Method Article

Wechselwirkungen mit und Membranpermeabilisierung des Gehirns Mitochondrien durch Amyloid Fibrils

DOI:

10.3791/59883

⸱

September 28th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), Zanjan, 45137-66731, Iran

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier ist ein Protokoll zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen nativer Form, Präfibrillar und reifen Amyloidfibrillen verschiedener Peptide und Proteine mit Mitochondrien aus verschiedenen Geweben und verschiedenen Bereichen des Gehirns isoliert.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine wachsende Zahl von Beweisen zeigt, dass Membranpermeabilisierung, einschließlich der inneren Membranen wie Mitochondrien, ist ein gemeinsames Merkmal und primärer Mechanismus der Amyloid-Aggregat-induzierte Toxizität bei neurodegenerativen Erkrankungen. Die meisten Berichte, die die Mechanismen der Membranstörung beschreiben, basieren jedoch auf Phospholipid-Modellsystemen, und Studien, die direkt auf Ereignisse abzielen, die auf der Ebene biologischer Membranen auftreten, sind selten. Beschrieben hier ist ein Modell für die Untersuchung der Mechanismen der Amyloid-Toxizität auf Membranebene. Für die mitochondriale Isolierung wird ein Dichtegradientenmedium verwendet, um Präparate mit minimaler Myelinkontamination zu erhalten. Nach der Bestätigung der mitochondrialen Membranintegrität wird die Wechselwirkung von Amyloidfibrillen, die aus dem In-vitro-Biologischen Modell von Synuclein, Rinderinsulin und Hühnereiweißlysozym (HEWL) mit Rattenhirn-Mitochondrien als in vitro biologisches Modell entstehen, untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung von Hirnmitochondrien mit fibrillaren Baugruppen unterschiedliche Grade der Membranpermeabilisation und ROS-Gehaltsverbesserung verursachen kann. Dies deutet auf strukturabhängige Wechselwirkungen zwischen Amyloidfibrillen und mitochondrialer Membran hin. Es wird vermutet, dass biophysikalische Eigenschaften von Amyloidfibrillen und deren spezifische Bindung an mitochondriale Membranen Erklärungen für einige dieser Beobachtungen liefern können.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amyloid-bedingte Störungen, bekannt als Amyloidosen, stellen eine große Gruppe von Krankheiten dar, die durch das Auftreten unlöslicher Proteinablagerungen in verschiedenen Geweben und Organen definiert sind1,2. Unter ihnen sind neurodegenerative Erkrankungen die häufigsten Formen, in denen Proteinaggregate im zentralen oder peripheren Nervensystem auftreten2. Obwohl eine Reihe von Mechanismen vorgeschlagen wurden, um in die Toxizität von Amyloid-Aggregaten beteiligt werden3, eine wachsende Menge von Beweisen deutet auf Zellmembran-Störung und Permeabilisierung als primärer Mechanismus der Amyloidpathologie4, 5. Neben der Plasmamembran können auch innere Organellen (d.h. Mitochondrien) betroffen sein.

Interessanterweise deuten neue Erkenntnisse darauf hin, dass mitochondriale Dysfunktion eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen spielt, einschließlich Alzheimer und ParkinsonErkrankungen 6,7. In Übereinstimmung mit dieser Ausgabe haben zahlreiche Berichte auf eine Bindung und Akkumulation von Amyloid-Peptid, -synuclein, Huntingtin und ALS-verknüpften mutierten SOD1-Proteinen an Mitochondrien8,9,10 11. Der Mechanismus der Membranpermeabilisierung durch Amyloidaggregate wird entweder durch Bildung diskreter Kanäle (Poren) und/oder durch einen unspezifischen Waschmittel-ähnlichen Mechanismus5,12, 13. Bemerkenswert ist, dass die meisten dieser Schlussfolgerungen auf Berichten mit Phospholipid-Modellsystemen basieren, und Studien, die direkt auf die Ereignisse in biologischen Membranen abzielen, sind selten. Es ist klar, dass diese künstlichen Lipid-Doppelschichten nicht unbedingt die intrinsischen Eigenschaften biologischer Membranen widerspiegeln, einschließlich der mitochondrien, die heterogene Strukturen sind und aus einer Vielzahl von Phospholipiden und Proteinen bestehen.

In der vorliegenden Studie werden Von Rattenhirnen isolierte Mitochondrien als in vitro biologisches Modell verwendet, um die zerstörerischen Wirkungen von Amyloidfibrillen zu untersuchen, die aus dem signifikante strukturelle Homologie mit humanem Insulin, das an einer injektionslokalisierten Amyloidose beteiligt ist), und Hühnereiweißlysozym (HEWL; als gemeinsames Modellprotein zur Untersuchung der Amyloid-Aggregation). Die Wechselwirkungen und möglichen Schäden von mitochondrialen Membranen, die durch Amyloidfibrillen induziert werden, werden dann untersucht, indem die Freisetzung von mitochondrialer Malatdehydrogenase (MDH) (in der mitochondrialen Matrix) und mitochondrienem reaktiven Sauerstoff beobachtet wird. Arten (ROS) Verbesserung.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Medizinischen Wissenschaften der Universität Teheran durchgeführt. Es wurden maximale Anstrengungen unternommen, um Leiden und schädliche Auswirkungen auf die Ratten zu minimieren, indem die Guillotineklingen geschärft und entschlossene und schnelle Bewegungen der Klinge angewendet wurden.

1. Hirnhomogenisierung und mitochondriale Isolation

HINWEIS: Alle Reagenzien für die mitochondriale Isolierung wurden nach Sims und Anderson14hergestellt.

  1. Vorbereitung von Puffern für die mitochondriale Isolierung
    1. Bereiten Sie eine 100 mM Tris-HCl-Lösung vor: wiegen Sie 0,605 g Tris-HCl und lösen Sie sie in ca. 40 ml entionisiertem Wasser (DW) in einem Becher auf. Übertragen Sie die Lösung auf einen 50 ml Volumetkolben und erhöhen Sie das Endvolumen durch Hinzufügen von DW auf 50 ml.
    2. Bereiten Sie eine 10 mM EDTA-Lösung vor: wiegen Sie 0,202 g EDTA und lösen Sie sie in ca. 40 ml DW in einem Becher auf. Übertragen Sie die Lösung auf einen 50 ml Volumetkolben und erhöhen Sie das Endvolumen durch Hinzufügen von DW auf 50 ml.
      HINWEIS: Beide Lösungen können bei 4 °C für mindestens 4 Wochen gelagert werden.
    3. Bereiten Sie eine Tris-HCl/EDTA/Saccharose-Lagerlösung vor: 30 ml 100 ml Tris-HCl und 30 ml 10 mM EDTA in einem Becher hinzufügen. 32,86 g Saccharose wiegen und unter Rühren mit einem Magnetrührer in das Becherglas geben. Wenn die Saccharose gelöst ist, übertragen Sie die Lösung auf einen 100 ml Volumet-Kolben und erhöhen Sie das Endvolumen auf 100 ml durch Hinzufügen von DW.
      HINWEIS: Diese Lösung kann bei 4 °C für bis zu 3 Tage gelagert werden.
    4. Einen Isolationspuffer (IB) vorbereiten: 100 ml Tris-HCl/EDTA/Saccharosebestand zu ca. 150 ml DW hinzufügen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein, indem Sie 0,1 M HCl hinzufügen. Erhöhen Sie das Endvolumen durch Hinzufügen von DW auf 300 ml.
    5. Bereiten Sie 15% (v/v) DichteGradientenmedium mit IB vor, indem Sie 1,5 ml Dichtegradienten mittlerer bis 8,5 ml kalter IB hinzufügen.
    6. 10 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) Lösung vorbereiten: 20 mg fettsäurefreie BSA wiegen und in ca. 1,5 ml DW in einer 2 ml Durchstechflasche auflösen. Erhöhen Sie das Endvolumen auf 2 ml, indem Sie DW hinzufügen und bis zur Verwendung auf Eis speichern.
      HINWEIS: Bereiten Sie die Lösungen von den Schritten 1.1.4–1.1.6 am Tag der mitochondrialen Isolation frisch vor und lagern Sie sie bis zur Anwendung auf Eis.
  2. Isolation des Rattenhirns
    HINWEIS: Enthauptung und Hirnentfernung männlicher Ratten (150–200 g) wurden nach Sims und Anderson14durchgeführt.
    1. Legen Sie einen 30 ml Becher in einen Eiskübel und fügen Sie 10 ml kalte IB in das Becherglas.
    2. Enthaupten Sie die Ratte mit einer kleinen tierischen Guillotine und entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel innerhalb von 1 min der Enthauptung, um die Verschlechterung der mitochondrialen Eigenschaften zu begrenzen.
    3. Übertragen Sie das Gehirn schnell auf das Becherglas, das kalte IB enthält.
  3. Hirnhomogenisierung und Zubereitung von Mitochondrien
    HINWEIS: Mitochondriale Brüche wurden gemäß dem von Sims und Anderson14beschriebenen Protokoll isoliert, mit einigen Modifikationen, wie zuvor beschrieben15. Es ist wichtig, schnell zu arbeiten und alles während des gesamten Verfahrens auf Eis zu halten.
    1. Waschen Sie das Gewebe 2x mit 30 ml IB, übertragen Sie es in einen Becher, der kalte IB enthält, und zerkleinern Sie das Gehirn mit einer Schere.
    2. Fügen Sie 10 Bände vorgekühlten IB (ca. 10 ml IB pro Rattenhirn) hinzu.
    3. Übertragen Sie die Gewebesuspension auf einen 20 ml kalten Dounce Homogenisator.
    4. Homogenisieren Sie die Gewebestücke mit neun Auf- und Abschlägen mit einem motorisierten Stößel.
      HINWEIS: Lassen Sie die Mischung nach jedem Satz von drei Homogenisierungsschlägen ca. 30 s auf Eis, um sicherzustellen, dass das Homogenat kalt bleibt.
    5. Das Homogenat bei 1.300x g und 4 °C für 3 min in ein vorgekühltes 10 ml Zentrifugenrohr und zentrifugieren.
    6. Den Überstand vorsichtig dekantieren und 10 min auf ein vorgekühltes 10 ml Zentrifugenrohr und eine Zentrifuge bei 21.000x g bei 4 °C übertragen.
    7. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einer kalten 15%igen Gradienten-Mittellösung (5 ml für jedes Gehirn) wieder auf, indem Sie die Mischung vorsichtig mit einer Pipette rühren.
    8. Zentrifuge in einem Festwinkelrotor bei 30.700x g bei 4 °C für 5 min mit langsamer Beschleunigung (45 s von 0 U/min bis 500 U/min, gefolgt von normaler Beschleunigung) und Verzögerung (keine Bremsen). Dadurch sollten zwei unterschiedliche Materialbänder entstehen(Abbildung 1A, links).
    9. Entfernen Sie mit einer Pasteur-Pipette das scharfe Materialband, das sich oben im Farbverlauf angesammelt hat und das meist Myelin enthält. Entfernen Sie dann die Dichtegradienten-Mittellösung, die das Material (in Band 2) überlagert, so weit wie möglich, ohne eine der angereicherten mitochondrialen Brüche in Band 2 zu verlieren.
      HINWEIS: Das Band 2 enthält sowohl die synaptische als auch die nicht-synaptische Mitochondrien.
    10. Fügen Sie der mitochondrialen Fraktion 8 ml hinzu, während Sie die Mischung vorsichtig mit einer Pipette rühren.
    11. Zentrifuge bei 16.700x g bei 4 °C für 10 min und entfernen Sie vorsichtig den Überstand, so dass das untere lose Pellet ungestört bleibt.
    12. 1 ml 10 mg/ml fettsäurefreies BSA in das Zentrifugenrohr geben, während die Mischung vorsichtig mit der Spitze einer Pipette gerührt wird. Erhöhen Sie das Endvolumen auf 5 ml pro Gehirn, indem Sie IB hinzufügen.
    13. Zentrifuge bei 6.900x g bei 4 °C für 10 min, die ein festes Pellet produzieren sollte(Abbildung 1A, rechts).
    14. Den Überstand dekantieren und das mitochondriale Pellet in IB vorsichtig wieder aufsetzen, in 0,5 ml-Rohre auslagern und bis zur Verwendung in flüssigem Stickstoff lagern.

2. Proteinkonzentrationsbestimmung

HINWEIS: Die Proteinkonzentration wird mit der Methode von Lowry et al.16gemessen.

  1. Vorbereitung von Lösungen für Lowry Assay
    1. Lösung A vorbereiten: 0,4 g NaOH und 2 g Na2CO3 wiegen und in 80 ml DW auflösen, dann die Lösung in einen 100 ml Volumetkolben übertragen und das Volumen durch Zugabe von DW auf 100 ml erhöhen.
    2. Lösung B vorbereiten: 0,1 g Kaliumnatriumtartrat und 0,05 g CuSO4 wiegen und in 8 ml DW auflösen, dann die Lösung in einen 10 ml Volumetkolben übertragen und das Volumen durch Zugabe von DW auf 10 ml erhöhen.
      HINWEIS: Beide Lösungen A und B können bis zu 6 Monate stabil bei 4 °C bleiben.
    3. Lösung C vorbereiten: Fügen Sie 0,5 ml Folinlösung zu 7,5 ml DW hinzu.
      HINWEIS: Bereiten Sie Lösung C frisch vor und halten Sie sich bis zur Anwendung vom Licht fern.
    4. Bereiten Sie BSA-Standards mit Endkonzentrationen von 0, 20, 40, 60, 80, 100 und 120 g/ml vor, indem Sie 0, 20, 40, 60, 80, 100 und 120 l mit 1 mg/ml BSA kombinieren, mit genügend DW, um 1000 l Lösung zu machen.
  2. Proteinkonzentrationsmessung
    HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt für eine höhere Genauigkeit in dreifacher Ausführung aus.
    1. Fügen Sie jedem Bohrgut einer 96-Well-Platte 50 l Standardlösungen und mitochondriales Homogenat hinzu, gefolgt von der Zugabe von 45 l der Lösung A. Dann inkubieren Sie die Platte für 10 min in einem warmen Wasserbad bei 50 °C gesetzt.
    2. Fügen Sie die Platte bei Raumtemperatur (RT) für 10 min bei Dunkelheit (RT) 5 l der Lösung B hinzu und inkubieren Sie sie.
    3. Fügen Sie 150 l Der Lösung C hinzu und brüten Sie die Platte für 10 min in einem warmwasserbad bei 50 °C.
    4. Laden Sie die Platte in einen Plattenleser und erfassen Sie die Absorptionswerte für Normen und mitochondriale Aufhängung bei 650 nm. Berechnen Sie dann mithilfe einer Kalibrierkurve den Proteingehalt der Mitochondrien.

3. Mitochondriale Membranintegritätsbestimmung

HINWEIS: Die mitochondriale Membranintegrität wird durch Messung der Aktivität der Malatdehydrogenase (MDH) in isolierten Mitochondrien vor und nach einer Membranstörung durch Triton X-100 bestätigt.

  1. Mitochondriales Homogenat mit kaltem IB auf 1 mg/ml verdünnen und in zwei 1,5 ml-Röhren (typischerweise 195 l Mitochondrien pro Tube) geben.
  2. Fügen Sie Triton X-100 (mit DW verdünnt) 5 l von 20 % (v/v) zu einem Röhrchen (als Positivkontrolle für maximale Enzymaktivität) und 5 l DW zu einem anderen Rohr (zur Kontrolle) hinzu, gefolgt vom Mischen mit einem Rührer.
  3. Inkubieren Sie die Rohre für 10 min in einem warmen Wasserbad bei 30 °C.
  4. Pelletmitochondrien durch Zentrifugieren von Rohren in einem Festwinkelrotor bei 16.000 x g und 4 °C für 15 min.
  5. Sammeln Sie sorgfältig die resultierenden Überstandmittel, um die Aktivität von mitochondrialem MDH mithilfe eines im folgenden Abschnitt beschriebenen spektrophotometrischen Standard-Assays zu untersuchen.
  6. Berechnen Sie die Integrität der mitochondrialen Membran wie folgt:
    figure-protocol-1

4. MDH-Aktivitätsbestimmung

HINWEIS: Die MDH-Aktivität wurde spektrophotometrisch gemessen, wie von Sottocasa et al.17beschrieben.

  1. Vorbereitung von Lösungen für Deninataum MDH
    1. 50 mM Tris-HCl-Lösung (pH = 7,5) vorbereiten: Eine 7,9 mg/ml Lösung in DW mit Tris-HCl vorbereiten und den pH-Wert bei 25 °C bei 1,0 M NaOH auf 7,5 einstellen.
    2. Bereiten Sie eine 50 mM Oxaloacetat-Lösung vor: Bereiten Sie eine 6,6 mg/ml-Lösung mit Oxaloacetat in Tris-HCl vor.
      HINWEIS: Diese Lösung ist nicht stabil einmal in der Lösung und sollte unmittelbar vor der Verwendung vorbereitet werden.
    3. Bereiten Sie eine 10 mM-NADH-Lösung vor: Bereiten Sie eine 7,81 mg/ml-Lösung mit der Verwendung von NADH in Tris-HCl vor.
  2. MDH-Aktivitätsbestimmung
    HINWEIS: Die Endkonzentrationen in einem 1,0 ml-Reaktionsgemisch sind 50 mM Tris-HCl, 5 mM Oxaloacetat und 0,1 mM NADH.
    1. Stellen Sie das Spektralphotometer auf 25 °C und 340 nm ein. Pipette 890 L Tris-HCl Puffer, 100 l Oxaloacetat-Lösung und 10 l NADH-Lösung für eine leere Küvette und 880 L Tris-HCl-Puffer, 100 l Oxaloacetat-Lösung und 10 l NADH-Lösung in eine Probenküvette.
    2. Inkubieren Sie Küvetten im Spektralphotometer für 3-4 min und Referenz gegen Leer.
    3. Dann 10 l mitochondriales Homogenat (1 mg/ml) in die Probenküvette geben, sofort durch Inversion mischen und Absorptionsabnahmen durch NADH-Oxidation bei 340 nm für 1 min aufzeichnen.

5. In-vitro-Synuclein, Rinderinsulin und HEWL-Fibrillenbildung

  1. Proteinzubereitung
    1. Synuclein:
      ANMERKUNG: Die Expression und Reinigung des rekombinanten Synucleins wird wie von Hoyer et al.18 mit einigen Modifikationen beschrieben durchgeführt, und die Reinheit von '-Synuclein wird durch SDS-PAGE bestätigt.
      1. Dialyse-gereinigtes Synuclein über Nacht gegen phosphatgepufferte Saline (PBS).
      2. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit einem Aussterbekoeffizienten von 5600 M-1 cm-1 bei 275 nm19.
      3. Aliquots Protein in 1,5 ml Tuben und lagern bei -80 °C bis zur Verwendung.
    2. Rinderinsulin und HEWL:
      1. Geben Sie sowohl Rinderinsulin als auch HEWL an.
      2. Lösen Sie jedes Protein in 50 mM Glycinpuffer (pH = 1,6; pH mit HCl einstellen).
      3. Bestimmen Sie die Rinderinsulin- und HEWL-Konzentration mit einem Aussterbekoeffizienten von 1,0 und 2,63 für 1,0 mg/ml bei 276 nm bzw. 280 nm bzw.20,21.
  2. Amyloid-Fibrillationsinduktion
    1. Vorbereitung von Lösungen für Amyloid-Fibrillation:
      1. Thioflavin T (ThT) Puffer vorbereiten: 0,3 g NaH2PO4 wiegen und in 80 ml DW auflösen, den pH-Wert auf 6,5 einstellen und das Volumen durch Zugabe von DW auf 100 ml erhöhen.
      2. ThT-Stammlösung (5 mM) vorbereiten: 1,6 mg ThT wiegen und in 1 ml ThT-Puffer auflösen, ein 0,22 m Filterpapier passieren und bis zum Gebrauch von Licht bei 4 °C fernhalten.
        HINWEIS: Diese Lösung kann bei 4 °C für bis zu 4 Wochen gelagert werden.
      3. ThT-Lösung (1 mM) vorbereiten: Fügen Sie 200 L ThT-Stammlösung (5 mM) zu 800 l ThT-Puffer hinzu.
        HINWEIS: Diese Lösung kann bis zu 1 Woche bei 4 °C gelagert werden.
    2. In-vitro-Synuclein-Amyloid-Fibrillenbildung:
      1. Fügen Sie Aliquots (294 l) Proteinlösung (200 m) und 6 l ThT-Lösung (1 mM) zu 1,5 ml-Röhren hinzu, gefolgt vom Rühren.
      2. Die Rohre in einem Thermomixer bei 37 °C unter ständigem Rühren bei 800 U/min 4 Tage bebrüten.
      3. Nehmen Sie nach regelmäßigen Zeitintervallen Aliquots (10 l) inkubierter Proben und fügen Sie 490 L ThT-Puffer hinzu, gründlich gemischt und 5 min bei RT inkubieren.
      4. Setzen Sie anregungs- und Emissionsschlitzbreiten auf 5 nm bzw. 10 nm, und messen Sie die ThT-Fluoreszenz durch Anregung bei 440 nm und die Emission mit einem Fluoreszenzspektrophotometer bei 485 nm.
    3. In-vitro-Rinderinsulin Amyloid-Fibrillenbildung:
      1. Fügen Sie 637 l Proteinlösung (250 m) zu 1,5 ml Röhre hinzu. Fügen Sie dann 13 l ThT-Lösung (1 mM) gefolgt von Rühren hinzu.
      2. Fügen Sie Aliquots (200 l) Proteinlösung (250 m) mit 20 M ThT zu jeder Bohrung einer klar bodengebundenen 96-Wellplatte hinzu und versiegeln Sie die Platte mit kristallklarem Dichtband.
      3. Die Platte in einen Fluoreszenzplattenleser laden und bei 57 °C ohne Rührung brüten.
      4. Messen Sie thT Fluoreszenz in 30 min Intervallen, mit Anregung bei 440 nm und Emission bei 485 nm, für 12 h.
        HINWEIS: Schütteln Sie die Platte vor jeder Messung 5 s lang.
    4. In-vitro-HEWL-Amyloid-Fibrillenbildung:
      1. Fügen Sie Aliquots (200 L) Proteinlösung )1 mM) mit 20 M ThT zu jeder Bohrung einer klar bodengebundenen 96-Wellplatte hinzu und versiegeln Sie die Platte mit kristallklarem Dichtband.
      2. Die Platte in einen Fluoreszenzplattenleser laden und bei 57 °C ohne Rührung brüten.
      3. Messen Sie die ThT-Fluoreszenz in 2-Stunden-Intervallen, mit Anregung bei 440 nm und Emission bei 485 nm, für 4 Tage.
        HINWEIS: Für alle drei Proteine wird die Amyloid-Fibrillenbildung durch Atomkraftmikroskopie bestätigt (Abbildung 2B).

6. Behandlung von Mitochondrien mit Amyloidfibrillen, MDH-Freisetzungstest und ROS-Messung

  1. Inkubation isolierter Mitochondrien mit Amyloidfibrillen
    1. Zentrifuge und Warmwasserbad einschalten und auf 4 °C bzw. 30 °C einstellen.
    2. Mit IF mitochondrialem Homogenat auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml verdünnen.
    3. Bereiten Sie zwei Reihen von 1,5 ml-Röhren vor, die mitochondriale Homogenate enthalten (eine Serie für MDH-Freisetzungstest und eine weitere für die mitochondriale ROS-Messung).
    4. Fügen Sie Aliquots von frischen oder amyloiden Fibrillen von ,-Synuclein, Rinderinsulin oder HEWL (bei Endkonzentrationen von 5 m, 10 m, 20 m und 25 m; verwenden Sie PBS oder Glycinpuffer als Kontrolle) zum mitochondrialen Homogenat (Endvolumen = 200 l) (siehe Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3) anschließend sanft mit einer Pipette rühren.
      HINWEIS: Für den MDH-Freisetzungstest verwenden Sie Triton X-100 (bei einer Endkonzentration von 0,5% [v/v]) als positive Kontrolle für die maximale Enzymfreisetzung.
    5. Inkubieren Sie Röhren mit mitochondrialen Suspensionen für 30 min im Warmwasserbad auf 30 °C eingestellt.
    6. Messen Sie die mitochondriale MDH-Freisetzung und den ROS-Inhalt gemäß den Abschnitten 6.2 und 6.3.
  2. Mitochondrial MDH Release Assay
    1. Zentrifugieren Sie die inkubierten mitochondrialen Homogenate bei 16.000 x g für 15 min, und sammeln Sie dann sorgfältig die resultierenden Überwälten, um die Aktivität der mitochondrialen MDH, wie in Abschnitt 4 beschrieben, zu bewerten.
    2. Berechnen Sie die Freisetzung von MDH als Bruchteil des maximalen Effekts (Triton X-100) wie folgt:

figure-protocol-2

  1. Mitochondriale ROS-Messung
    HINWEIS: Der mitochondriale ROS-Gehalt wird mit dem oxidationsempfindlichen fluorogenen Vorläufer Dihydrodichlorocarboxyfluorescein-Diaacetat (DCFDA)22bestimmt.
    1. Bereiten Sie Lösungen für die mitochondriale ROS-Messung vor. Bereiten Sie eine 50 M DCFDA-Lösung vor, indem Sie sie in Methanol (frisch vorbereiten) und eine 200 mM-Succinatlösung auflösen, indem Sie sie in DW auflösen.
    2. Pipette 191 l inkubiertes mitochondriales Homogenat zu jedem Brunnen einer 96-Well-Platte und 4 l mit 50 M DCFDA (1 M Endkonzentration) und 5 l mit 200 mM Succinat (5 mM Endkonzentration) hinzufügen.
    3. Inkubieren Sie die Platte 30 min in einem warmen Wasserbad bei 30 °C unter sanftem Rühren.
    4. Laden Sie die Platte in einen Fluoreszenzplattenleser und messen Sie die Fluoreszenzintensität, mit Anregung bei 485 nm und Emission bei 530 nm.

7. Statistische Analyse

  1. Führen Sie alle Experimente mindestens 2x oder 3x mit dreifachen Assays durch und führen Sie entsprechende statistische Tests durch. Hier werden die Ergebnisse als mittelwertige SD dargestellt, und ein Student es paired t-testwurde verwendet, um die statistische Signifikanz zu berechnen. P-Werte unter 0,01 und 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen (*p < 0,05; **p < 0,01).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Protokoll beschreibt ein Modell zur Untersuchung der Wechselwirkungen von Amyloidfibrillen mit Mitochondrien des Rattenhirns als in vitro biologisches Modell. Für die mitochondriale Präparation wurde 15% (v/v) Dichtegradientenmedium verwendet, um Myelin als größere Kontamination des Hirngewebes zu entfernen14. Wie in Abbildung 1Adargestellt, erzeugte die Zentrifugation bei 30.700 x g zwei unterschiedliche Materialbänder, Myelin

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine Fülle von experimentellen Ergebnissen stützt die Hypothese, dass die Zytotoxizität von fibrillaren Aggregaten signifikant mit ihrer Fähigkeit verbunden ist, mit biologischen Membranen zu interagieren und sie zu durchdringen4,5. Die meisten Daten basieren jedoch auf künstlichen Lipid-Doppelschichten, die nicht unbedingt die intrinsischen Eigenschaften biologischer Membranen widerspiegeln, die heterogene Strukturen mit einer Vielzahl von Phospholipiden und Pro...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch Stipendien des Research Council des Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), Zanjan, Iran, unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2′,7′-DichlordidihydrofluoresceindiacetatSigma35845
AmmoniumsulfatMerck1012171000
Schwarz 96-Well-PlatteCorning
Black 96-Well-Platte mit klarem BodenCorning
RinderinsulinSigmaI6634
Rinderserum Albumin (BSA)SigmaA2153
BSA im Wesentlichen fettsäurefreiSigmaA6003
ZentrifugeSigma
Kristallklares DichtbandCorning
CuSO4Sigma 451657
Dialysebeutel (abgeschnitten 2 KDa)SigmaD2272
Dounce HomogenisatorPotter Elvehjem
EDTASigmaE9884
Fluoreszenzplatten-ReaderBioTek
Fluoreszenz-SpektrophotometerCary Eclipse VARIAN
FolinMerckF9252
GlycinSigmaG7126
GuillotineHergestellt im Iran
HClMerckH1758
Hühnereiweiß Lysozym (HEWL)SigmaL6876
Na2CO3SigmaS7795
NaH2PO4SigmaS7907
NaOHMerckS8045
OxalacetatSigmaO4126
PercollGE Gesundheitswesen
Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS)SigmaCS0030
PMSFSigmaP7626
KaliumnatriumtartratSigma217255
QuarzküvetteSigma
Spektralphotometeranalytik jenaSPEKOL 2000 Modell
SuccinatSigmaS2378
SaccharoseMerck1076871000
ThermomischerEppendorph
Thioflavin TSigmaT3516
Tris-HClMerck1082191000
Triton X-100SigmaT9284
TryptonQUELAB
WasserbadMemmert
Hefe-ExtraktQUELAB
-NADHSigmaN8129
Black 96-Well-Platte Corning β

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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