Methodenartikel

Low-Cost Gait Analyse für Verhaltens-Phänotypisierung von Maus-Modellen von neuromuskulären Erkrankungen

DOI:

10.3791/59878

⸱

18. Juli 2019

 ,  ,  , 
1Department of Neurology, Duke University School of Medicine, 2Duke Center for Neurodegeneration & Neurotherapeutics, Duke University School of Medicine, 3Biomedical Sciences Graduate Program, University of California San Diego, 4Department of Neurobiology, Duke University School of Medicine, 5Department of Cell Biology, Duke University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Footprint-Analyse ist eine kostengünstige Alternative zu digitalisierten Ganganalyseprogrammen für Forscher, die Bewegungsanomalien bei Mäusen quantifizieren. Aufgrund seiner Geschwindigkeit, Einfachheit und Längspotenzial, Es ist ideal für Verhaltens-Phänotypisierung von Mausmodellen.

Zusammenfassung

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Die Messung der Tierischen Fortbewegung ist ein gängiges Verhaltenswerkzeug, das verwendet wird, um den Phänotyp einer bestimmten Krankheit, Verletzung oder eines Drogenmodells zu beschreiben. Die hier gezeigte kostengünstige Methode der Ganganalyse ist ein einfaches, aber effektives Maß für Ganganomalien in murinen Modellen. Fußabdrücke werden analysiert, indem man die Füße einer Maus mit ungiftiger waschbarer Farbe bemalt und dem Subjekt ermöglicht, auf einem Blatt Papier durch einen Tunnel zu gehen. Das Design des Testtunnels nutzt das natürliche Mausverhalten und deren Affinität zu kleinen dunklen Stellen. Die Schrittlänge, Schrittbreite und Zehenausbreitung jeder Maus wird leicht mit einem Lineal und einem Bleistift gemessen. Dies ist eine etablierte und zuverlässige Methode, und es erzeugt mehrere Metriken, die analog zu digitalen Systemen sind. Dieser Ansatz ist sensibel genug, um Schrittänderungen frühzeitig in der Phänotyp-Präsentation zu erkennen, und aufgrund seines nicht-invasiven Ansatzes ermöglicht er das Testen von Gruppen über die Lebensdauer oder phänotypische Darstellung hinweg.

Einleitung

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Fortbewegung erfordert komplexe neurologische und Muskel-Skelett-Koordination, und Defizite in einem einzigen Aspekt der motorischen Wege können beobachtbare Ganganomalien produzieren1,2. Die Gait-Analyse ist ein wichtiges Werkzeug für Forscher, die Mausmodelle testen, da sie quantifizierbare Verhaltensdaten darüber liefert, wie sich eine bestimmte Krankheit, Verletzung oder ein Medikament auf die Bewegung eines Tieres auswirkt3. Die digitalisierte Ganganalyse erfordert jedoch den Kauf eines Laufbandes, einer Kamera und der dazugehörigen Software, was für Forscher unerschwinglich teuer sein kann. Die Gait-Analyse wird häufig verwendet, um Längsänderungen in der Motorfunktion zu verfolgen, daher kann es schwierig sein, die Ausgaben zu rechtfertigen, wenn sporadisch4verwendet wird. Obwohl digitalisierte Analysen detailliertere Gangmetriken liefern können als einfache Footprint-Analysen, sind diese komplexeren Kennzahlen nicht immer notwendig oder relevant für die Charakterisierung eines Verhaltensphänotyps5.

Hier stellen wir eine kostengünstige manuelle Footprint-Analysemethode als schnelle und sensible Alternative zu digitalisierten Ganganalyseprogrammen6,7vor. Die manuelle Fußabdruckanalyse hat gezeigt, dass signifikante Gangunterschiede in einer Vielzahl von Modellen für murine Erkrankungen4,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16,17, und in mindestens einem Fall identifizierte diese low-cost-Methode wurden von einem gemeinsamen digitalisierten Ganganalyseprogramm12nicht erkannt. Die Gesamtkosten der Materialien sind nominell und können leicht an andere Nagetier-Forschungsmodelle angepasst werden.

Obwohl es viele verschiedene Gangmetriken gibt, aus denen Daten entnommen werden können, konzentriert sich die beschriebene Methode auf drei spezifische Metriken: Schrittlänge, Schrittbreite (auch "Spurbreite" genannt) und Zehenstreuung. Es ist wichtig zu beachten, dass die zu bewertenden Parameter modellweise festgelegt werden sollten. Diese Methode der Ganganalyse ist nicht entwickelt, um kognitive Funktion zu messen, und es wird nicht für Studien empfohlen, die komplexe biomechanische Messungen von Gang16erfordern.

Wir präsentieren Verhaltensdaten aus einer Kohorte von prä- und postsymptomatischen Mäusen, die X-verknüpfte Spinal- und Bulbar-Muskelatrophie (SBMA) modellieren, eine neuromuskuläre Erkrankung, die durch motorische Neuronendegeneration und Muskelatrophie gekennzeichnet ist. Diese Mäuse entwickeln progressive Defizite im Gang, die mit dem Auftreten anderer krankheitsspezifischer Phänotypen zusammenfallen. Dies zeigt die Gültigkeit und Spezifität dieser Methode und bestätigt, dass sie zuverlässig zwischen betroffenen und nicht betroffenen Tieren unterscheiden kann.

Die experimentellen Mäuse in dieser Studie waren 2,5 (vorsymptomatisch) und 9 Monate alte (postsymptomatische) BAC fxAR121 transgene Mäuse auf einem C57BL/6-Hintergrund (nexpt=12). Dieses Modell wurde in unserem Labor generiert und wurde vollständig als leistungsstarkes Mausmodell von SBMA9charakterisiert. Als Kontrollelemente wurden nicht-transgene Littermate verwendet (nStrg=8). SBMA ist eine geschlechtsbegrenzte Krankheit, die sich vollständig nur bei Männern manifestiert, so dass männliche Mäuse ausschließlich für diese Studie verwendet wurden. Während der Planungsphase müssen die Forscher die Überlegungen der National Institutes of Health zum Geschlecht als biologische Variable berücksichtigen, um Gruppengrößen und Zusammensetzung18zu bestimmen.

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Protokoll

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Alle Tests, die mit Mäusen durchgeführt wurden, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Duke University überprüft und genehmigt. Das für die Prüfung und Bewertung verantwortliche Personal muss bis zur Gaitanalyse und Bewertung der Papiere für die gesamte Kohorte für den Tiergenotyp oder den Versuchszustand geblendet werden.

1. Prüfmaterialvorbereitung

  1. Führen Sie Tests mit einem Tunnel aus 3 vorgeschnittenen klaren Acrylplatten, die 0,375 Zoll dick sind. Montieren Sie Tunnel durch Kleben von Platten zusammen mit einem Dichtmittel, das speziell Acryl bindet und beim Trocknen keine Gerüche aussendet.
    1. Verwenden Sie für Standard-C57BL/6-Mäuse die folgenden Tunnelmessungen: 2,5 in. breit, 3 in. hoch und 13 in. lang. Mäuse müssen bequem durch den Tunnel gehen und genügend Schritte (>4) machen können, damit Gang gemessen werden kann.
  2. Konstruieren Sie die Torkammer mit vorgeschnittenen grauen Acrylplatten 0,375 Zoll dick, zusammengeklebt mit dem gleichen Dichtmittel wie auf dem Tunnel verwendet. Die Innenmaße der Kammer sind 4 in. breit, 4 zoll lang und 3 zoll hoch. Passen Sie die Öffnung dieser Kammer an die Öffnung des Tunnels an (2,5 Zoll breit x 3,0 Zoll hoch). Da die Mäuse natürlich abgedunkelte Räume gut beleuchteten Räumen vorziehen, verwenden Sie Material, das undurchsichtig und dunkel ist.
  3. Verwenden Sie Papier für die Verfolgung von Schritten, die dick und glatt sind (Aquarellpapier funktioniert gut). Schneiden Sie einzelne Papierstreifen etwas breiter und länger als die Breite und Länge des Tunnels. Wenn Sie die hier beschriebenen Tunnelabmessungen verwenden, schneiden Sie die Papiere auf 15 in. lang um 3,5 in. breit.
  4. Verwenden Sie zwei kontrastierende Farben (z. B. Grün und Violett) von ungiftiger waschbarer Farbe auf Wasserbasis. Weisen Sie eine Farbe für Hinterbeine zu, die zweite für Vorderbeine. Mäuse lecken die restliche Farbe nach dem Testen von ihren Füßen, so dass die ausgewählte Farbe völlig ungiftig sein muss.
  5. Verwenden Sie zwei runde Fasspinsel, eine für jede Farbe Farbe (0,5 cm Durchmesser, verjüngte/spitze Bürstenspitze).
  6. Wählen Sie ein Lineal mit Markierungen bis zu Millimetern und einen Bremssattel mit Maßen bis zu 0,1 mm. Bleistift wird empfohlen, auf die Scoring-Papiere zu schreiben.
  7. Optional: Für Tiere mit hoher Angst oder geringer Motivation, bieten einen Verhaltensanreiz in der Torkammer. Dies kann kleine Mengen sterilisierter Sonnenblumenkerne umfassen (in den Heimischen Käfig gestellt 2 Tage vor dem Testen, um die Gewöhnung zu ermöglichen). Legen Sie am Testtag Sonnenblumenkerne in die Zielkammer, um Mäuse zum Durchgehen zu ermutigen, ohne anzuhalten.

2. Datenerhebung

  1. Wenn Tests in einem separaten Raum durchgeführt werden, akklimatisieren Sie die Mäuse für 30 Minuten in den neuen Raum und starten Sie dann die Verhaltenstests. Darüber hinaus, da Mäuse natürlich nachtartig sind, stellen Sie sicher, dass alle Mäuse mindestens 5 Minuten lang wach und wachsam sind, bevor Sie testen.
  2. Bereiten Sie die Testeinrichtung vor, indem Sie den Tunnel über dem Papier positionieren und das Papier mit der Maus-ID und dem Testdatum markieren. Positionieren Sie die Torkammer am Ende des Tunnels und verbinden Sie beide offenen Enden. Fügen Sie Sonnenblumenkerne am Ende des Tunnels (innerhalb der Torkammer) zur Motivation hinzu, wenn nötig.
  3. Entfernen Sie die Maus, um aus ihrem Käfig getestet werden, und greifen Sie sie fest durch ihre Scruff, um sicherzustellen, dass der Schwanz zu greifen, um die Bewegung seiner Hinterbeine zu stabilisieren.
  4. Farbe Vorpaws so die gesamte Unterseite aller Zehen und die Mitte des Fußes sind vollständig mit Farbe bedeckt. Wiederholen Sie dies mit einer kontrastierenden Farbe auf den Hinterpfoten. Wischen Sie jede Farbe ab, die die Maus auf andere Teile ihres Körpers mit einem sauberen feuchten Tuch erhält, um Flecken zu verhindern, die die Datenerfassung stören können.
    HINWEIS: Die Mausbehandlung muss von erfahrenen Forschern durchgeführt werden, um den Stress der Tiere zu minimieren.
  5. Platzieren Sie die Maus am Anfang des Tunnels und lassen Sie sie den ganzen Weg in die Torkammer gehen, und holen Sie dann die Maus, wischen Sie vorsichtig ihre Füße mit einem wassergedämpften Tuch ab und kehren Sie sie in ihren Heimatkäfig zurück.
  6. Lassen Sie Papier mit Fußabdrücken vollständig trocknen, bevor Sie punkten. Wischen Sie den Testbereich herunter und tunneln Sie mit Ethanol oder einer gleichwertigen Reinigungslösung zwischen jedem Tier.

3. Bewertungskriterien

  1. Verwenden Sie Schritte, die konsistent mit klaren, nicht verschmierten Footprints für die Bewertung platziert sind. Abbildung 1B ist ein gutes Beispiel für eine Footprint-Sequenz, die bewertet werden kann. Um ausreichende Bewertungsdaten zu generieren, müssen mindestens 2 aufeinanderfolgende Schritte von jedem Fuß vorhanden sein, aber 4-6 Schritte pro Fuß werden empfohlen. Schließen Sie nicht die ersten und letzten Fußabdrücke auf dem Papier ein, da sie wahrscheinlich keinen normalen Gang darstellen, da die Maus ihre Gehgeschwindigkeit ändert.
  2. Verwenden Sie Schrittlänge, Schrittbreite und Zehenstreuung als drei verschiedene Messgrößen des Ganges, die mit dieser Methode analysiert werden können.
    HINWEIS: Schrittlänge und -breite erfordern klare sequenzielle Drucke, bei denen der Vorfußbereich in Farbe gut definiert ist. Zehenstreuung erfordert keine sequenziellen Drucke für die Bewertung, sondern nur klargedruckte Der erste und letzte Toes auf einem einzigen Fuß. Wenn jedoch ein bestimmter Footprint nicht in Messungen der Schrittlänge oder -breite enthalten ist, kann er nicht für die Zehenausbreitung bewertet werden. Alle drei Maßnahmen werden in Zentimetern bewertet.
    1. Definieren Sie die Schrittlänge als Abstand zwischen zwei sequenziellen Footprints, die mit demselben Fuß erstellt werden (d. h. ein Schritt) (Abbildung1A, 1B).
      1. Zeichnen Sie mit einem Bleistift einen 2-4 mm-Kreis um den Vorfußbereich beider Vorderfuß-Fußabdrücke (identifiziert durch die zugewiesene Farbe oben) in einem einzigen Schritt und zeichnen Sie eine Linie zwischen ihnen mithilfe eines Lineals.
      2. Zeichnen Sie den Abstand zwischen zwei Drucken aus der Mitte jedes Kreises (d. h. mitte jedes Fußpolsters) als Rechtsvor- oder Linksvor- 1 (LF1) auf.
      3. Wiederholen Sie dies für alle Schritte, die bewertet werden können (RF2, LF2, RF3, LF3 usw.).
      4. Wiederholen Sie dies für rechts- und linke Hinter-Limb-Fußabdrücke.
      5. Durchschnittlich alle einzelnen aufgezeichneten Schrittabstände für jede Gliedmaße. Für die statistische Analyse können einzelne Kohortenmitglieder zusammen gemittelt werden.
    2. Definieren Sie die Schrittbreite als Maß für den Abstand zwischen linken und rechten Vorderbeinen oder Hinterbeinen (Abbildung 1A, 1B).
      1. Um diesen Abstand zu bewerten, zeichnen und messen Sie eine Linie aus dem eingekreisten Vorfußbereich eines Hinterglieds, der sich senkrecht mit der Linie für Dieschrittlänge auf der kontralateralen Hintergliedung schneidet.
      2. Wiederholen Sie dies für alle Hinter-Limb-Drucke, die bewertet werden können, und durchschnittlich die Messungen. Die Berechnungsmethode für die Schrittbreite ist für Vor- und Hinterbeine gleich.
    3. Definieren Sie die Zehenstreuung als Abstand zwischen dem ersten und dem letzten Zehen auf einem einzigen Vor- oder Hinter-Limb-Fußabdruck (Abbildung 1A, 1B).
      1. Verwenden Sie Bremssättel, um den Abstand zwischen der Spitze des ersten Zehendrucks und der Spitze des letzten Zehendrucks zu messen.
      2. Wiederholen Sie dies für alle Hinter-Limb-Drucke, die bewertet werden können, und durchschnittlich die Maße. Die Berechnungsmethode für die Zehenstreuung ist für Vor- und Hinterbeine gleich.
  3. Wenn das Papier nicht gepunktet werden kann, lassen Sie das Tier 10 Minuten ruhen, bevor Sie es erneut versuchen.

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Ergebnisse

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Bei ausreichender Anzahl von Tieren ist dieses Verfahren in der Lage, Gangunterschiede zwischen Mausgenotypen innerhalb derselben Belastung im Laufe der Zeit zu erkennen. Abbildung 1B zeigt repräsentative Spuren von Footprint-Bildern, die in unserem Labor gesammelt wurden, mit einem Mausmodell der X-verknüpften Spinal- und Bulbar-Muskelatrophie (SBMA), einer neurodegenerativen Erkrankung, die untere motorische Neuronen und Skelettmuskeln betrifft. Wir haben bereits berichtet, dass männliche ...

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Diskussion

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Mit der oben beschriebenen Low-Cost-Ganganalysemethode zeigen wir eine erfolgreiche Identifizierung mehrerer Parameter der Gangfunktionsstörung im postsymptomatischen Alter im BAC fxAR121 Mausmodell von SBMA. Die Verringerung der Schrittlänge stimmt mit früheren SBMA-Studien von Mausmodellen und menschlichen Patienten überein9. Wir zeigen auch zum ersten Mal, dass es signifikante Unterschiede in der Zehenausbreitung hinter den Gliedmaßen bei symptomatischen SBMA-Mäusen im Vergleich zu nicht-transg...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Die Autoren danken A.M. für die Unterstützung bei der Tieridentifikation. Diese Arbeit wurde durch Stipendien der US National Institutes of Health (R01 7 RF1 AG057264 an A.R.L.S. und C.J.C. und R01 NS100023 an A.R.L.S. und die Muscular Dystrophy Association (Basic Research Grant to A.R.L.S., Development Grant to C.J.C.) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Messschiebern/an/amuss Markierungen bis zu 0,1 mm haben
Craft GlueE6000n/a
Footprint Paint (Tempera Paint)Artmindn/amust be non-toxic
Round Barrel PaintbrushesSymply Simmonsn/a0,5 cm Durchmesser
Linealn/an/amuss Markierungen bis zu Millimetern haben
Ritzpapier (Aquarellblöcke)Cansonn/aZuschnitt
Tunnel und Tor ChamberInterstate Plasticsn/aZuschnitt

Referenzen

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