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Methodenartikel

Direkter Gene Knock-out von Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

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DOI:

10.3791/59850

⸱

9. Juli 2019

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, South China Normal University, 2The Research Institute of Molecular Pathology (IMP), Vienna Biocenter (VBC), 3Institute for Brain Research and Rehabilitation (IBRR), South China Normal University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Durchführung zeit- und raumbeschränkter Gen-Knock-out in Axolotl-Rückenmarksen vorgestellt, indem der CAS9-gRNA-Komplex in den Zentralkanal des Rückenmarks injiziert wird, gefolgt von Elektroporation.

Zusammenfassung

Das Axolotl hat die einzigartige Fähigkeit, sein Rückenmark vollständig zu regenerieren. Dies ist weitgehend auf die ependymalen Zellen zurückzuführen, die im Laufe des Lebens als neuronale Stammzellen (NSCs) verbleiben, die sich vermehren, um die ependymale Röhre zu reformieren und sich nach einer Rückenmarksverletzung in verlorene Neuronen zu differenzieren. Die Entschlüsselung, wie diese NSCs die Pluripotenz nach der Entwicklung beibehalten und sich bei Rückenmarksverletzungen vermehren, um die exakte Vorverletzungsstruktur zu reformieren, kann wertvolle Einblicke in die Art und Weise liefern, wie sich das Rückenmark von Säugetieren regenerieren kann, sowie mögliche Behandlungsmöglichkeiten. Die Durchführung von Gen-Knock-outs in bestimmten Teilmengen von NSCs innerhalb eines begrenzten Zeitraums wird es ermöglichen, die molekularen Mechanismen hinter diesen regenerativen Prozessen zu untersuchen, ohne durch entwicklungsstörende Effekte verwirrt zu werden. Hier wird eine Methode beschrieben, um Gen-Knock-out in Axolotl Rückenmarks-NSCs mit dem CRISPR-Cas9-System durchzuführen. Durch die Injektion des CAS9-gRNA-Komplexes in den Zentralkanal des Rückenmarks, gefolgt von Elektroporation, werden Zielgene in NSCs innerhalb bestimmter Regionen des Rückenmarks zu einem gewünschten Zeitpunkt ausgeschlagen, was molekulare Studien von Rückenmarks-NSCs während erneuerung.

Einleitung

Das Rückenmark der meisten Wirbeltiere kann sich nach verletzungen nicht regenerieren, was zu einer bleibenden Behinderung führt. Mehrere Salamander, wie das Axolotl, sind bemerkenswerte Ausnahmen. Das Axolotl kann ein strukturell identisches Rückenmark vollständig regenerieren und die Funktion des Rückenmarks vollständig wiederherstellen. Ein Großteil der Regenerationsfähigkeit des Axolotl Rückenmarks ist auf ependymale Zellen zurückzuführen. Diese Zellen säumen den zentralen Kanal, und im Gegensatz zu denen bei Säugetieren bleiben Axolotl-Ependymale Zellen als neuronale Stammzellen (NSCs) nach der embryonalen Entwicklung erhalten. Nach einer Rückenmarksverletzung (z.B. durch eine Schwanzamputation) vermehren sich diese NSCs, um die ependymale Röhre nachzuwachsen und sich zu unterscheiden, um verlorene Neuronen1,2,3zu ersetzen. Die Aufdeckung, wie Axolotl Rückenmarks-NSCs pluripotent bleiben und nach einer Verletzung aktiviert werden, kann wertvolle Informationen über die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für menschliche Patienten liefern.

Aufgrund der Fortschritte in der CRISPR-Cas9-Gen-Knock-out-Technik ist die Durchführung von Knock-outs zur Entschlüsselung der Genfunktion einfacher geworden und hat sich bei verschiedenen Arten, einschließlich Axolotls4,5, 6 , 7 , 8. Die kürzliche Veröffentlichung des vollständigen Axolotl-Genoms und Transkriptoms ermöglicht es nun, jeden genomischen Ort gezielt zu betrachten und die Off-Target-Effekte9,10,11,12 besser zu bewerten. , 13 , 14. Optimierte Protokolle wurden für Knock-out und Knock-in in Axolotls mit dem CRISPR-Cas9 System15entwickelt. Die Lieferung der CRISPR-Cas9-Maschinerie in Form von CAS9-Protein-gRNA-Ribonucleoprotein (RNP) hat sich als effizienter erwiesen als die Verwendung von Cas9- und gRNA-kodierenden Plasmiden4. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass die RNP kleiner ist als Plasmidvektoren, ihre Fähigkeit, DNA-Brüche sofort zu erstellen, und der Schutz der gRNA vor DEM RNA-Abbau. Darüber hinaus wird die Transkription und Übersetzung durch RNPs umgangen; Somit vermeidet es Probleme wie Diebesstärke und optimale Codon-Nutzung, wenn Plasmidelemente von einer anderen Spezies abgeleitet werden.

Funktionsverluststudien sind eine der allgemeinen Ansätze zur Untersuchung potenzieller Funktionen von Genen von Interesse. Um die Genfunktion während der Regeneration zu untersuchen, sollte idealerweise ein Knock-out kurz vor einer Verletzung durchgeführt werden, um Auswirkungen auf die Entwicklung zu vermeiden. Darüber hinaus sollte der Knock-out sowohl auf die NSCs als auch auf die Region der Regeneration beschränkt werden. Ein Knock-out des Zielgens in allen NSCs (einschließlich der im Gehirn, was bei Cre-LoxP-Systemen der Fall ist), kann Effekte erzeugen, die nicht mit der Regeneration zusammenhängen und die Interpretation der Ergebnisse verwirren können. Glücklicherweise bietet die Struktur des Axolotl Rückenmarks eine einzigartige Möglichkeit für zeit- und raumbeschränkte Knock-out in NSCs. Die meisten Spinalmark NSCs sind in Kontakt mit dem zentralen Kanal und bilden die überwiegende Mehrheit der Zellen in Kontakt mit dem zentralen Kanal16,17. Daher ermöglicht eine Injektion des CAS9-gRNA-Komplexes in den zentralen Kanal, gefolgt von Elektroporation, die Lieferung an Rückenmarks-NSCs in einem gewünschten Bereich zu einem bestimmten Zeitpunkt4,18,19. Dieses Protokoll zeigt, wie dies geschieht, was zu einem stark durchdringenden Knock-out in den zielgerichteten Rückenmarks-NSCs führt. Anschließend werden anschließend Analysen durchgeführt, um die Auswirkungen auf die Regeneration und das NSC-Verhalten zu untersuchen.

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Protokoll

Alle Tierversuche müssen in Übereinstimmung mit den lokalen und nationalen Vorschriften über Tierversuche und mit Genehmigung des zuständigen institutionellen Überprüfungsausschusses durchgeführt werden.

1. Vorbereitung des CAS9-gRNA RNP-Mixes

  1. Entwerfen und synthetisieren sie gRNAs.
    HINWEIS: Siehe andere Publikationen für das Entwerfen und Synthesisieren von gRNAs, einschließlich einer Publikation, die ausschließlich Axolotls15,20,21,22betrifft.
  2. Erhalten Sie CAS9-NLS-Protein, indem Sie es im eigenen Haus zubereiten oder kommerziell kaufen.
  3. Bereiten Sie die CAS9-gRNA-Mischung vor, indem Sie 5 g CAS9-NLS-Protein, 4 gRNA, 0,9 l 10x CAS9-Puffer mischenund das Volumen mit nukleasefreiem H2 O auf 10 l auffüllen. Aliquot das Gemisch und bei -80 °C lagern, wenn es nicht sofort verwendet wird.

2. Herstellung von Agaroseplatten für die Elektroporation

  1. Bereiten Sie 200 ml 2% (wt/vol) Agaroselösung in 1x DPBS vor. Lösen Sie die Lösung durch Erhitzen in einer Mikrowelle auf und gießen Sie sie auf 10 cm Petrischalen in eine Tiefe von ca. 10 mm (tief genug, um das ganze Tier zu bedecken).
  2. Lassen Sie die Platten bei Raumtemperatur erstarren. Platten bei 4 °C lagern, wenn sie nicht sofort verwendet werden.
  3. Schneiden Sie mit chirurgischen Skalpellen die Agaroseplatte, um einen Schlitz zum Halten des Schwanzes gerade zu machen, einen Brunnen für die Passform in den Körper des Tieres und zwei zusätzliche Brunnen für die Platzierung der Elektroden (Abbildung1E).
  4. Legen Sie die Platte auf Eis und füllen Sie sie bis zum Rand mit eiskalten 1x DPBS. Verwenden Sie die gleiche DPBS-Lösung, um die Platten herzustellen, um eine konsistente elektrische Leitfähigkeit im Setup zu gewährleisten.

3. Konfiguration des Elektroporators

  1. Konfigurieren Sie den Elektroporator. Richten Sie den Poring-Impuls so ein, dass er aus einem bipolaren Impuls von 70 V mit einer Dauer von 5 ms, einem Intervall von 50 ms und keinem Spannungsabfall besteht. Richten Sie den Übertragungsimpuls so ein, dass vier bipolare Impulse von 40 V mit einer Dauer von 50 ms, einem Intervall von 999 ms und 10 % Spannungsabfall aufweisen.
  2. Schließen Sie die Elektroden an den Elektroporator an und stellen Sie die Pinzette auf 7 mm Abstand ein. Untertauchen Sie die Elektroden in einem Becher von DPBS vor und zwischen Elektroporation.

4. Vorbereiten und Beladen von Mikroinjektionsglaskapillaren

  1. Führen Sie einen Rampentest an einem flammenden/braunen Mikropipette-Zieher gemäß den Anweisungen des Herstellers durch, um den Wärmewert zu bestimmen.
  2. Ziehen Sie Injektionskapillaren mit verjüngten Enden mit den folgenden Parametern: Hitze = Rampentestwert, Ziehen = 100, Geschwindigkeit = 100, Zeit = 100.
  3. Beobachten Sie die Nadel unter einem Stereomikroskop. Mit feinen Zangen, brechen Sie die Kapillare in einem Winkel, so dass es eine schräge Spitze hat. Brechen Sie an einer Stelle, wo es dünn genug ist, um den zentralen Kanal anzugreifen, während sie stark genug ist, um die Haut zu durchbohren.
    HINWEIS: Der Punkt, an dem der Durchmesser bei etwa 20 m oder etwa 50% des Rückenmarksdurchmessers liegt, ist ein guter Ausgangspunkt. Möglicherweise sind mehrere Versuche erforderlich, um eine optimale Bretung zu erzielen.
  4. Fügen Sie die Fast Green FCF-Lösung im Verhältnis 1:30 in die RNP-Mischung ein und laden Sie mit einer Microloader-Pipettespitze ca. 5 l Injektionsmischung in die Kapillare.
  5. Montieren Sie die Kapillare an der pneumatischen Pumpe, wobei die schräge Spitze nach unten zeigt.

5. Konfiguration der pneumatischen Pumpe

  1. Konfigurieren Sie die pneumatische Pumpe. Stellen Sie den Haltepunkt auf 0,5 Pfund pro Quadratzoll (psi), ausgeworfen auf 2 psi-Halten und Die Dauer auf Gated.
  2. Testen Sie die Kapillar- und pneumatischen Pumpeneinstellungen, indem Sie die Kapillare in einen Tropfen Wasser tauchen und das Fußpedal drücken, um es zu injizieren. Stellen Sie sicher, dass die Injektionsmischung in einem langsamen, aber stetigen Strom auskommt.
  3. Stellen Sie den Haltedruck ein, wenn die Injektionsmischung spontan austreten oder Wasser die Kapillare aufsaugt. Erhöhen Sie den Auswurfdruck oder brechen Sie mehr von der Kapillare, wenn die Injektionsmischung zu langsam herauskommt. Verringern Sie den Auswurfdruck, wenn die Injektion zu schnell auskommt.

6. Injektion von RNP-Mix in das Rückenmark

  1. Anästhetisieren Sie Axolotls in 0,03% Benzocain-Lösung für mindestens 10 min. Überprüfen Sie, ob die Tiere nicht ansprechbar sind, indem Sie sie im Wasser auf den Kopf stellen.
  2. Nehmen Sie ein Tier mit Ringzange und legen Sie es auf ein Bett aus Silizium, mit der linken Seite des Tieres nach oben und der Schwanz nach rechts zeigen. Positionieren Sie die Injektionsstelle in der Mitte des Sichtfeldes des Stereomikroskops (Abbildung 1A).
  3. Stellen Sie den Mikromanipulator so ein, dass die Kapillare bei 60° von der rechten Seite des Sichtfeldes hereinkommt (Abbildung 1B).
  4. Identifizieren Sie das Rückenmark und den zentralkanal (Abbildung 1C).
    HINWEIS: Das Rückenmark ist die röhrenförmige Struktur über dem Notochord.
  5. Mit Blick auf den zentralen Kanal, bewegen Sie die Kapillare nach vorne, um sanft die Haut und Denk in den zentralen Kanal des Rückenmarks zu durchbohren. Beschränken Sie die Bewegung der Kapillare auf kleine Schritte, da sich das Rückenmark direkt unter den Schwanzmuskeln befindet.
  6. Halten Sie das Fußpedal gedrückt, um die Mischung in den zentralen Kanal zu injizieren. Beobachten Sie, ob sich der RNP-Mix entlang des zentralen Kanals als blaue Linie in beide Richtungen ausbreitet, was zeigt, dass die Kapillare korrekt positioniert wurde (Abbildung 1D).
  7. Wenn dies nicht der Fall ist, halten Sie das Fußpedal gedrückt, während Sie die Kapillare leicht ein- und ausbewegen, bis die RNP-Mischung ein- und ausgeht. Wenn die Kapillare durch Gewebe verstopft wird, löschen Sie sie, indem Sie bei höheren Drücken in Wasser ausstoßen.
  8. Stellen Sie den Auswurfdruck so ein, dass er gerade ausreicht, um die RNP-Mischung im zentralen Kanal auszubreiten, aber nicht so sehr, dass sie die Struktur in die Luft sprengt.
  9. Halten Sie das Fußpedal so gedrückt, dass sich die Injektionsmischung weiter entlang des zentralen Kanals ausbreitet, bis sie das Terminalvesikel am Ende des Rückenmarks und die Ventrikel im Gehirn erreicht.
    HINWEIS: Dies kann je nach Größe des Tieres bis zu 2 min dauern. Es kann notwendig sein, den Druck nach einiger Zeit zu erhöhen, um die RNP-Mischung in die Hirnkammern zu gelangen.
  10. Nach erfolgreicher Injektion so schnell wie möglich mit der Elektroporation fortfahren.

7. Elektroporation

  1. Das Tier mit Ringzangen auf die vorbereitete Agarose-Elektroporationsplatte (Abbildung 1E) auf Eis geben. Legen Sie den Schwanz in den Schlitz, so dass er von Agarose eingeklemmt wird (Abbildung 1F).
  2. Legen Sie die Elektroden in die Brunnen auf beiden Seiten des Schwanzes. Stellen Sie sicher, dass das gesamte Tier und die Elektroden mit eiskaltem PBS abgedeckt sind.
  3. Drücken Sie den Fußschalter, um die Elektroporation zu starten.
  4. Nachdem die Elektroporation abgeschlossen ist, geben Sie das Tier ins Wasser zurück.
  5. Bei Bedarf weitere Tiere injizieren.
  6. Überprüfen Sie, ob die elektropolierten Tiere nach dem Ableben der Anästhesie gesund sind und dass keine Schäden am Schwanz angerichtet werden.

8. Bewertung der Knock-out-Effizienz

  1. Fixieren Sie den Schwanz des elektropolierten Tieres. Machen Sie Querschnitte des Schwanzes gefolgt von immunhistochemischen Färbung, um die Effizienz des Knock-out auf Proteinebene zu beurteilen.
    HINWEIS: Wenn nach der Elektroporation eine Schwanzamputation durchgeführt werden soll, könnte der abgeschnittene Schwanz zu diesem Zweck verwendet werden. Tiere, die mit gRNAs gegen Gfp oder Tyrosinase elektropoiert sind, können beispielsweise als Negativkontrolle verwendet werden4.
  2. Alternativ könnte das elektroporated Rückenmark extrahiert und für DNA lysiert werden. Führen Sie genotypisierende PCR durch, gefolgt von Sanger-Sequenzierung oder Sequenzierung der nächsten Generation, um den Prozentsatz der bearbeiteten genetischen Loci15zu bewerten.
    HINWEIS: Die resultierende Bearbeitungseffizienz wird die tatsächliche Bearbeitungseffizienz für NSCs unterschätzen, da nicht-elektroporated Zellen und Neuronen enthalten sind, die keinen apikalen Kontakt zum zentralen Lumen haben und daher den RNP-Mix nicht erhalten.

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Ergebnisse

Die Injektion und Elektroporation des CAS9-gRNA-Komplexes gegen Sox2 in den Axolotl-Rückenmarks-Zentralkanal führte zu einem massiven Verlust der SOX2-Immunreaktivität bei der Mehrheit der Spinalband-NSCs, wobei gRNA gegen Tyrosinase (Tyr) als Kontrolle fungierte (Abbildung 2 A). B3-Tubulin (mit TUJ1 gefärbt) ist ein Marker für Neuronen und wurde nicht in NSCs exprimiert, und SOX2- TUJ1-Zellen, die den zentralen Kanal umgeben, wurden als Zellen betrachtet, die S...

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Diskussion

Das beschriebene Protokoll ermöglicht zeit- und raumbeschränkte Gen-Knock-out in den NSCs im Axolotl-Rückenmark. Das aktuelle Protokoll ermöglicht eine spezifische Ausrichtung von NSCs zu einem definierten Zeitpunkt und Ort mit hoher Penetranz. Es vermeidet mögliche unerwünschte Effekte, die durch Gen-Knock-out in NSCs in anderen Regionen wie dem Gehirn entstehen, die bei der Verwendung des Cre-LoxP-Systems auftreten. Es vermeidet auch Entwicklungseffekte, die von einem anhaltenden Knock-out ausgehen, so dass die Untersu...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Wir danken Prof. Elly M. Tanaka für ihre kontinuierliche und langfristige Unterstützung. Diese Arbeit wurde von einem Stipendium der National Natural Science Foundation of China (NSFC) (317716), Research Starting Grants der South China Normal University (S82111 und 8S0109) und einem China Postdoctoral Science Foundation Grant (2018M633067) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AgaroseSigma-AldrichA9539
BenzocainSigma-AldrichE1501-100G
Benzocain 0,03 % (wt/vol)Mischen Sie 500 ml von 10&mal; TBS, 500 ml von 400 % (wt/vol) Holtfreter" S-Lösung und 30 ml 10%ige (Gew./vol) Benzocain-Stammlösung. Füllen Sie das Volumen auf 10 L mit dH2O auf. Die Lösung kann bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur gelagert werden.
Benzocain 10 % (wt/vol)Mischen Sie 50 g Benzocain in 500 ml 100% (vol/vol) Ethanol. Die Lösung kann bis zu 12 Monate bei Raumtemperatur gelagert werden.
Kapillaren aus Borosilikatglas 1,2 mm Außendurchmesser, 0,94 mm AußendurchmesserStotter-Instrument BF120-94-8
CaCl2· 2H2OMerck102382
CAS9 Puffer, 10xMix 200 mM HEPES und 1,5 M KCl in RNase-freiem Wasser. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,5 ein. Filter, sterilisieren, aliquotieren und bei − 20 &Grad; C für bis zu 24 Monate
CAS9-NLS-Protein   PNA BioCP03
Zellkulturschalen, 10cmFalcon351029
Dumont #5 - Feine PinzetteFine Scientific Instruments11254-20
ElektroporatorNepa Gen NEPA21
BEXImpulsgenerator CUY21EDIT II
Fast Green FCFSigma-AldrichF7252-5G
Fast Green FCF-Lösung, 5x12,5 mg Fast Green FCF-Pulver in 10 mL 1&mal; Pbs.
Flammender/Brauner Mikropipettenabzieher Stotter-Instrument P-97
Holtfreter' S Lösung 400% (Gew./Vol.) 11,125 g MgSO4· 7H2O, 5,36 g CaCl2· 2H2O, 158,4 g NaCl und 2,875 g KCl in 10 l dH2O. Die Lösung kann bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur gelagert werden.
KClMerck104936
MgSO4· 7H2OMerck105886
Microloader PipettenspitzenEppendorf5242956003
Mikromanipulator NarishigeMN-153 
NaClMerck106404
Pneumatic PicoPumpWorld Precision Instruments SYS-PV830
RingzangeFine Scientific Instruments11103-09
StereomikroskopOlympusSZX10 
Tris-BaseSigma-AldrichT6066
Tris-gepufferte Kochsalzlösung, 10x24,2 g Tris-Base und 90 g NaCl in 990 ml dH2O auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 8,0 ein, indem Sie 10 ml 37 % (vol/vol) HCl hinzufügen. Die Lösung kann bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur gelagert werden.
Pinzette mit 2 runder Platinplattenelektrode mit variablem Spalt, 10 mm DurchmesserNepa Gen 
CUY650P10

Referenzen

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