297
Isofluran, USPPatterson Veterinary07-893-2374
Präparieren Extra-feinspitze Präzisions-SplitterzangeFisher Sceintific13-812-42
gebogene gehärtete FeinirisschereFine Science Tools14091-09
Präparieren Modulares Hochleistungs-StereomikroskopLeicaMZ6 
Digitale 5-Megapixel-Farbmikroskopkamera mit aktivem KühlsystemLeica DFC425 C
Stereomaster-Mikroskop Faseroptische LichtquellenFisher Sceintific 12-562-21
WiegebootFisher Sceintific 
Convertors Astound Standard OP-Kittel Kardinal Gesundheit 9515Kleine, mittlere oder große
HandschuheMcKesson Corporation20-1080Kleine, mittlere oder große; puderfreie sterile OP-Handschuhe aus Latex oder Nitril
  PetrischaleCorning Falcon351029100 mm
  PetrischaleCorning Falcon35300135 mm
95% O2- 5% CO2 GasgemischPraxair  MM OXCD5-K
OhrschlaufenmaskenValumax International5430E-PP
DSLR 24,2 MP KameraCanonEOS Rebel T6i
MATLABMathWorksN/AVersion 2019 oder höher
WB30304

Referenzen

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Schlagwörter

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