Die Analyse der Zeckenhemolymphe stellt eine wichtige Quelle für Informationen darüber dar, wie einige Krankheitserreger verursachen und wie Zecken immunologisch auf diese Infektion reagieren. Die vorliegende Studie zeigt, wie man Pilzpropagiolen impfen und die Hämatymphe von Rhipicephalus microplus verzierten Weibchen sammeln kann.
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Methodenartikel
Die Sammlung der Häkolymphe und die Inokulation von Metarhizium-Blastospores in Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Pathology Studies
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Zecken sind obligatorische hämatopophagöse Ektoparasiten und Rhipicephalus microplus hat eine große Bedeutung in der Veterinärmedizin, weil es Anämie, Gewichtsverlust, Abwertung des Gelders der Tiere verursacht und auch als Vektor von mehreren Krankheitserregern wirken kann. Aufgrund der exorbitanten Kosten für die Kontrolle dieser Parasiten, der Umweltschäden, die durch den unangemessenen Einsatz chemischer Akarzide verursacht werden, und der erhöhten Resistenz gegen traditionelle Parasitizide, der alternativen Kontrolle von Zecken, durch den Einsatz von Entomopathogene Pilze etwa wurden als interessanter Ansatz angesehen. Dennoch haben nur wenige Studien gezeigt, wie das Immunsystem der Zecke gegen diese Entomopathogene wirkt. Daher zeigt dieses Protokoll zwei Methoden, die zur Entomopathogen-Impfung in engormierte Frauen verwendet werden, und zwei Techniken, die für die Hämatolymphentnahme und die Ernte von Hämozyten verwendet werden. Die Inokulation von Krankheitserregern an der Beineinfügung in den Körper der Zecke ermöglicht die Bewertung von weiblichen biologischen Parametern im Gegensatz zur Impfung zwischen dem Sutum und dem Kapitulum, die häufig das Organ von Gené schädigt. Die Dorsal-Hämatymphe gab eine höhere Erholung als die Sammlung durch die Beine. Einige Einschränkungen der Zeckenhemolymphentnahme und-verarbeitung sind i) hohe Raten der Hämozyten-Störung, ii) Hämatolymphkontamination mit gestörtem Midgut, und iii) niedrige Hämatolymphen-Volumen-Erholung. Wenn die Hämatymphe durch den Beinschnitt gesammelt wird, braucht die Hämatymphe Zeit, um sich an der Beinöffnung zu sammeln, was den Gerinnungsprozess begünstigt. Darüber hinaus werden im Vergleich zur Rückensammlung weniger Hämozyten in der Sammlung durch das Bein gewonnen, obwohl die erste Methode als leichter durchzuführen gilt. Das Verständnis der Immunantwort in Zecken durch entomopathogene Wirkstoffe vermittelt hilft, ihre Pathogenese zu enthüllen und neue Ziele für die Zeckenkontrolle zu entwickeln. Die hier beschriebenen Impfprozesse erfordern sehr geringe technologische Ressourcen und können nicht nur zur Exposition von Zecken für pathogene Mikroorganismen eingesetzt werden. In ähnlicher Weise kann die Sammlung von Zeckenhemolymphe den ersten Schritt für viele physiologische Studien darstellen.
Einleitung
Die Rinderzecke, Rhipicephalus microplus,ist ein Hämatophait-Ektoparasit mit enormen negativen Auswirkungen auf die Tiere in tropischen Gebieten. Diese Zecke ist der Vektor von Krankheitserregern wie Babesiabovis, Babesia bigeminaund Anaplasma marginale , die in Kombination mit den direkten Hämorschäden, die Milch-und Fleischproduktion, Anämie und schließlich den Tod reduzieren können. Die Verluste, die durch diesen Ektoparasiten verursachtwurden, wurden in Brasilien jährlich auf 3,24 Milliarden Dollar geschätzt. Nachhaltige Methoden werden gefordert und der Einsatz von entomopathogenen Wirkstoffen gilt als vielversprechende Alternative, um den Einsatz von chemischen Akarziden 2,3,4zu reduzieren.
Entomopathogene Pilze, wie Metarhizium spp., sind natürliche Feinde von Arthropoden einschließlich Zecken, und einige Isolate können als Biocontroller verwendet werden. Diese Erreger infizieren den Wirt aktiv durch die Kutikel und kolonisieren ihren Körper2,5,6. Im Zuge der Entwicklung der Infektion werden zelluläre und humorale Reaktionen durch das Zeckenimmunsystem vermittelt. Die Analyse der Zecke Hämata wird als ein nützliches Werkzeug zur Bewertung der Immunreaktionen nach der Herausforderung mit Krankheitserregern7,8berichtet.
Arthropods Immunantwort ist in humorale und zelluläre Reaktionen unterteilt. Die humorale Reaktion beinhaltet Hämoroperationen und die Produktion von antimikrobiellen Proteins-/Peptiden, während die zelluläre Immunantwort durch die Hämozyten erfolgt. Diese Zellen sind in der Hämatymphe von allen Arthropoden vorhanden und werden berichtet, um eine ausdrucksstarke Rolle in Studien mit angeborenen Immunantwort9 zuentwickeln, da es direkt mit der Phagozytose und Verkapselung. Demnach können Studien über Hämozyten helfen, den Todesweg zu untersuchen und Prozesse wie Autophagie, Apoptose und Nekrose zu verstehen. Bei einigen Wirbellosen als Zweiventile sieht sich die Sammlung der Hämozyten mit Einschränkungen konfrontiert, wie Zellstörungen, niedrigem Hemolymphvolumen und geringer Konzentration der wiedergewonnenen Zellen10. Sehr häufig, je nach angewandter Methodik, wird eine reduzierte Konzentration der Zellen erreicht, die sich direkt auf die Quantifizierung und Analyse der Zellen auswirkt.
Die Anzahl der Hämozyten, die in der Hämatymphe zirkulieren, ist unter den verschiedenen Arthropoden variabel und kann sich in der gleichen Art aufgrund verschiedener physiologischer Stadien wie Geschlecht, Alter und Entwicklungsstufe 11 des Arthropods verändern. Hanzyten können auch an einigen Organen haften und kurz nach dem Infektionsprozess 11 in den Kreislaufentlassenwerden. Dennoch werden die meisten Studien mit Insekten beschäftigt, während Zecken in Bezug auf ihre Physiologie und Pathologie weniger erforscht sind. Trotz der Paarungs-Impfung und Hämatolymphentnahme in Zecken sind weniger verwendet Techniken, die Etablierung von Standardmethoden hilft bei der Entwicklung von genaueren Studien.
Ziel der vorliegenden Studie war es, die am häufigsten verwendeten Methoden zur Hämatolymphentnahme und Impfung von Krankheitserregern in R. Microplus-Zecken zu vergleichen und dabei die Wirksamkeit bei der Hämatolymphenerfassung und der Hämozytenkonzentration zu bewerten.
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Protokoll
Zecken, die in der vorliegenden Studie verwendet wurden, stammen aus einer künstlichen Kolonie, die an der Federal Rural University of Rio de Janeiro betrieben wird und deren Methoden vom Ethikausschuss für die Verwendung von Vertebraten-Tieren genehmigt wurden (CEUA-IV/UFRRJ #037/2014).
1. Zick engmaschte Weibchen
- Nach der Zeckenauflösung, waschen Sie engreibige Weibchen mit Leitungswasser und tauchen Sie sie in 0,5% (v/v) Natriumhypochlorit-Lösung für 3 min in einem 500 ml Glasbecher-Empfänger, für die Kutikelhygiene (Abbildung 1), dann trocknen Sie alle Weibchen mit sterilen Papierhandtüchern (Abbildung Abbildung 2).
- Teilen Sie die Weibchen in homogenen Gruppen auf (mit je 20 Weibchen): Eine Gruppe ohne jegliche Behandlung, eine Kontrollgruppe geimpft mit 5 μL von 0,1% Polyoxyethylen-Sorbitan Monooleat wässrige Lösung (v/v), und eine Infekt-Gruppe geimpft mit 5 μL bei 1,0 x 10 7 Blastospores mL-1.
NOTE: Für die Lautstärke und Hämozytenkonzentration wurden nur unbehandelte Zecken verwendet. Drei Nachbildungen jeder Gruppe wurden durchgeführt.
2. Pathogene Impfung zwischen dem Skutum und dem Kapitulum
NOTE: In der vorliegenden Studie wurden entomopathogene Pilzaufhängungen als Beispiel herangezogen.
- Suspend Pilzblöcke in 1 mL von 0,1% Polyoxyethylen-Sorbitan wässrige Lösung (v/v) und passen Sie sich auf eine Endkonzentration von 1,0 x 107 Blastospores mL-1. Fügen Sie einen Aliquot von 5 μL Metarhizium-Blastosporen (Abbildung 3) an die Oberfläche einer Kunststoffparaffinfolie.
Hinweis: Die Aufhängung von Metarhizium blastospores wurde mit einer Neubauer ́s Kammereingestellt. Um den Impfprozess zu beschleunigen, können mehrere Blasen auf die Kunststoffparaffin-Folienfläche gesetzt werden, die jeweils 5 μL entsprechen. - Verwenden Sie eine ultrafeine Insulinspritze von 1 mL und eine 0,3 mm-Nadel, um die Aufhängung zu ziehen und in die Zecke zu impfen. Denken Sie daran, die ganze Luft aus der Spritze zu nehmen, bevor Sie sie verwenden.
- Enoculate 5 μL der Pilzaufhängung in die Zeckenweibchen zwischen dem Sutum und dem Kapital. Inoculate Weibchen aus der Kontrollgruppe mit 5 μL von 0,1% Polyoxyethylen-Sorbitan monooleat wässrige Lösung (v/v) ohne Pilz.
Hinweis: Nach dem Einsetzen der Nadel kann auf dem Foramen ein kleines Volumen an Hämatymphe vorhanden sein. Achten Sie darauf, die Luft nicht zu impfen.
3. Inokulation der entomopathogenen Pilze zwischen dem Beinthoch und dem Körper der Zecke
- Inoculate Weibchen mit Pilzfederung (5 μL bei 1,0 x 107 Blastospores mL-1) zwischen dem Beinzehen und dem Körper des Weibchens, mit einer 1 mL ultrafeinen Insulinspritze, die mit einer 0,3 mm-Nadel gekoppelt ist. Inoculate Weibchen aus der Kontrollgruppe mit 5 μL von 0,1% Polyoxyethylen-Sorbitan monooleat wässrige Lösung (v/v).
Hinweis: Wenn die Impfung zwischen dem Beinzehen und dem Körper des Zeckenweibchens durchgeführt wird, kann nach dem Einsetzen der Nadel ein kleines Volumen an Hämatolymphe auf dem Zehen vorhanden sein. Achten Sie darauf, die Luft nicht zu impfen.
4. Dorsal Hämatolymphensammlung
- Verwenden Sie den Gummiteil eines geflügelten Infusionssets, ein 0,3 mm Kapillarrohr und eine gefilterte Spitze, um die Hämatolymphensammlung durchzuführen.
- Die Rückenhaut mit einer 0,3 mm-Nadel stören.
- Nach der Störung, steuern Sie sanften Druck auf den vorderen Teil des Zeckenkörpers. Beobachten Sie ein fast durchsichtiges Ziehen aus der Störungsstelle. Sammeln Sie die Hämatymphe, indem Sie die Flüssigkeit durch die Filterspitze saugen, die mit dem Gummiteil eines geflügelten Infusionssatzes gekoppelt ist, und einem 0,3 mm Kapillarrohr.
Hinweis: Drücken Sie den Körper der Zecke während der Immobilisierung nicht kaum, da dies den Mittelgut stören und die Hämatymphe verunreinigen kann. Warten Sie, bis sanfter Druck die Flüssigkeit ohne Kontamination ausstoßen kann.
5. Häkolymphensammlung aus dem Zeckenbein
- Die Zecke spülen, ein Stück von einem Vorderbein mit einer Schere schneiden.
Hinweis: Ein oder mehrere Beine können geschnitten werden, ebenso wie das gleiche Bein kann mehr als einmal geschnitten werden. - Tragen Sie sanften Druck auf das hintere Körperteil der Zecke auf. Beobachten Sie eine durchsichtige Flüssigkeitsblase, die auf der geschnittenen Stelle auftaucht, und sammeln Sie sie mit dem Kapillarrohr, wie in Schritt 4.3 beschrieben.
Hinweis: Drücken Sie den Körper der Zecke während der Immobilisierung nicht kaum, da dies den Mittelgut stören und die Hämatymphe verunreinigen kann. Warten Sie, bis sanfter Druck die Flüssigkeit ohne Kontamination ausstoßen kann.
6. Häkolymphverarbeitung
- Nach der Hämatolymphentnahme in 1,5 mL-Mikroröhren, die zuvor mit 30 μL-Protease-Cocktail und 82 μL Salzpuffer gefüllt waren, ablegen. Halten Sie die Mikroröhren auf Eis während der gesamten Hämatolymphensammlung.
- Zentrifugenproben (500 x g für 3 min bei 4 ° C). Nach der Hämatolymphzentrifugation wird sich ein weiches Pellet von Hämozyten bilden.
Hinweis: Für die Hämatolymph-Quantifizierung, Quantifizieren Sie das Hämatolymphvolumen, das durch Zählen des Gesamtvolumens innerhalb des Mikrorohrs und Diskontierung des Volumens von Protease-Cocktail und Salzpuffer gewonnen wird. - Entfernen Sie vorsichtig den Supernatant (zellfreie Hämomulymphe). Sanft die Zellen in der auf pH 7,0-7,2 angepassten Low-15-Kultur von Leibovitz wiederbeleben. Quantifizieren Sie Hämozyten, indem Sie 10 μL wiederbelebter Hämozyten in einer Neubauer-Kammer platzieren.
7. Hämozyten-Probenahme Diavorbereitung
- Schneiden Sie das Vorderbein der Zecke mit einer Schere.
- Tragen Sie sanften Druck auf das hintere Körperteil der Zecke auf. Beobachten Sie eine transparente Flüssigkeitsblase, die auf der geschnittenen Stelle auftaucht.
- Tragen Sie die Hämatolymphentropfen direkt auf saubere Mikroskop-Dias auf, danach verwenden Sie die entsprechenden Methoden, um die Zellen zu verfärben.
- Um die Hämozyten mit Giemsa zu färben, die Hämatymphe auf der Rutsche 30 min lufttrocken zu halten, sie bei Raumtemperatur mit Methanol für 3 min zu fixieren und in der Giemsa-Lösung (1:9 Verhältnis der Pufferlösung von Sorensen, pH 7,2) für 30 min bei Raumtemperatur zu verfärben. Waschen Sie die Dias mit fließendem Wasser, um den Überschuss an Farbstoff zu entfernen, die Rutsche lufttrocknen und die Zellen mit 400x in einem optischen Mikroskop zu bewerten.
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Ergebnisse
Dieser Artikel nähert sich der Impfung und Hämatolymphentnahme Methoden, die auf Zecken angewendet. Nach der Impfung zwischen dem BeinthOberschenkel und dem Körper der Zecke kann während des Prozesses etwas Flüssigkeit (Hämatolymphe) ausgeschieden werden; Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass bei Beendigung der Impfung keine Flüssigkeit oder Gewebe in der Nadelspitze oder an der Impfung vorhanden waren, so dass die Pilzfederung vollständig geimpft wurde. Wenn der Impfprozess korrekt dur...
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Diskussion
Die Nachahmung von Krankheitserregern ist nützlich, wenn die Studie darauf abzielt, die In-vivo-Wirkung von Mikroorganismen in experimentellen Arthropodenmodellen zu untersuchen, da sie sicherstellt, dass sich der Erreger im Inneren des Wirts befindet. Die Technik kann auch auf Impfungen wie RNA-Interferenzen (RNAi) angewendet werden. Die Inokulation zwischen dem Skutum und dem Kapitulum wird als leichter zu erbringen angesehen, schädigt aber häufig das Organ von Gené,wasdie Lebensfähigkeit
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Studie wurde zum Teil von der Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) aus Brasilien, Finanzcode 001, finanziert. CAPES vergab ein Doktorandenstipendium für A.F. Marciano. Wir danken dem Nationalen Rat für wissenschaftliche und technologische Entwicklung (CNPq) Brasiliens für die Bereitstellung von Promotionsstipendien für J. Fiorotti. Diese Forschung wurde auch durch Stipendien der Carlos Chagas Filho Foundation for Research of the State of Rio de Janeiro (FAPERJ) und CNPq unterstützt. V.R.E.P. Bittencourt ist CNPq-Forscher.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Alkalische Hypochloritlösung | Sigma-Aldrich | A1727 | |
| D-(+)-Glukose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| EDTA | Synth | 2706 | |
| Fötales Rinderserum | Gibco | 16000036 | |
| Weichkautschuk | BD | ||
| Giemsa Fleck | Sigma-Aldrich | 48900-500ML-F | |
| Glaskapillare | CTechGlass | CT95-02 | |
| Insulinspritze (Nadel) | BD | Artikelnummer: 324910 | |
| KH2PO4 | Vetec | 60REAVET014512 | |
| L-15 Kulturmedium von Leibovitz | Gibco | 11415-064 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| Objektträger | Kasvi | K5-7105 | |
| Mikroröhrchen | MARKE | Z336769-1PAK | |
| Na2HPO4 | Vetec | 60REAVET014593 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Neubauer Kammer | Kasvi | K5-0111 | |
| Penicillin | Gibco | 15140163 | |
| Proteasehemmer Cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 |
Referenzen
- Grisi, L., et al. Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).
- Schrank, A., Vainstein, M. H. Metarhizium anisopliae enzymes and toxins. Toxicon. 56 (7), 1267-1274 (2010).
- Camargo, M. G., et al. Metarhizium anisopliae for controlling Rhipicephalus microplus ticks under field conditions. Veterinary Parasitology. 223, 38-42 (2016).
- Perinotto, W. M. S., et al. In vitro pathogenicity of different Metarhizium anisopliae s.l. isolates in oil formulations against Rhipicephalus microplus. Biocontrol Science and Technology. 27 (3), 338-347 (2017).
- Pedrini, N., Crespo, R., Juarez, M. P. Biochemistry of insect epicuticle degradation by entomopathogenic fungi. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology and Pharmacolpgy. 146 (1-2), 124-137 (2007).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the surface: Entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4 (3), 357-374 (2013).
- Angelo, I. C., et al. Detection of serpins involved in cellular immune response of Rhipicephalus microplus challenged with fungi. Biocontrol Science and Technology. 24 (3), 351-360 (2014).
- De Paulo, J. F., et al. Rhipicephalus microplus infected by Metarhizium: unveiling hemocyte quantification, GFP-fungi virulence, and ovary infection. Parasitology Research. 117, 1847-1856 (2018).
- Marmaras, V. J., Lampropoulou, M. Regulators and signalling in insect haemocyte immunity. Cell Signal. 21, 186-195 (2009).
- Hinzmann, M. F., Lopes-Lima, M., Gonçalves, J., Machado, J. Antiaggregant and toxic properties of different solutions on hemocytes of three freshwater bivalves. Toxicological & Environmental Chemistry. 95, 790-805 (2013).
- Nation, J. L. Insect Physiology and Biochemistry. , University of Florida. Gainesville, FL. (2016).
- Gene, J. Mémoires de l'Académie royale des sciences. Torino. 9, 751(1848).
- Lees, A. D., Beament, J. W. L. An organ waxing in ticks. The Quarterly Journal of the Mythic Society. 7, 291-332 (1948).
- Sonenshine, D. E., Roe, R. M. Biology of ticks. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2014).
- Tan, J., et al. Characterization of hemocytes proliferation in larval silkworm Bombyx mori. Journal of Insect Physiology. 59 (6), 595-603 (2013).
- Bowden, T. J. The humoral immune systems of the American lobster (Homarus americanus) and the European lobster (Homarus gammarus). Fish Research. 186, 367-371 (2017).
- Sonenshine, D. E., Hynes, W. L. Molecular characterization and related aspects of the innate immune response in ticks. Frontiers in Bioscience. 13, 7046-7063 (2008).
- Tsakas, S., Marmaras, V. Insect immunity and its signaling: an overview. Invertebrate Survival Journal. 7, 228-238 (2010).
- Burgdorfer, W. Hemolymph Test. A technique for detection of Rickettsiae in ticks. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 19, 1010-1014 (1970).
- Dunham-Ems, S. M., et al. Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks. Journal of Clinical Investigation. 119, 3652-3665 (2009).
- Patton, T. G., et al. Saliva, salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. 60, e3894(2012).
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