Direkter Gene Knock-out von Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Durchführung zeit- und raumbeschränkter Gen-Knock-out in Axolotl-Rückenmarksen vorgestellt, indem der CAS9-gRNA-Komplex in den Zentralkanal des Rückenmarks injiziert wird, gefolgt von Elektroporation.

Zusammenfassung

Das Axolotl hat die einzigartige Fähigkeit, sein Rückenmark vollständig zu regenerieren. Dies ist weitgehend auf die ependymalen Zellen zurückzuführen, die im Laufe des Lebens als neuronale Stammzellen (NSCs) verbleiben, die sich vermehren, um die ependymale Röhre zu reformieren und sich nach einer Rückenmarksverletzung in verlorene Neuronen zu differenzieren. Die Entschlüsselung, wie diese NSCs die Pluripotenz nach der Entwicklung beibehalten und sich bei Rückenmarksverletzungen vermehren, um die exakte Vorverletzungsstruktur zu reformieren, kann wertvolle Einblicke in die Art und Weise liefern, wie sich das Rückenmark von Säugetieren regenerieren kann, sowie mögliche Behandlungsmöglichkeiten. Die Durchführung von Gen-Knock-outs in bestimmten Teilmengen von NSCs innerhalb eines begrenzten Zeitraums wird es ermöglichen, die molekularen Mechanismen hinter diesen regenerativen Prozessen zu untersuchen, ohne durch entwicklungsstörende Effekte verwirrt zu werden. Hier wird eine Methode beschrieben, um Gen-Knock-out in Axolotl Rückenmarks-NSCs mit dem CRISPR-Cas9-System durchzuführen. Durch die Injektion des CAS9-gRNA-Komplexes in den Zentralkanal des Rückenmarks, gefolgt von Elektroporation, werden Zielgene in NSCs innerhalb bestimmter Regionen des Rückenmarks zu einem gewünschten Zeitpunkt ausgeschlagen, was molekulare Studien von Rückenmarks-NSCs während erneuerung.

Einleitung

Das Rückenmark der meisten Wirbeltiere kann sich nach verletzungen nicht regenerieren, was zu einer bleibenden Behinderung führt. Mehrere Salamander, wie das Axolotl, sind bemerkenswerte Ausnahmen. Das Axolotl kann ein strukturell identisches Rückenmark vollständig regenerieren und die Funktion des Rückenmarks vollständig wiederherstellen. Ein Großteil der Regenerationsfähigkeit des Axolotl Rückenmarks ist auf ependymale Zellen zurückzuführen. Diese Zellen säumen den zentralen Kanal, und im Gegensatz zu denen bei Säugetieren bleiben Axolotl-Ependymale Zellen als neuronale Stammzellen (NSCs) nach der embryonalen Entwicklung erhalten. Nach einer Rückenmarksverletzung (z....

Protokoll

Alle Tierversuche müssen in Übereinstimmung mit den lokalen und nationalen Vorschriften über Tierversuche und mit Genehmigung des zuständigen institutionellen Überprüfungsausschusses durchgeführt werden.

1. Vorbereitung des CAS9-gRNA RNP-Mixes

1. Entwerfen und synthetisieren sie gRNAs.
   HINWEIS: Siehe andere Publikationen für das Entwerfen und Synthesisieren von gRNAs, einschließlich einer Publikation, die ausschließlich Axolotls^15,20,21,22betrifft.
2. Erhalten Sie CAS9-NLS-Protein, indem Sie es im....

Ergebnisse

Die Injektion und Elektroporation des CAS9-gRNA-Komplexes gegen Sox2 in den Axolotl-Rückenmarks-Zentralkanal führte zu einem massiven Verlust der SOX2-Immunreaktivität bei der Mehrheit der Spinalband-NSCs, wobei gRNA gegen Tyrosinase (Tyr) als Kontrolle fungierte (Abbildung 2 A). B3-Tubulin (mit TUJ1 gefärbt) ist ein Marker für Neuronen und wurde nicht in NSCs exprimiert, und SOX2- TUJ1-Zellen, die den zentralen Kanal umgeben, wurden als Zellen betrachtet, die S.......

Diskussion

Das beschriebene Protokoll ermöglicht zeit- und raumbeschränkte Gen-Knock-out in den NSCs im Axolotl-Rückenmark. Das aktuelle Protokoll ermöglicht eine spezifische Ausrichtung von NSCs zu einem definierten Zeitpunkt und Ort mit hoher Penetranz. Es vermeidet mögliche unerwünschte Effekte, die durch Gen-Knock-out in NSCs in anderen Regionen wie dem Gehirn entstehen, die bei der Verwendung des Cre-LoxP-Systems auftreten. Es vermeidet auch Entwicklungseffekte, die von einem anhaltenden Knock-out ausgehen, so dass die Untersu.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Benzocain	Sigma-Aldrich	E1501-100G
Benzocain 0,03 % (wt/vol)	Mischen Sie 500 ml von 10&mal; TBS, 500 ml von 400 % (wt/vol) Holtfreter" S-Lösung und 30 ml 10%ige (Gew./vol) Benzocain-Stammlösung. Füllen Sie das Volumen auf 10 L mit dH2O auf. Die Lösung kann bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur gelagert werden.
Benzocain 10 % (wt/vol)	Mischen Sie 50 g Benzocain in 500 ml 100% (vol/vol) Ethanol. Die Lösung kann bis zu 12 Monate bei Raumtemperatur gelagert werden.
Kapillaren aus Borosilikatglas 1,2 mm Außendurchmesser, 0,94 mm Außendurchmesser	Stotter-Instrument	BF120-94-8
CaCl2· 2H2O	Merck	102382
CAS9 Puffer, 10x	Mix 200 mM HEPES und 1,5 M KCl in RNase-freiem Wasser. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,5 ein. Filter, sterilisieren, aliquotieren und bei − 20 &Grad; C für bis zu 24 Monate
CAS9-NLS-Protein	PNA Bio	CP03
Zellkulturschalen, 10cm	Falcon	351029
Dumont #5 - Feine Pinzette	Fine Scientific Instruments	11254-20
Elektroporator	Nepa Gen	NEPA21
	BEX	Impulsgenerator CUY21EDIT II
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252-5G
Fast Green FCF-Lösung, 5x	12,5 mg Fast Green FCF-Pulver in 10 mL 1&mal; Pbs.
Flammender/Brauner Mikropipettenabzieher	Stotter-Instrument	P-97
Holtfreter' S Lösung 400% (Gew./Vol.)	11,125 g MgSO4· 7H2O, 5,36 g CaCl2· 2H2O, 158,4 g NaCl und 2,875 g KCl in 10 l dH2O. Die Lösung kann bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur gelagert werden.
KCl	Merck	104936
MgSO4· 7H2O	Merck	105886
Microloader Pipettenspitzen	Eppendorf	5242956003
Mikromanipulator	Narishige	MN-153
NaCl	Merck	106404
Pneumatic PicoPump	World Precision Instruments	SYS-PV830
Ringzange	Fine Scientific Instruments	11103-09
Stereomikroskop	Olympus	SZX10
Tris-Base	Sigma-Aldrich	T6066
Tris-gepufferte Kochsalzlösung, 10x	24,2 g Tris-Base und 90 g NaCl in 990 ml dH2O auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 8,0 ein, indem Sie 10 ml 37 % (vol/vol) HCl hinzufügen. Die Lösung kann bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur gelagert werden.
Pinzette mit 2 runder Platinplattenelektrode mit variablem Spalt, 10 mm Durchmesser	Nepa Gen

CUY650P10