Aufgrund der spektralen Überlappung der Anregungs- und Emissionswellenlängen von NADH- und Fura-2-Analogen ist die Signalinterferenz beider Chemikalien in lebenden Zellen bei der quantitativen Messung von [Ca2+ ]unvermeidbar. So wurde eine neuartige Online-Korrekturmethode der NADH-Signalinterferenz zur Messung [Ca2+] entwickelt.
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Methodenartikel
Eine neuartige Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Korrekturmethode zur intrazellulären Ca2+-Messung mit Fura-2-Analog in lebenden Zellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Zur quantitativ [Ca2+] werden häufig Fura-2-Analoga verwendet, die ratiometrische Fluorosonden sind. Allerdings ist die Verwendung von Farbstoffen in lebenden Zellen aufgrund von Autofluoreszenzstörungen, hauptsächlich durch Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH), an sich beschränkt. Genauer gesagt ist dies ein großes Hindernis bei der Messung der mitochondrialen [Ca2+] quantitativ mit Fura-2 Analoga, da die Mehrheit der NADH in den Mitochondrien ist. Wenn die Fluoreszenzfarbstoffkonzentration gleich ist, sollte eine bestimmte Anregungsintensität die gleiche Emissionsintensität erzeugen. Daher sollte das Emissionsintensitätsverhältnis von zwei verschiedenen Anregungswellenlängen konstant sein. Basierend auf diesem Prinzip wurde eine neuartige Online-Korrekturmethode der NADH-Signalinterferenz zur Messung [Ca2+] entwickelt, und die tatsächliche Signalintensität von NADH und Fura-2 kann erreicht werden. Darüber hinaus wurde eine neuartige Gleichung zur Berechnung [Ca2+] mit isosbestischer Anregung oder Anregung bei 400 nm entwickelt. Mit dieser Methode konnten Veränderungen in mitochondrialen [Ca2+] erfolgreich gemessen werden. Darüber hinaus konnten bei einem anderen Satz der Anregungs- und Emissionswellenlängen mehrere Parameter, einschließlich NADH, [Ca2+], und pH- oder mitochondriales Membranpotential(m) gleichzeitig gemessen werden. Mitochondrial [Ca2+] undm oder pH wurden mit Fura-2-FF und Tetramethylrhodinethylester (TMRE) oder Carboxy-Seminaphtorhodafluor-1 (carboxy-SNARF-1) gemessen.
Einleitung
Die bedeutende Rolle der intrazellulären Ca2+ ist weithin bekannt1. Die Quantifizierung von [Ca2+] ist wesentlich, um die Prozesse der zellulären physiologischen Funktionen zu verstehen. Fura-2-Analoga sind sehr nützlich, da sie im UV-Bereich (<400 nm) angeregt werden und die ratiometrische Methode für die quantitative Messung angewendet werden kann. Daher können andere physiologische Parameter wie pH,H,H., Membranpotenzial usw. mit anderen Fluoreszenzfarbstoffen gemessen werden. Die mitochondriale Ca2+-Konzentration ([Ca2+]m) lag den Angaben zufolge bei 0,08 x 20 ,2,3,4,5. Unter fura-2 Analoga eignet sich fura-2-FF zur Messung dieses Bereichs von [Ca2+]. Allerdings enthalten die lebenden Zellen leider NADH/NADPH für ihre Stoffwechselprozesse, und NADH erzeugt Signalstörungen aufgrund der überlappenden Anregungs- und Emissionsspektren mit dem fura-2 Analog. Diese Interferenz schränkt die Verwendung von fura-2 Analogen stark ein. Insbesondere, wenn das Analoge angewendet wird, um mitochondrial [Ca2+] zu messen, ist diese Interferenz das größte Hindernis, da die höchste Menge an NADH in den Mitochondrien liegt. Erschwert wird dies noch durch NADH-Änderungen im Zusammenhang mit dem mitochondrialen Membranpotential(m) und die Veränderung vonm wirkt sich auf [Ca2+]m6,7,8 , 9. Darüber hinaus ist es für das Studium der Dynamik [Ca2+]m wichtig, den Status anderer mitochondrialer Parameter, wie NADH,mund pH, zu kennen.
Die Emissionen bei 450 nm und 500 nm mit Anregungen bei 353 nm, 361 nm und 400 nm enthalten die Signale von NADH und fura-2-FF, und die Gleichungen sind wie folgt. Hierin sind 353 nm bzw. 361 nm die isosbestischen Punkte von fura-2-FF für Emissionen bei 450 nm bzw. 500 nm.
F361.450 = F361.450,NADH + F361.450,Fura Gleichung 1
F353.500 = F353.500,NADH + F353.500,Fura Gleichung 2
F400.500 = F400.500,NADH + F400.500,Fura Gleichung 3
wobei Fx,y die gemessene Emissionsintensität bei y-nm durch x-nm Anregung, Fx,y,NADH die reine NADH-abhängige Emissionsintensität und Fx,y,Fura die reine fura-2-FF-abhängige Emissionsintensität darstellt. Bei gleicher Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs sollte eine bestimmte Anregungsintensität die gleiche Emissionsintensität erzeugen. Daher sollte das Emissionsintensitätsverhältnis von zwei verschiedenen Anregungswellenlängen konstant sein. Ca2+ und Fura-2 hatten keinen Einfluss auf die Fluoreszenzeigenschaften von NADH; Daher war das Verhältnis der Emission bei 450 nm und bei 500 nm NADH bei jeder Anregungswellenlänge konstant. Die gleiche Regel kann für fura-2-FF verwendet werden, basierend auf der Annahme, dass NADH oder [Ca2+] die Emissions- und Anregungsspektren von fura-2-FF nicht beeinflusst. Ca2+ verursachte jedoch eine spektrale Verschiebung der Fura-2-FF-Emission. Daher muss verwendet werden, um die Wirkung von Ca2+zu entfernen, isosbestische Anregung, die unabhängig von Ca2+ist. Jede Emissionswellenlänge (d.h. 450 nm und 500 nm) hat einen anderen isosbestischen Punkt, und aus unserem Versuchsaufbau wurden 353 nm bei 500 nm und 361 nm bei 450 nm gewählt. Daraus sind die folgenden Gleichungengültig 10.
Rf = F361.450,Fura/F353.500,Fura Gleichung 4
RN1 = F400.500,NADH/F361,450,NADH Gleichung 5
RN2 = F353.500,NADH/F361,450,NADH Gleichung 6
Bei diesen Konstanten sind die folgenden Gleichungen aus (Gleichung 1) (Gleichung 2) und (Gleichung 3) gültig.
F361.450 = F361.450,NADH + Rf n F353.500,Fura Gleichung 7
F353.450 = RN2 x F361.450,NADH + F353.500,Fura Gleichung 8
F400.500 = RN1 x F361.450,NADH + F400.500,Fura Gleichung 9
Aus diesen Gleichungen können, wenn Rf, RN1und RN2 bekannt sind, reine Signale von NADH und Fura-2 wie folgt erhalten werden.
F361.450,NADH = (F361.450 - Ff - F353.500)/(1 x Rf - RN2) Gleichung 10
F353.500,Fura = (RN2 x F361.450 - F353.500)/(Rf - RN2 - 1) Gleichung 11
F400.500,Fura = F400.500 - RN1 - F361.450,NADH Gleichung 12
RFura = F353.500,Fura/F400,500,Fura Gleichung 13
Die Ca2+-gebundene Form von fura-2-FF war bei der 400 nm Erregungswellenlänge praktisch nicht fluoreszierend. Basierend auf dieser Eigenschaft kann die folgende neue Kalibrierungsgleichung abgeleitet werden.
[Ca2+] = Kd (F 400.500,max/F353,500,max)
wobei Kd eine Dissoziationskonstante ist, Sind F400.500,max und F353.500,max sind die Maximalwerte der emittierten Signale bei 500 nm mit Anregungen bei 400 nm bzw. 353nm, und R min ist die minimale RFura in Ca2 +-freier Zustand. Da die isosbestischen Anregungen verwendet wurden, kann die Gleichung wie folgt weiter vereinfacht werden.
[Ca2+] = Kd (1 / Rmin) ( RFura - Rmin) Gleichung 15
Daher sind nur Kd- undR-min-Werte erforderlich, um [Ca2+] zu berechnen.
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Protokoll
Alle Versuchsprotokolle wurden vom lokalen institutionellen Tierpflege- und Nutzungsausschuss genehmigt.
1. Lösungsvorbereitung
- Bereiten Sie einzelne frisch isolierte Herzmyozyten11vor.
HINWEIS: Jedes Labor verfügt möglicherweise über eine andere Zellspeicherlösung. Hier werden die Myozyten im Kulturmedium (DMEM) gespeichert. - Bereiten Sie 100 ml Ca2+-freie Lösung vor (Tabelle 1).
- Bereiten Sie 50 ml Kulturmedium in einem 50 ml Becher vor. Aliquot 5 ml und legen Sie es in ein Wasserbad bei 37 °C. Halten Sie die restliche Lösung bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie 50 ml der Saponin-Lösung vor, indem Sie 5 mg Saponin zu 50 ml Ca2+-freier Lösung hinzufügen.
HINWEIS: Saponin wird verwendet, um Herzmyozyten zu durchdringen, zytosolische Kompartimente zu entfernen und nur die mitochondriale Fluoreszenz zu visualisieren. - Bereiten Sie 16 l von 1 mM fura-2-FF-AM in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst vor.
HINWEIS: Machen Sie 1 mM Stofflösung von fura-2-FF-AM in DMSO gelöst und aliquot 16 l in einem 2 ml Rohr. Lagern Sie sie bei -20 °C bis zur Verwendung. - Bereiten Sie 50 ml NADH-freie Ca2+-freie Lösung (Tabelle 1) und 50 ml NADH-freie Ca2+-gesättigte Lösung vor (Tabelle 1), wenn isosbestische Punkte gemessen werden sollen. Stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 7,0 ein.
HINWEIS: Die NADH-freie Ca2+-freie Lösung (Tabelle 1) enthält 10 M FCCP und 100 M ADP ohne mitochondriale Substrate zur Minimierung von NADH in Mitochondrien. - Bereiten Sie 50 ml Ca2+-freie Lösung, 50 ml Malatlösung, 50 ml Pyruvatlösung, 50 ml Malate-Pyruvat-Lösung und 50 ml Roton-Lösung für NADH-Korrekturfaktormessungen vor (Tabelle 1).
2. Fluoroprobe-Ladeverfahren in die Mitochondrien
- Bereiten Sie die Färbelösung vor, indem Sie 2 ml des Kulturmediums auf 16 l von 1 mM fura-2-FF-AM hinzufügen.
HINWEIS: Fluoreszierender Farbstoff ist unter dem Licht zerbrechlich. Bereiten Sie die Lösung kurz vor der Verwendung vor. Bewahren Sie die Lösung, die den Fluoreszenzfarbstoff enthält, an einem dunklen Ort auf. Die Endkonzentration von fura-2-FF-AM beträgt 8 m. Wenn carboxy-SNARF-1 verwendet wurde, bereiten Sie die Farbstoff-Ladelösung mit 2 'M Carboxy-SNARF-1-AM vor. - Nehmen Sie 2 ml der isolierten Zellen und legen Sie in einem 5 ml Reagenzglas in eine aufrechte Position.
- Warten Sie 15 min, bis Myozyten auf den Boden sinken und den Überstand entfernen.
HINWEIS: Der Überstand kann Zellablagerungen enthalten. Zentrifugieren Sie das Rohr nicht, um Zellschäden zu vermeiden. - Fügen Sie 2 ml der Farbstoff-Ladelösung hinzu.
- Inkubieren Sie die Farbstoff-Ladelösung mit Zellen für 60 min bei 4 °C.
- Dann das Reagenzglas in ein 37 °C Wasserbad für 30 min in aufrechter Position geben.
- Entfernen Sie den Überstand, und fügen Sie 4 ml des vorgewärmten Kulturmediums von 37 °C hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für 60 min in einem 37 °C Wasserbad.
- Schließlich entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 4 ml Kulturmedium bei Raumtemperatur hinzu und halten Sie das Rohr bei Raumtemperatur.
3. Einführung des multiparametrischen Messsystems
ANMERKUNG: Abbildung 1 zeigt ein Diagramm des gesamten Systems.
- Verwenden Sie für eine Anregungslichtquelle einen schnellen Monochromator (Polychrom II), der das Licht innerhalb von 3 ms verändern kann.
- Verwenden Sie eine Öl-Tauchlinse (40x, NA 1.3) mit einem invertierten Mikroskop, um die Signalintensität zu erhöhen.
- Verwenden Sie einen Nahinfrarotfilter und eine aufgeladene Gerätekamera (CCD), um das Objektfeld ohne fluoreszierende Signalstörungen zu überwachen.
- Erfassen Sie das Objektfeldbild, um den Bereich abzubekommen.
- Passen Sie das Objektfeld im Bildschirm mit einer Feldmembran an, nur um die Zelle zum Reduzieren des Hintergrunds anzuzeigen.
- Verwenden Sie vier Photomultiplierröhren mit jedem Bandpassfilter (450, 500, 590 und 640 nm), um Emissionswellenlängen mit Photonenzählmethode zu erkennen. Verwenden Sie die entsprechenden dichroitischen Spiegel, um das Emissionslicht zu teilen und umzuleiten.
HINWEIS: Das Anregungslicht ist im Vergleich zum Emissionslicht sehr stark. Wählen Sie daher den Bandpassfilter mit den höchsten Blockiereigenschaften aus, um den Hintergrund zu reduzieren. Ein Photonenzählsystem besteht aus einer Kombination aus PMTs, Photonenzählereinheiten und einem Hochgeschwindigkeitszähler. Zur Steuerung des Systems und zum Testen der Daten wurde eine maßgeschneiderte Fahrsoftware verwendet. Es ist notwendig, einen Weg zu finden, diese Methode mit anderen Systemen anzuwenden.
4. NADH-Korrekturmethoden mit einem multiparametrischen Messsystem
- Identifizierung der isosbestischen Punkte von Fura-2-FF vor Ort.
HINWEIS: In vielen Berichten wurde festgestellt, dass fluoreszierende Eigenschaften in Zellen verändert werden. Führen Sie daher alle Verfahren aus, um die Parameter zu erhalten, um die Interferenz vor Ort zu korrigieren.- Montieren Sie die mit Farbstoffen beladene Zelle am Mikroskop und warten Sie 3 min, um die Zellen auf den Boden zu senken.
HINWEIS: Passen Sie die Zellenzahlen an, um eine Zelle pro Zielfeld mit 40-facher Objektivlinse zu sehen. - Durchschnaufen Sie die NADH-freie Ca2+-freie Lösung bei 37 °C.
- Messen Sie nach dem Targeting der Zelle den zellfreien Hintergrund und den Zellbereich, wie in Abschnitt 4.1 dargestellt. Berechnen Sie den Zellhintergrund aus dem Zellbereich.
HINWEIS: Beide Hintergrundsignale müssen in jedem Experiment korrigiert werden. - Durchschnaufen Sie die Saponin-Lösung für 60 s und kehren Sie zur NADH-freien Ca2+-freien Lösung zurück.
- Messen Sie Fura-2-FF-emittierte Signale bei 450 nm und 500 nm gleichzeitig durch den Anregungsscan von 350 nm bis 365 nm mit dem 0,1 nm-Schritt.
- Durchschnaufen Sie die NADH-freie Ca2+-gesättigte Lösung und wiederholen Sie Schritt 4.2.5.
- Subtrahieren Sie die Signale in der Ca2+-gesättigten Lösung von den Signalen in den Ca2+-freien Bedingungen.
- Wiederholen Sie die Verfahren von 4.2.2 bis 4.2.7 mit anderen einzelnen Herzmyozyten.
HINWEIS: Wenn die Signalintensität schwächer wird, wiederholen Sie dies von 4.2.1. Wiederholen Sie den Vorgang für mindestens 5 verschiedene Zellen. - Berechnen Sie aus allen erhaltenen Signalen die Standardabweichungen der Emission bei jeder Anregung und wählen Sie die Anregungswellenlänge aus, die den Minimalstandardabweichungswert (SD) als isosbestischen Punkt anzeigt.
ANMERKUNG: Die repräsentativen Zahlen sind in Abbildung 2dargestellt.
- Montieren Sie die mit Farbstoffen beladene Zelle am Mikroskop und warten Sie 3 min, um die Zellen auf den Boden zu senken.
- Die Hintergrundsignalerkennung und die Korrekturmethoden mit dem Zellbereich
HINWEIS: Es gibt zwei Arten von Hintergründen. Das eine kommt aus den Zellen und der andere aus der Reflexion auf dem Deckschein (dem zellfreien Hintergrund). Beide Hintergründe müssen in jedem Experiment korrigiert werden.- Montieren Sie die farbstofffreien Zellen im Bad am Mikroskop und warten Sie 3 min, um die Zellen auf den Boden zu senken. Perfuse NADH-freie Ca2+-freie Lösung für ca. 5 Min.
HINWEIS: Die gesamte Lösungsperfusionsrate beträgt 2-3 ml/min bei 37 °C.
HINWEIS: Passen Sie die Zellenzahlen an, um eine Zelle pro Zielfeld mit 40-facher Objektivlinse zu sehen. - Legen Sie das Objektfeld so fest, dass es die Zielzelle abdeckt.
- Nachdem Sie die Zelle aus dem Feld herausbewegt haben, messen Sie die Hintergrundsignale des zellfreien Fensters und legen Sie sie als Offsets fest.
HINWEIS: Das Signal bedeutet das Lichtsignal, das im Photonenzählsystem erkannt werden soll. - Setzen Sie die Zelle an die Ausgangsposition zurück und messen Sie die Zellhintergrundsignale und den Zellbereich.
HINWEIS: Obwohl das Anregungslicht mit dem Bandpassfilter gefiltert wird, enthält es immer noch eine recht große Menge des gefilterten Lichts. Dieses Licht wird beim Einschlagen der Zellen dispergiert und verursacht ein erhebliches Hintergrundsignal, da das Photonenzählsystem hochempfindlich ist. Sie muss korrigiert werden.
HINWEIS: Der Zellbereich kann mit einem erfassten Zellbild und einer verfügbaren Bildgebungssoftware berechnet werden. Die Einheit des Zellenbereichs kann eine beliebige Einheit einschließlich Pixelanzahl sein. Nur Eine Standardisierung ist notwendig. - Wiederholen Sie dies von 4.1.1 bis 4.1.4 für das 10-fache, um die Beziehung zwischen dem Zellbereich und den Zellhintergrundsignalen zu erhalten.
HINWEIS: Später können die Zellhintergrundsignale aus dem Zellbereich aus der Beziehung berechnet werden. Da die Anregungslampe altern wird, muss dieses Verfahren mindestens jeden Monat wiederholt werden.
- Montieren Sie die farbstofffreien Zellen im Bad am Mikroskop und warten Sie 3 min, um die Zellen auf den Boden zu senken. Perfuse NADH-freie Ca2+-freie Lösung für ca. 5 Min.
- Messung von R-Faktoren
- Berechnen Sie Rf mit der Gleichung 4 aus den in Abschnitt 4.2 erhaltenen Signalen.
- Montieren Sie die farbstofffreien Zellen am Mikroskop und durchdringen Sie die Ca2+-freie Lösung.
- Messen Sie die Signale wie F361, 450, NADH, F400, 500, NADH, F361, 450, NADHund F353, 500, NADH.
- Durchdringen Sie die Malatlösung und wiederholen Sie 4.3.3. und messen die Signale.
- Durchdiesam die Pyruvatlösung und wiederholen Sie 4.3.3. und messen die Signale.
- Durchdringen Sie die Malat-Pyruvat-Lösung und wiederholen Sie 4.3.3. und messen die Signale.
- Durchdiesam die Rotone-Lösung und wiederholen Sie 4.3.3. und messen die Signale.
ANMERKUNG: Das Beispiel des NADH-Signals, das auf 5 mM Pyruvat, 5 mM Malat plus 5 mM Pyruvat und 10 M Roton-Zugabe aufgezeichnet wurde, ist in Abbildung 3dargestellt. - Berechnen Sie jede Steigung von F361, 450, NADH vs. F400, 500, NADH und F361, 450, NADH vs. F353, 500, NADH. Wie in Abbildung 3dargestellt . Jede Steigung zeigt RN1 und RN2an.
5. Auswahl der Anregung und des Emissionslichts für TMRE oder carboxy-SNARF-1
- Wenn TMRE zur Messung des mitochondrialen Potentials zusätzlich verwendet wurde, verwenden Sie die 530 nm Anregungswellenlänge und die 590 nm Emissionswellenlänge.
- Wenn carboxy-SNARF-1 zur Messung des mitochondrialen Potentials zusätzlich verwendet wurde, verwenden Sie die Anregungswellenlänge von 540 nm und Emissionswellenlängen von 590 nm und 640 nm12.
6. Auswahl des K d-Wertes von fura-2-FF
- Die Änderung des pH-Wertes kann sich auf Kd-Werte für Ca2+ Bindung auf fura-2-FF10auswirken. Verwenden Sie den Kd-Wert von 5,28 bei pH 7,5 für die Mitochondrien.
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Ergebnisse
Mitochondriale Ca2+ Änderungen aufgrund von Korrektur10
Abbildung 4 zeigt die Änderungen in [Ca2+]m vor und nach der Korrektur. Die Ergebnisse zeigten deutlich die wesentlichen Veränderungen in [Ca2+]m. Die mitochondriale ruhende Calciumkonzentration ohne zytosolische Ca2+ ([Ca2+]c) betrug 1,03 x 0,13 m (Mittelwert s.E., n = 32), und die maximale [Ca2+]m bei 1-M [Ca
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Diskussion
Die Interferenzkorrekturmethode wurde erfolgreich zur Messung der Signale von NADH- und Fura-2-Analogen entwickelt. Eine genaue Messung der Signale ist für die exakte Korrektur unerlässlich. Die inhärente Natur der Fluoreszenzvorrichtung erzeugt jedoch ein Hintergrundsignal, das nichts mit dem von NADH von fura-2 zu tun hat. Der bandpass-Filter höchster Qualität kann nur bis zu 10x 8 der unerwünschten Wellenlängen des Lichts passieren. Das fluoreszierende Signal einer einzelnen Zelle ist jedoch sehr klein, und...
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde teilweise durch das Basic Science Research Program durch die National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, die vom Bildungsministerium (2018R1A6A01011832) vom Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunftsplanung (NRF-2016M3C1A6936606) gefördert wurde. und vom Ministerium für Handel, Industrie und Energie (10068076).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 2 mL Eppendorf Tube | Axygen | MCT-200-C | 2 mL Tube |
| AD/DA Converter | Instrutech | ITC-18 | Equipment |
| ADP, Adenosin 5′-diphosphat monopotassium salt dihydrat | Sigma-aldrich | A5285 | Chemicals |
| Bandpassfilter | Ealing Electro-Optics, Inc | 35-3920 | Ausrüstung, 640± 11nm |
| Bandpassfilter | Omega Optical | 690-9823 | Ausrüstung, 590± 15nm |
| Bandpassfilter | Omega Optical | 500DF20-9916 | Ausrüstung, 500± 20nm |
| Bandpassfilter | Chroma Technology Corp. | 60685 | Ausrüstung, 450± 30nm |
| Calciumchlorid-Lösung | Sigma-aldrich | 21114 | Chemikalien |
| carboxy-SNARF-1(AM) | Invitrogen | C1272 | Chemikalien |
| Charge-coupled Device (CCD) Kamera | Philips | FTM1800NH/HGI | Equipment |
| dichroitischer Spiegel | Chroma Technology Corp. | 86009 | Ausrüstung, dichroitischer Mehrbandspiegel, Reflexion : < 400nm, 490± 10, 560± 10, Getriebe: 460± 15, 510± 20, >580 nm |
| dichroitischer Spiegel | Chroma Technology Corp. | 567DCXRU | Ausrüstung, Reflexion : < 560nm, Transmission : > 580 nm |
| dichroitischer Spiegel | Chroma Technology Corp. | 480dclp | Ausrüstung, Reflexion : < 470nm, Transmission : > 490 nm |
| dichroitischer Spiegel | Chroma Technology Corp. | 20728 | Ausrüstung, dichroitischer Mehrbandspiegel, Reflexion : < 405nm, 470± 30, Transmission: 430 nm ~ 520 nm, > 640 nm |
| Dimethylsulfoxid (DMSO)< / stark> | Sigma-aldrich | 154938 | Chemikalien |
| DMEM, Dulbecco' s Modifizierter Adler" s mittel | Sigma-aldrich | D5030 | Chemikalien |
| EGTA, Egtasinsäure, Ethylen-bis(oxyethylenitrilo)tetraessigsäure, Glykoletherdiamintetraessigsäure | Sigma-aldrich | E4378 | Chemikalien |
| FCCP, Mesoxalinutil 4-trifluormethoxyphenylhydrazon | Sigma-aldrich | 21857 | Chemikalien |
| field diaphragma | Nikon | 86506 | Ausrüstung |
| Fura-2-FF(AM) | TEFLABS | 137 | Chemikalien |
| Green tube | DWM | Reagenzglas | |
| HEPES, 4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-ethansulfonsäure, N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N′-(2-Ethansulfonsäure)) | Sigma-aldrich | H3375 | Chemicals |
| High-Speed counter | National Instruments | NI-6022 | Equipment |
| Hot mirror | Chroma Technology Corp. | 21002 | Ausrüstung, 50:50 |
| Inverses Mikroskop | Nikon | TE-300 | Ausrüstung |
| Malat | Sigma-aldrich | 27606 | Chemikalien |
| Nahinfrarotfilter | Chroma Technology Corp. | D750/100X | Ausrüstung, 750± 100nm |
| Oil Immersionsobjektiv | Nikon | MRF01400 | 40x, NA 1.3; Ausrüstung |
| Photonenzählereinheit | Hamamatsu | C3866 | Ausrüstung |
| Photonenvervielfachungsröhre | Hamamatsu | R2949 | Ausrüstung |
| Polychrome II | Till Photonics | SA3/MG04 | Ausrüstung |
| Kaliumchlorid | Merck | 1.04936 | Chemikalien |
| Kaliumhydroxidlösung | Sigma-aldrich | P4494 | Chemikalien |
| Pyruvate | Sigma-aldrich | 107360 | Chemikalien |
| Rotenone | Sigma-aldrich | R8875 | Chemikalien |
| Saponin | Sigma-aldrich | S4521 | Chemikalien |
| TMRE, Tetramethylrhodamin, Ethylester | Molekulare Sonden | T669 | Chemikalien |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
