Methodenartikel

Eine vollständige Pipeline zum Isolieren und Sequenzieren von MicroRNAs und deren Analyse mithilfe von Open Source Tools

DOI:

10.3791/59901

⸱

21. August 2019

 ,  , 
1Division of Medical Genetics, University of Washington School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreiben wir eine schrittweise Strategie zur Isolierung kleiner RNAs, zur Anreicherung von microRNAs und zur Vorbereitung von Proben für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz. Anschließend wird beschrieben, wie Sequenzlesevorgänge verarbeitet und mithilfe von Open-Source-Tools an microRNAs ausgerichtet werden.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Hälfte aller menschlichen Transkripte wird angenommen, dass durch microRNAs reguliert werden. Daher kann die Quantifizierung der microRNA-Expression zugrunde liegende Mechanismen in Krankheitszuständen aufdecken und therapeutische Ziele und Biomarker bereitstellen. Hier erfahren Wir, wie microRNAs genau quantifiziert werden können. Kurz beschrieben diese Methode die Isolierung von microRNAs, die Anlage artizieren sie an Adapter, die für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz geeignet sind, die Erweiterung der Endprodukte und das Vorbereiten einer Beispielbibliothek. Anschließend erklären wir, wie die erhaltenen Sequenzierungs-Lesevorgänge an microRNA-Haarnadeln ausgerichtet und ihre Differentialexpression quantifiziert, normalisiert und berechnet werden. Vielseitig und robust, diese kombinierte experimentelle Workflow-und bioinformatische Analyse ermöglicht es Benutzern, mit der Gewebeextraktion zu beginnen und mit microRNA-Quantifizierung zu beenden.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Erstmals 19931 entdeckt, wird heute geschätzt, dass fast 2000 microRNAs im menschlichen Genom2vorhanden sind. MicroRNAs sind kleine nicht-kodierende RNAs, die in der Regel 21-24 Nukleotide lang sind. Sie sind posttranskriptielle Regulatoren der Genexpression, die oft an komplementäre Stellen in der 3-unübersetzten Region (3-UTR) von Zielgenen binden, um die Proteinexpression zu unterdrücken und mRNA zu degradieren. Die Quantifizierung von microRNAs kann wertvolle Einblicke in die Genexpression geben und zu diesem Zweck wurden mehrere Protokolle entwickelt3.

Wir haben ein definiertes, reproduzierbares und langjähriges Protokoll für die kleine RNA-Sequenzierung und für die Analyse normalisierter Lesevorgänge mit Open-Source-Bioinformatik-Tools entwickelt. Wichtig ist, dass unser Protokoll die gleichzeitige Identifizierung sowohl endogenes microRNAs als auch exogen gelieferter Konstrukte ermöglicht, die microRNA-ähnliche Arten produzieren, während gleichzeitig Lesevorgänge, die auf andere kleine RNA-Arten, einschließlich ribosomaler RNAs ( ( rRNAs), übertragen RNA-abgeleitete kleine RNAs (tsRNAs), wiederholte kleine RNAs und mRNA-Abbauprodukte. Glücklicherweise sind microRNAs 5-phosphorylierte und 2-3 hydroxylierte4, eine Funktion, die genutzt werden kann, um sie von diesen anderen kleinen RNAs und mRNA Abbauprodukten zu trennen. Für das Klonen und Sequenzieren von microRNA gibt es mehrere kommerzielle Optionen, die oft schneller und einfacher zu multiplexen sind. Die proprietäre Natur von Kit-Reagenzien und deren häufige Modifikationen machen den Vergleich von Probenläufen jedoch schwierig. Unsere Strategie optimiert das Sammeln nur der richtigen Größe von microRNAs durch Acrylamid- und Agarose-Gel-Reinigungsschritte. In diesem Protokoll beschreiben wir auch ein Verfahren zum Ausrichten von Sequenzlesevorgängen an microRNAs mithilfe von Open-Source-Tools. Dieser Satz von Anweisungen wird besonders nützlich für Unerfahrene Informatik-Benutzer sein, unabhängig davon, ob unsere Bibliotheksvorbereitungsmethode oder eine kommerzielle Methode verwendet wird.

Dieses Protokoll wurde in mehreren veröffentlichten Studien verwendet. Zum Beispiel wurde es verwendet, um den Mechanismus zu identifizieren, durch den das Dicer-Enzym kleine Haarnadel-RNAs in einem Abstand von zwei Nukleotiden von der internen Schleife der Stammschleifenstruktur - der sogenannten "Schleifenzählregel"5- spaltet. Wir folgten auch diesen Methoden, um die relative Häufigkeit der gelieferten kleinen Haarnadel-RNAs (shRNA) zu identifizieren, die aus rekombinanten adenoassoziierten viralen Vektoren (rAAVs) exprimiert wurden, um den Schwellenwert der shRNA-Expression zu identifizieren, der vor der Leber toleriert werden kann. Toxizität im Zusammenhang mit überschüssiger shRNA-Expression6. Mit diesem Protokoll identifizierten wir auch microRNAs in der Leber, die auf das Fehlen von microRNA-122 - einer hochgradig exprimierenden leberischen microRNA - reagieren und gleichzeitig das Abbaumuster dieser microRNA7charakterisieren. Da wir unser Protokoll in zahlreichen Experimenten konsequent eingesetzt haben, konnten wir Probenpräparate längs beobachten und feststellen, dass es keine erkennbaren Chargeneffekte gibt.

Bei der Gemeinsamen Nutzung dieses Protokolls ist es unser Ziel, den Anwendern die Möglichkeit zu geben, eine qualitativ hochwertige, reproduzierbare Quantifizierung von microRNAs in praktisch jeder Gewebe- oder Zelllinie mit erschwinglichen Geräten und Reagenzien und kostenlosen Bioinformatik-Tools zu generieren.

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Protokoll

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Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Washington genehmigt.

Kleine RNA-Bibliotheksvorbereitung

1. RNA-Isolation

  1. Isolieren Sie RNA aus einer biologischen Quelle mit einem Standard-RNA-Isolationsreagenz oder einem Kit, das für microRNAs anreichert. Für Gewebe ist es am besten, mit Proben zu beginnen, die in flüssigem Stickstoff eingefroren und zu einem Pulver gemahlen werden, indem man einen vorgekühlten Mörtel und Stößel verwendet.
  2. Messen Sie die RNA-Integrität jeder Probe auf einem Instrument, das RNA quantifizieren und eine RNA-Integritätsnummer (RIN) bereitstellen kann. RINs sollten >7 sein.

2. 3' Adaptorligation

  1. Bereiten Sie eine Ligationsreaktion in PCR-Streifenröhren vor, indem Sie: 11 l RNA (1-3 g, mit der gleichen Menge für jede Probe), 1,5 l 10x T4-RNA-Ligase-Reaktionspuffer, ATP-frei, 1 l Polyethylenglykol (PEG) und 0,5 l 3'-Linker (100 Ker).
    HINWEIS: Das Fehlen von ATP hilft bei der Anreicherung von miRNAs und minimiert das Klonen von mRNA-Abbauprodukten. PEG fungiert als molekulares Crowding-Agent und verbessert die erfolgreiche Ligation. Der Universal miRNA Klonlinker hat eine 3' Blockiergruppe (Amin), um Selbstligation, Zirkularisierung und Ligation zur RNA am 5' Ende zu verhindern.
  2. Erhitzen Sie die Proben bei 95 °C auf einem Thermocycler für 30-40 s. Auf Eis für 1 min abkühlen. 1 L T4-RNA-Ligase 2 hinzufügen und bei Raumtemperatur 2 h inkubieren. Bereiten Sie das Gel (Schritt 2.3) vor, während die Proben inkubieren.
    HINWEIS: Die Inkubation bei Raumtemperatur verhindert linker-linker Ligation. Wir haben auch T4 RNA Ligase 1 erfolgreich eingesetzt.
  3. 30 ml eines 15% Polyacrylamidgels mit 8 M Harnstoff (für ein 20x20 cm Gel): 14,4 g Harnstoff, 3 ml 10x Tris-gepufferte Ethylendiamintetraessigsäure (TBE), 11,2 ml 40% 19:1 Acrylamid und H2 Obis 30 ml zubereiten. Die Lösung wird am besten bei 42 °C gelöst. Unmittelbar vor dem Gießen 150 l 10 % Ammoniumpersulfat (APS) und 30 l Tetramethylethylendiamin (TEMED) zur Polymerisation hinzufügen.
  4. Zwischen 0,8 mm getrennte Glasplatten in einen Kunststoffguss gießen und Kamm einsetzen. Sobald das Gel erstarrt ist (ca. 20 min), 0,5x TBE in den Tank geben und Brunnen von Restharnstoff durch kräftiges Pipetieren waschen.
  5. Führen Sie das Gel bei einer konstanten 375 V für 25 min ohne Proben vor, damit Harnstoff in das Gel gelangen kann, und waschen Sie dann die Brunnen wieder.
    HINWEIS: Die Spannungsmenge muss je nach Art der Stromversorgung und des verwendeten Elektrophoresesystems möglicherweise reduziert werden.
  6. Sobald die Proben ligatieren, fügen Sie den Proben 15 l Acrylamid-Ladefarbstoff hinzu (für ein Verhältnis von 1:1), dann denaturieren Sie sie für 5 min bei 95 °C auf einem Thermocycler.
  7. Bereiten Sie 25 ng/l mit 37 und 44 bp-Größenmarkern vor, die mit einem Teil Acrylamid-Ladefarbstoff verdünnt werden. Sequenzen sind in Tabelle 1aufgeführt.
  8. Laden Sie die Proben auf das Polyacrylamid-Gel, so dass mindestens eine Spur zwischen den Proben bleibt. Laden Sie 20 L von mindestens zwei Sätzen von Markern in einem asymmetrischen Muster, um die Gelausrichtung nachzuverfolgen.
  9. Führen Sie das Gel in den ersten 15 minuten konstant 375 V aus und erhöhen Sie es dann für den verbleibenden Lauf auf konstante 425 V. Laufen, bis Bromphenolblau ca. 1-4 cm von unten entfernt ist, was ca. 2 h dauert.
    HINWEIS: Bei Bedarf kann das Gel über einen längeren Zeitraum mit einer niedrigeren konstanten Spannung ausgeführt werden, bis das Bromphenolblau etwa 1-4 cm von unten entfernt ist.
  10. Entfernen Sie das Gel von den Glasplatten mit einem Plattenabscheider, und legen Sie das Gel auf einen Kunststoff-Seitenschutz. Verdünnen Sie 5 l Ethidiumbromid in 500 l destilliertem Wasser und Pipette auf Markerspuren knapp über dem oberen hellblauen Marker (siehe Abbildung 1A).
    VORSICHT: Verwenden Sie Handschuhe für Ethidiumbromid und entsorgen Sie Abfälle gemäß den örtlichen Vorschriften. Lassen Sie für 5 min sitzen.
  11. Schneiden Sie die Gele unter ultraviolettem (UV) Licht in jeder Spur mit sauberer Rasierklinge von der oberen zur unteren Markierung (siehe Abbildung 1A). Auf ein 4 x 4 cm großes Quadrat laborversiegelnder Folie übertragen, dann das Gel mit ca. 4 Schnitten horizontal und 3 vertikal schneiden, um 12 kleine Quadrate zu erzeugen (siehe Abbildung 1B).
  12. Pipette 400 l von 0,3 M NaCl auf das Dichtfolienquadrat und Trichtergelstücke in 1,5 ml silikonisierte Rohre (siehe Abbildung 1C). Die Proben auf einem Nutator bei 4 °C über Nacht aufstellen.
    HINWEIS: Andere retentionsarme 1,5 ml Rohre können durch silikonisierte Rohre ersetzt werden.
  13. Nach mindestens 12 h Rührung bei 4 °C die Proben abholen und auf Eis legen, zusammen mit einem konischen Rohr von 100% Ethanol.
  14. Übertragen Sie 400 l Überstand in ein neues Rohr, und fügen Sie dann 1 ml 100% Ethanol und 1 l 15 mg/ml Glykokoprezipatmittel hinzu. Achten Sie darauf, so viel Überstand wie möglich zu sammeln, bei 4 °C nach unten zu drehen und bei Bedarf mehr zu pipetieren. Bei -80 °C für 1 h oder -20 °C für 2 h oder länger platzieren. Glykokoprezipitant verbessert die Sichtbarkeit und Erholung von Pellets.
  15. Drehen Sie bei 4 °C bei 17.000 x g für 20-30 min. Entfernen Sie alle Spuren von Ethanol und lassen Sie Pelletluft für 5 min trocknen.

3. 5' Linker ligation

  1. Das Pellet durch Pipettieren in 6,5 l nukleasefreiem Wasser wieder aufhängen. Wenn man das Pellet zunächst für ein paar Minuten im Wasser sitzen lässt, hilft dies bei der Wiedersuspension.
  2. Nach dem Abspinnen des Pellets und dem Wiederaufsetzen in Wasser, fügen Sie 0,5 l von 100 'M 5'-Linker (mit Barcodes; siehe Tabelle 1), 1 l T4-RNA-Ligasepuffer, 1 l von 10 mM ATP und 1 l PEG hinzu. Bei 90 °C 30 s erhitzen und dann auf Eis legen. Fügen Sie 1 L T4-RNA-Ligase 1 hinzu und lassen Sie sie bei Raumtemperatur für 2 h inkubieren.
  3. Fügen Sie 400 l von 0,3 M NaCl hinzu, gefolgt von 400 l Saurphenol/Chloroform. Vortex 30 s - 1 min (Lösung sieht trüb aus), und dann bei 4 °C für 10-15 min bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge drehen (ca. 17.000 x g). Ziehen Sie die obere Schicht ab und legen Sie sie in ein neues 1,5 ml-Rohr.
    HINWEIS: Vermeiden Sie Pipettierung der unteren Schicht.
  4. Fügen Sie 350 l Chloroform, Wirbel kurz, und drehen Sie dann bei 4 °C für 10 min bei maximaler Geschwindigkeit (ca. 17.000 x g). Ziehen Sie die Spitze später ab und platzieren Sie sie in einem neuen 1,5 ml Rohr. Fügen Sie 1,5 l Glykozipant und 1 ml 100% Ethanol hinzu.
    HINWEIS: Vermeiden Sie erneut das Pipettieren einer der unteren Schichten.
  5. Kurz vortex, dann bei -80 °C für mindestens 1 h oder -20 °C über Nacht platzieren.

4. Umgekehrte Transkription (RT)

  1. Schalten Sie den 42 °C-Wärmeblock ein. Drehen Sie die Proben bei 4 °C und 17.000 x g für 20-30 min. Entfernen Sie alle Überstand und lassen Sie die Pelletluft für 5 min trocknen.
  2. Die Pelletprobe in 8,25 l nukleasefreiem Wasser wieder aufsetzen, dann hinzufügen: 0,5 l mit 100 'M RT-Primer (Tabelle 1) und 5 l 2x RT-Reaktionsmix aus einem cDNA-Synthese-Kit. Bei 42 °C für 3 min inkubieren.
  3. Zu jeder Probe 1,5 l 10x RT-Enzym geben und bei 42 °C 30 min in einem Thermocycler inkubieren. Bei -20 °C platzieren oder mit Hydrolyse und Neutralisation fortfahren.
    HINWEIS: Für die Schritte 4.2 und 4.3 können mehrere RT-Kits verwendet werden.
  4. Durchführung einer alkalischen Hydrolyse und Neutralisation: Machen Sie 1 ml 150 ml Kaliumhydroxid (KOH) Lösung (150 l von 1 M KOH, 20 lvon 1 M Tris Base pH 7,5 und 830 l H2 O) und 1 ml 150 mM Salzsäure (HCl) (150 l von 1 M HCl und 850 l LLL von H2O).
  5. Bestimmen Sie vor dem Hinzufügen zu den Proben die Menge an HCl, die zum Neutralisieren der KOH-Lösung erforderlich ist. In der Regel neutralisieren ca. 20-24 L HCl die 25 L KOH. Überprüfen Sie die Kombination auf einem pH-Streifen, um sicherzustellen, dass sie sich im richtigen Bereich befindet (pH 7,0 bis 9,5).
  6. Hydrolysieren Sie die Proben, indem Sie 25 l von 150 mM KOH-Lösung hinzufügen und 10 min bei 95 °C inkubieren.
  7. Neutralisieren Sie die Proben, indem Sie die in Schritt 4.4 ermittelte Menge von 150 mM HCl hinzufügen, um einen pH-Wert der endletzten Probe zwischen 7,0 und 9,5 zu erhalten.

5. PCR-Verstärkung

  1. Nach der Neutralisation eine PCR-Reaktion vorbereiten mit: 29,5 l Wasser, 5 l 10x Taq-Puffer, 1 l dNTP, 2 l von 25 -M Vorwärtsprimer (Tabelle 1), 2 l von 25 -M-Reverse-Primer (Tabelle1), 0,5 l Taq und 10 l der umgekehrttranskribierten cDNA ab Schritt 4,6 .
  2. Führen Sie die folgende PCR-Reaktion: 94 °C für 2 min, dann 20 Zyklen von 94 °C für 45 s, 50 °C für 75 s und 72 °C für 60 s.
  3. Führen Sie eine zweite PCR-Reaktion von ca. 2-4 weiteren Zyklen mit 5 l Produkt ab Schritt 5.2 aus. Mischen Sie: 34,8 l Wasser, 5 l 10x Taq-Puffer, 1 l dNTP, 1 l von 25 -M Vorwärtsprimer (Tabelle1), 1 l von 25 -M Reverse Primer (Tabelle 1) und 0,2 l Taq-Polymerase. Befolgen Sie die gleichen Thermocycler-Parameter, die in Schritt 5.2 beschrieben sind.
    HINWEIS: Der Zweck von zwei PCR-Reaktionen – mit der ersten für 20 Zyklen und die zweite für nur 2-4 mehr – ist sicherzustellen, dass die Menge der cDNA verstärkt in einem dynamischen Bereich (d. h. nicht eine gesättigte Menge).

6. Agarose-Gel-Reinigung

  1. Bereiten Sie ein 4% Agarose-Gel mit niedrigschmelzender Agarose vor. Laden Sie 40 l oder mehr des PCR-Produkts auf das Gel, zusammen mit dem Ladefarbstoff. Laden Sie 100 bp und 25 bp Größe Marker.
    HINWEIS: Die 25 bp Leiter hilft, verstärktes Produkt von Linker-Linker-Ligationsprodukten zu unterscheiden. Niedrigschmelzende Agarose-Gele müssen mit größerer Sorgfalt gegossen werden als herkömmliche Agarose-Gele, so genau folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
  2. Wählen Sie für die Gelextraktion die Zyklusnummer aus, die auf dem Gel sichtbar, aber nicht gesättigt ist (normalerweise 22–24 Zyklen). Wählen Sie ähnliche Intensitätsbänder aus, wenn Sie mehrere Samples ausführen.
  3. Schneiden Sie das Band, das über dem 125 bp-Band liegt (das dunklere Band auf 25 bp Leiter; siehe Abbildung 1D). Befolgen Sie mit einem Gel-Extraktionskit die Anweisungen des Herstellers, um Puffer auf Basis eines 4%-Gels hinzuzufügen, und schütteln Sie dann, um Agarose im Puffer bei Raumtemperatur aufzulösen.
    HINWEIS: Das Lösen bei 55 °C erhöht das Potenzial für Linker-Linker-Ligation.
  4. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers zur Gelextraktion und leuchten Sie in 30 l Elutionspuffer oder Wasser. Wenn das Produkt schwach auf dem Gel aussah, dann reduzieren Sie die Elution auf 20 l.
  5. Messen Sie die cDNA-Konzentration mit einer empfindlichen Technik, und bereiten Sie die Beispielbibliothek für die Sequenzierung vor. Die Vorbereitung hängt von der Art der verwendeten Sequenzierung ab.
    HINWEIS: Die Mindestanforderungen für eine Sequenzierungsbibliothek sind in der Regel ein Volumen von 10 L von 10 Mio. M. Wenn die Konzentrationen zu niedrig sind, fallen Pool- und Ethanolproben aus, um die Bibliothek auf die gewünschte Konzentration zu bringen.
  6. Sequenzieren Sie die Proben mit verfügbaren Geräten. Ein gängiges Beispiel wäre, Samples mit einem Kit für 50 bp Einzellesevorgänge auszuführen, um etwa 15-25 Millionen Lesevorgänge in einem FASTQ-Ausgabeformat zu erhalten.

Kleine RNA-Sequenzausrichtung und Bioinformatik

7. Daten-Upload

  1. Laden Sie FASTQ-Dateien herunter, die bei jedem Sequenzierungslauf generiert wurden. Laden Sie eine Liste von microRNA Haarnadelsequenzen von miRbase.org8,9,10herunter.
  2. Generieren Sie ein Galaxy-Konto auf www.usegalaxy.org und laden Sie eine FASTQ-Datei mit Sequenzlesevorgängen in dieses Konto hoch.
  3. Laden Sie eine Textdatei mit Barcodesequenzen in das Galaxy-Konto hoch, z. B. barcodes.txt, das als Textdatei verfügbar ist (Ergänzende Tabelle 1).
  4. Laden Sie eine FASTA-Datei mit microRNA-Haarnadeln aus einer Datenbank wie miRBase.org in das Galaxy-Konto hoch. Beispiele für Maus (mousehairpins.fa) oder menschliche (humanhairpins.fa) mikroRNA-Vorstufen sind in Der Ergänzenden Tabelle 2 und ergänzender Tabelle 3aufgeführt.

8. Adapterentfernung, Barcode-Sortierung und Trimmung

  1. Navigieren Sie auf der linken Registerkarte zu Genomische Dateimanipulation > FASTA/FASTQ > Clipadaptersequenzen.
  2. Geben Sie in der Eingabedatei im FASTA- oder FASTQ-Formatdie FASTQ-Datei aus der Dropdown-Liste ein. Ändern Sie die minimale Sequenzlänge auf 18. Ändern Sie Quelle in Benutzerdefinierte Sequenz eingeben. Geben Sie CTGTAGGCein. Behalten Sie alle anderen Standardparameter bei. Klicken Sie auf Ausführen.
    HINWEIS: Sequenzlesevorgänge, die kürzer als 18 Nukleotide sind, lassen sich nur schwer mikroRNAs zuordnen und enthalten viele Abbauprodukte.
  3. Navigieren Sie auf der linken Registerkarte zu Genomische Dateimanipulation > FASTA/FASTQ > Barcode Splitter.
    HINWEIS: Galaxy-Funktionen und Header werden regelmäßig aktualisiert, sodass die Suchfunktion möglicherweise erforderlich ist, um ein gleichwertiges Werkzeug oder seinen Speicherort zu finden. Kommerzielle Kits mit indizierten Primern sind oft bereits nach Barcode sortiert. Daher sind dieser Schritt und der Barcode-Trimmschritt nicht notwendig, wenn sie von einem kommerziellen Kit aus beginnen.
  4. Damit Barcodes verwendet werdenkönnen, zeigen Sie auf barcodes.txt. Damit die Bibliothek geteilt werdenkann, verwenden Sie Clip für die im vorherigen Schritt erstellte Datendatei. Geben Sie unter Anzahl der zulässigen Nichtübereinstimmungen 1ein. Klicken Sie auf Ausführen.
  5. Trimmen Sie die ersten 4 Nukleotide: Navigieren Sie zu Textmanipulationen > Führende oder nachfolgende Zeichenschneiden . Klicken Sie für das Eingabe-Datasetauf das Ordnersymbol, bei dem es sich um eine Dataset-Sammlung handelt. Wählen Sie die Batchdatei von Beispielen aus, die das Label Barcode Splitter auf datenenthält. Geben Sie in Trim von Anfang bis zu dieser Position 5ein. In Ist Eingabe-Dataset im FASTQ-Format? Geben Sie Jaein. Klicken Sie auf Ausführen. Die Ausführung kann mehrere Minuten dauern.

9. Ausrichtung der Lesevorgänge an microRNAs

  1. Navigieren Sie in Galaxy zur Genomikanalyse > RNA-Seq > Sailfish Transkriptquantifizierung11.
  2. Wählen Sie für die Frage Ein Referenztranskriptome aus Ihrer Historie aus oder verwenden Sie einen integrierten Index? Wählen Sie Eines aus der Historieverwenden aus. Geben Sie die hochgeladene Datei mousehairpins.fa aus der Dropdown-Liste ein. Klicken Sie in der FASTA/Q-Datei auf das Ordnersymbol, um eine Datasetsammlung zu verwenden, und wählen Sie die Datei aus, die Trim on collectionenthält. Klicken Sie auf Ausführen. Die Ausführung kann mehrere Minuten dauern.
  3. Klicken Sie im Historischen Tab auf der rechten Seite auf Sailfish on collection... das ist eine Liste mit 19 Artikeln. Klicken Sie auf jede einzelne Datei und klicken Sie auf das Festplattensymbol, um es auf dem lokalen Computer zu speichern. Individuell heruntergeladene Dateien müssen zuerst dekomprimiert werden. Möglicherweise müssen sie auch mit einer .txt-Erweiterung zum Importieren in eine Kalkulationstabelle erneut gespeichert werden.
  4. Öffnen Sie jede Tabellenkalkulationsdatei in, und benennen Sie die Spalte NumReads in die Behandlungsbedingung um. Führen Sie die Spalten zusammen, um eine Matrix von microRNAs in der ersten Spalte zu generieren, und lesen Sie die Anzahl pro Bedingung in nachfolgenden Spalten.
  5. Um differenziell ausgedrückte microRNAs für jede Behandlungsbedingung zu berechnen, verwenden Sie die Datei mit rohen microRNA-Lesezahlen als Eingabe für Programme wie DESeq212. DESeq2 ist in Galaxy in der Registerkarte Genomikanalyse > RNA-seq > DESeq2 vorhanden.
  6. Konvertieren Sie rohe Lesevorgänge in normalisierte microRNA-Lesezahlen. Die Zählungen werden durch die folgende Berechnung zur Bibliothekssequenztiefe der Bibliothek normalisiert: [(Rohlese-/Gesamt-MicroRNA-Lesungen) * (1.000.000 – Anzahl der gezählten microRNAs) + 1].
    HINWEIS: Diese Berechnung bietet einen normalisierten Lesewert pro Million (RPM) zugeordneter microRNAs, der über Datasets und biologische Bedingungen hinweg verglichen werden kann. Bei der Ausgabe handelt es sich um eine datei mit Durchlader. Sailfish stellt eine tpm-Ausgangsspalte bereit, obwohl dieser Wert durch die microRNA-Haarnadellänge normalisiert wird, was in diesem Zusammenhang nicht notwendig ist.
  7. Wiederholen Sie ggf. die Ausrichtung mit benutzerdefinierten Eingabesequenzen (z. B. einem Vektor), um Lesevorgänge zu identifizieren, die diese Zuordnung bereitgestellten Konstrukten wie shRNAs zugeordnet werden.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schemader der Schritte bei der Bibliotheksvorbereitung
Abbildung 2ist ein Gesamtschema der Extraktion, Sequenzierung und Ausrichtung kleiner RNA dargestellt.
Leberproben von einem Mann und einer weiblichen Maus wurden gesammelt und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die gesamte RNA wurde extrahiert und auf Qualität und Konzentration bewertet.

Kleine RNA-Sequenzierung...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trotz der Identifizierung von microRNAs vor über 20 Jahren13, bleibt der Prozess der microRNA-Sequenzierung mühsam und erfordert spezielle Ausrüstung, die Laboratorien daran hindert, routinemäßig interne Protokolle zu übernehmen14. Andere Techniken können microRNAs gleichzeitig bewerten, wie microRNA-Mikroarrays und Multiplexexpressionspanels; Diese Ansätze sind jedoch insofern begrenzt, als sie nur die in ihrem Prüfpunkt vorhandenen microRNAs quantifizieren. Aus diesem Gru...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken den Mitgliedern der Laboratorien von Andrew Fire und Mark Kay für die Anleitung und Anregungen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100 bp DNA-LeiterNEBN3231
19:1 Bis-AcrylamidMillipore SigmaA9926
25 bp DNA-StufenleiterPromegaG4511
Saures Phenol/ChloroformThermoFisherAM9720
Acrylamid RNA-LadefarbstoffThermoFisherR0641
Ammoniumpersulfat (APS)Biorad161-0700
BioanalysegerätAgilentG2991AAZur Beurteilung der RNA-Qualität und -Konzentration
ChloroformFisher ScientificC298-500
Ethanol (100%)SigmaE7023
Gel Loading Buffer IIThermoFisherAM8547
GlycoBlueThermoFisherAM9516Blaue Farbe hilft bei der Visualisierung von Pellets
HClSigma320331
KOHSigmaP5958
Maxi Vertical Gel Box 20 x 20 cmGenesee45-109
miRVana microRNA IsolationskitThermoFisherAM1560
miSeq SystemIlluminaSY-410-1003Zur Generierung kleiner RNA-Sequenzierungsdaten
NaClFisher ScientificS271-500
Nusieve niedrigschmelzendeAgarose Lonza50081
Parafilm (Labor-Versiegelungsfolie)Millipore SigmaP7793
Polyethylenglykol 8000NEBim Lieferumfang von M0204
ProtoScript II Erststrang-cDNA-SynthesekitNEBE6560S
QIAquick Gel ExtraktionskitQiagen28704
Qubit FluorometerThermoFisherQ33226Zur Quantifizierung der DNA-Konzentration
Qubit RNA HS Assay KitThermoFisherQ32855
RasierklingenFisher Scientific12640
Silikonisierte Low-Retention 1,5 ml RöhrchenFisher Scientific02-681-331
T4 RNA Ligase 1NEBM0204
T4 RNA Ligase 2, gekürzt K227QNEBM0351S
TapeStationAgilentZur Beurteilung der RNA-Qualität und -Konzentration
Taq DNA-PolymeraseNEBM0273X
TEMEDBiorad161-0800
Tris-Base pH 7,5Sigma10708976001
Tris-gepuffertes EDTASigmaT9285
TrizolThermoFisher15596026
Ultrareines Ethidiumbromid (10 mg/ml)Invitrogen15585-011
Universeller miRNA-KlonierungslinkerNEBS1315S
HarnstoffSigmaU5378
G2939BA

Referenzen

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  1. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
  2. Bartel, D. P. Metazoan MicroRNAs. Cell. 173 (1), 20-51 (2018).
  3. Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
  4. Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C. Biogenesis of small RNAs in animals. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (2), 126-139 (2009).
  5. Gu, S., et al. The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo. Cell. 151 (4), 900-911 (2012).
  6. Valdmanis, P. N., et al. RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice. Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).
  7. Valdmanis, P. N., et al. miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression. Nature Communications. 9 (1), 5321(2018).
  8. Griffiths-Jones, S. The microRNA Registry. Nucleic Acids Research. 32, D109-D111 (2004).
  9. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).
  10. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).
  11. Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms. Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).
  12. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550(2014).
  13. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  14. Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids. Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).
  15. Yamane, D., et al. Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).
  16. Giraldez, M. D., et al. Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling. Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).
  17. Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19 (1), 118(2018).
  18. Yeri, A., et al. Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA. BMC Genomics. 19 (1), 331(2018).
  19. Coenen-Stass, A. M. L., et al. Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing. RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).
  20. Baran-Gale, J., et al. Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods. Frontiers in Genetics. 6, 352(2015).
  21. Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), e141(2011).
  22. Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6 (10), e26969(2011).
  23. Valdmanis, P. N., et al. Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma. Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).
  24. Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification. Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).
  25. Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis. BMC Biotechnology. 11, 72(2011).
  26. Chiang, H. R., et al. Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes. Genes & Development. 24 (10), 992-1009 (2010).
  27. Fromm, B., et al. A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome. Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).

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