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Summary

Hier beschreiben wir eine schrittweise Strategie zur Isolierung kleiner RNAs, zur Anreicherung von microRNAs und zur Vorbereitung von Proben für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz. Anschließend wird beschrieben, wie Sequenzlesevorgänge verarbeitet und mithilfe von Open-Source-Tools an microRNAs ausgerichtet werden.

Abstract

Die Hälfte aller menschlichen Transkripte wird angenommen, dass durch microRNAs reguliert werden. Daher kann die Quantifizierung der microRNA-Expression zugrunde liegende Mechanismen in Krankheitszuständen aufdecken und therapeutische Ziele und Biomarker bereitstellen. Hier erfahren Wir, wie microRNAs genau quantifiziert werden können. Kurz beschrieben diese Methode die Isolierung von microRNAs, die Anlage artizieren sie an Adapter, die für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz geeignet sind, die Erweiterung der Endprodukte und das Vorbereiten einer Beispielbibliothek. Anschließend erklären wir, wie die erhaltenen Sequenzierungs-Lesevorgänge an microRNA-Haarnadeln ausgerichtet und ihre Differentialexpression quantifiziert, normalisiert und berechnet werden. Vielseitig und robust, diese kombinierte experimentelle Workflow-und bioinformatische Analyse ermöglicht es Benutzern, mit der Gewebeextraktion zu beginnen und mit microRNA-Quantifizierung zu beenden.

Introduction

Erstmals 19931 entdeckt, wird heute geschätzt, dass fast 2000 microRNAs im menschlichen Genom²vorhanden sind. MicroRNAs sind kleine nicht-kodierende RNAs, die in der Regel 21-24 Nukleotide lang sind. Sie sind posttranskriptielle Regulatoren der Genexpression, die oft an komplementäre Stellen in der 3-unübersetzten Region (3-UTR) von Zielgenen binden, um die Proteinexpression zu unterdrücken und mRNA zu degradieren. Die Quantifizierung von microRNAs kann wertvolle Einblicke in die Genexpression geben und zu diesem Zweck wurden mehrere Protokolle entwickelt³.

Wir haben ein definiertes, reproduzierbares und langjähriges Protokoll für die kleine RNA-Sequenzierung und für die Analyse normalisierter Lesevorgänge mit Open-Source-Bioinformatik-Tools entwickelt. Wichtig ist, dass unser Protokoll die gleichzeitige Identifizierung sowohl endogenes microRNAs als auch exogen gelieferter Konstrukte ermöglicht, die microRNA-ähnliche Arten produzieren, während gleichzeitig Lesevorgänge, die auf andere kleine RNA-Arten, einschließlich ribosomaler RNAs ( ( rRNAs), übertragen RNA-abgeleitete kleine RNAs (tsRNAs), wiederholte kleine RNAs und mRNA-Abbauprodukte. Glücklicherweise sind microRNAs 5-phosphorylierte und 2-3 hydroxylierte⁴, eine Funktion, die genutzt werden kann, um sie von diesen anderen kleinen RNAs und mRNA Abbauprodukten zu trennen. Für das Klonen und Sequenzieren von microRNA gibt es mehrere kommerzielle Optionen, die oft schneller und einfacher zu multiplexen sind. Die proprietäre Natur von Kit-Reagenzien und deren häufige Modifikationen machen den Vergleich von Probenläufen jedoch schwierig. Unsere Strategie optimiert das Sammeln nur der richtigen Größe von microRNAs durch Acrylamid- und Agarose-Gel-Reinigungsschritte. In diesem Protokoll beschreiben wir auch ein Verfahren zum Ausrichten von Sequenzlesevorgängen an microRNAs mithilfe von Open-Source-Tools. Dieser Satz von Anweisungen wird besonders nützlich für Unerfahrene Informatik-Benutzer sein, unabhängig davon, ob unsere Bibliotheksvorbereitungsmethode oder eine kommerzielle Methode verwendet wird.

Dieses Protokoll wurde in mehreren veröffentlichten Studien verwendet. Zum Beispiel wurde es verwendet, um den Mechanismus zu identifizieren, durch den das Dicer-Enzym kleine Haarnadel-RNAs in einem Abstand von zwei Nukleotiden von der internen Schleife der Stammschleifenstruktur – der sogenannten “Schleifenzählregel”⁵– spaltet. Wir folgten auch diesen Methoden, um die relative Häufigkeit der gelieferten kleinen Haarnadel-RNAs (shRNA) zu identifizieren, die aus rekombinanten adenoassoziierten viralen Vektoren (rAAVs) exprimiert wurden, um den Schwellenwert der shRNA-Expression zu identifizieren, der vor der Leber toleriert werden kann. Toxizität im Zusammenhang mit überschüssiger shRNA-Expression⁶. Mit diesem Protokoll identifizierten wir auch microRNAs in der Leber, die auf das Fehlen von microRNA-122 – einer hochgradig exprimierenden leberischen microRNA – reagieren und gleichzeitig das Abbaumuster dieser microRNA⁷charakterisieren. Da wir unser Protokoll in zahlreichen Experimenten konsequent eingesetzt haben, konnten wir Probenpräparate längs beobachten und feststellen, dass es keine erkennbaren Chargeneffekte gibt.

Bei der Gemeinsamen Nutzung dieses Protokolls ist es unser Ziel, den Anwendern die Möglichkeit zu geben, eine qualitativ hochwertige, reproduzierbare Quantifizierung von microRNAs in praktisch jeder Gewebe- oder Zelllinie mit erschwinglichen Geräten und Reagenzien und kostenlosen Bioinformatik-Tools zu generieren.

Protocol

Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Washington genehmigt.

Kleine RNA-Bibliotheksvorbereitung

1. RNA-Isolation

1. Isolieren Sie RNA aus einer biologischen Quelle mit einem Standard-RNA-Isolationsreagenz oder einem Kit, das für microRNAs anreichert. Für Gewebe ist es am besten, mit Proben zu beginnen, die in flüssigem Stickstoff eingefroren und zu einem Pulver gemahlen werden, indem man einen vorgekühlten Mörtel und Stößel verwendet.
2. Messen Sie die RNA-Integrität jeder Probe auf einem Instrument, das RNA quantifizieren und eine RNA-Integritätsnummer (RIN) bereitstellen kann. RINs sollten >7 sein.

2. 3′ Adaptorligation

1. Bereiten Sie eine Ligationsreaktion in PCR-Streifenröhren vor, indem Sie: 11 l RNA (1-3 g, mit der gleichen Menge für jede Probe), 1,5 l 10x T4-RNA-Ligase-Reaktionspuffer, ATP-frei, 1 l Polyethylenglykol (PEG) und 0,5 l 3′-Linker (100 Ker).
   HINWEIS: Das Fehlen von ATP hilft bei der Anreicherung von miRNAs und minimiert das Klonen von mRNA-Abbauprodukten. PEG fungiert als molekulares Crowding-Agent und verbessert die erfolgreiche Ligation. Der Universal miRNA Klonlinker hat eine 3′ Blockiergruppe (Amin), um Selbstligation, Zirkularisierung und Ligation zur RNA am 5′ Ende zu verhindern.
2. Erhitzen Sie die Proben bei 95 °C auf einem Thermocycler für 30-40 s. Auf Eis für 1 min abkühlen. 1 L T4-RNA-Ligase 2 hinzufügen und bei Raumtemperatur 2 h inkubieren. Bereiten Sie das Gel (Schritt 2.3) vor, während die Proben inkubieren.
   HINWEIS: Die Inkubation bei Raumtemperatur verhindert linker-linker Ligation. Wir haben auch T4 RNA Ligase 1 erfolgreich eingesetzt.
3. 30 ml eines 15% Polyacrylamidgels mit 8 M Harnstoff (für ein 20×20 cm Gel): 14,4 g Harnstoff, 3 ml 10x Tris-gepufferte Ethylendiamintetraessigsäure (TBE), 11,2 ml 40% 19:1 Acrylamid und H_{2 O}bis 30 ml zubereiten. Die Lösung wird am besten bei 42 °C gelöst. Unmittelbar vor dem Gießen 150 l 10 % Ammoniumpersulfat (APS) und 30 l Tetramethylethylendiamin (TEMED) zur Polymerisation hinzufügen.
4. Zwischen 0,8 mm getrennte Glasplatten in einen Kunststoffguss gießen und Kamm einsetzen. Sobald das Gel erstarrt ist (ca. 20 min), 0,5x TBE in den Tank geben und Brunnen von Restharnstoff durch kräftiges Pipetieren waschen.
5. Führen Sie das Gel bei einer konstanten 375 V für 25 min ohne Proben vor, damit Harnstoff in das Gel gelangen kann, und waschen Sie dann die Brunnen wieder.
   HINWEIS: Die Spannungsmenge muss je nach Art der Stromversorgung und des verwendeten Elektrophoresesystems möglicherweise reduziert werden.
6. Sobald die Proben ligatieren, fügen Sie den Proben 15 l Acrylamid-Ladefarbstoff hinzu (für ein Verhältnis von 1:1), dann denaturieren Sie sie für 5 min bei 95 °C auf einem Thermocycler.
7. Bereiten Sie 25 ng/l mit 37 und 44 bp-Größenmarkern vor, die mit einem Teil Acrylamid-Ladefarbstoff verdünnt werden. Sequenzen sind in Tabelle 1aufgeführt.
8. Laden Sie die Proben auf das Polyacrylamid-Gel, so dass mindestens eine Spur zwischen den Proben bleibt. Laden Sie 20 L von mindestens zwei Sätzen von Markern in einem asymmetrischen Muster, um die Gelausrichtung nachzuverfolgen.
9. Führen Sie das Gel in den ersten 15 minuten konstant 375 V aus und erhöhen Sie es dann für den verbleibenden Lauf auf konstante 425 V. Laufen, bis Bromphenolblau ca. 1-4 cm von unten entfernt ist, was ca. 2 h dauert.
   HINWEIS: Bei Bedarf kann das Gel über einen längeren Zeitraum mit einer niedrigeren konstanten Spannung ausgeführt werden, bis das Bromphenolblau etwa 1-4 cm von unten entfernt ist.
10. Entfernen Sie das Gel von den Glasplatten mit einem Plattenabscheider, und legen Sie das Gel auf einen Kunststoff-Seitenschutz. Verdünnen Sie 5 l Ethidiumbromid in 500 l destilliertem Wasser und Pipette auf Markerspuren knapp über dem oberen hellblauen Marker (siehe Abbildung 1A).
    VORSICHT: Verwenden Sie Handschuhe für Ethidiumbromid und entsorgen Sie Abfälle gemäß den örtlichen Vorschriften. Lassen Sie für 5 min sitzen.
11. Schneiden Sie die Gele unter ultraviolettem (UV) Licht in jeder Spur mit sauberer Rasierklinge von der oberen zur unteren Markierung (siehe Abbildung 1A). Auf ein 4 x 4 cm großes Quadrat laborversiegelnder Folie übertragen, dann das Gel mit ca. 4 Schnitten horizontal und 3 vertikal schneiden, um 12 kleine Quadrate zu erzeugen (siehe Abbildung 1B).
12. Pipette 400 l von 0,3 M NaCl auf das Dichtfolienquadrat und Trichtergelstücke in 1,5 ml silikonisierte Rohre (siehe Abbildung 1C). Die Proben auf einem Nutator bei 4 °C über Nacht aufstellen.
    HINWEIS: Andere retentionsarme 1,5 ml Rohre können durch silikonisierte Rohre ersetzt werden.
13. Nach mindestens 12 h Rührung bei 4 °C die Proben abholen und auf Eis legen, zusammen mit einem konischen Rohr von 100% Ethanol.
14. Übertragen Sie 400 l Überstand in ein neues Rohr, und fügen Sie dann 1 ml 100% Ethanol und 1 l 15 mg/ml Glykokoprezipatmittel hinzu. Achten Sie darauf, so viel Überstand wie möglich zu sammeln, bei 4 °C nach unten zu drehen und bei Bedarf mehr zu pipetieren. Bei -80 °C für 1 h oder -20 °C für 2 h oder länger platzieren. Glykokoprezipitant verbessert die Sichtbarkeit und Erholung von Pellets.
15. Drehen Sie bei 4 °C bei 17.000 x g für 20-30 min. Entfernen Sie alle Spuren von Ethanol und lassen Sie Pelletluft für 5 min trocknen.

3. 5′ Linker ligation

1. Das Pellet durch Pipettieren in 6,5 l nukleasefreiem Wasser wieder aufhängen. Wenn man das Pellet zunächst für ein paar Minuten im Wasser sitzen lässt, hilft dies bei der Wiedersuspension.
2. Nach dem Abspinnen des Pellets und dem Wiederaufsetzen in Wasser, fügen Sie 0,5 l von 100 ‘M 5’-Linker (mit Barcodes; siehe Tabelle 1), 1 l T4-RNA-Ligasepuffer, 1 l von 10 mM ATP und 1 l PEG hinzu. Bei 90 °C 30 s erhitzen und dann auf Eis legen. Fügen Sie 1 L T4-RNA-Ligase 1 hinzu und lassen Sie sie bei Raumtemperatur für 2 h inkubieren.
3. Fügen Sie 400 l von 0,3 M NaCl hinzu, gefolgt von 400 l Saurphenol/Chloroform. Vortex 30 s – 1 min (Lösung sieht trüb aus), und dann bei 4 °C für 10-15 min bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge drehen (ca. 17.000 x g). Ziehen Sie die obere Schicht ab und legen Sie sie in ein neues 1,5 ml-Rohr.
   HINWEIS: Vermeiden Sie Pipettierung der unteren Schicht.
4. Fügen Sie 350 l Chloroform, Wirbel kurz, und drehen Sie dann bei 4 °C für 10 min bei maximaler Geschwindigkeit (ca. 17.000 x g). Ziehen Sie die Spitze später ab und platzieren Sie sie in einem neuen 1,5 ml Rohr. Fügen Sie 1,5 l Glykozipant und 1 ml 100% Ethanol hinzu.
   HINWEIS: Vermeiden Sie erneut das Pipettieren einer der unteren Schichten.
5. Kurz vortex, dann bei -80 °C für mindestens 1 h oder -20 °C über Nacht platzieren.

4. Umgekehrte Transkription (RT)

1. Schalten Sie den 42 °C-Wärmeblock ein. Drehen Sie die Proben bei 4 °C und 17.000 x g für 20-30 min. Entfernen Sie alle Überstand und lassen Sie die Pelletluft für 5 min trocknen.
2. Die Pelletprobe in 8,25 l nukleasefreiem Wasser wieder aufsetzen, dann hinzufügen: 0,5 l mit 100 ‘M RT-Primer (Tabelle 1) und 5 l 2x RT-Reaktionsmix aus einem cDNA-Synthese-Kit. Bei 42 °C für 3 min inkubieren.
3. Zu jeder Probe 1,5 l 10x RT-Enzym geben und bei 42 °C 30 min in einem Thermocycler inkubieren. Bei -20 °C platzieren oder mit Hydrolyse und Neutralisation fortfahren.
   HINWEIS: Für die Schritte 4.2 und 4.3 können mehrere RT-Kits verwendet werden.
4. Durchführung einer alkalischen Hydrolyse und Neutralisation: Machen Sie 1 ml 150 ml Kaliumhydroxid (KOH) Lösung (150 l von 1 M KOH, 20 lvon 1 M Tris Base pH 7,5 und 830 l H2 O) und 1 ml 150 mM Salzsäure (HCl) (150 l von 1 M HCl und 850 l LLL von H₂O).
5. Bestimmen Sie vor dem Hinzufügen zu den Proben die Menge an HCl, die zum Neutralisieren der KOH-Lösung erforderlich ist. In der Regel neutralisieren ca. 20-24 L HCl die 25 L KOH. Überprüfen Sie die Kombination auf einem pH-Streifen, um sicherzustellen, dass sie sich im richtigen Bereich befindet (pH 7,0 bis 9,5).
6. Hydrolysieren Sie die Proben, indem Sie 25 l von 150 mM KOH-Lösung hinzufügen und 10 min bei 95 °C inkubieren.
7. Neutralisieren Sie die Proben, indem Sie die in Schritt 4.4 ermittelte Menge von 150 mM HCl hinzufügen, um einen pH-Wert der endletzten Probe zwischen 7,0 und 9,5 zu erhalten.

5. PCR-Verstärkung

1. Nach der Neutralisation eine PCR-Reaktion vorbereiten mit: 29,5 l Wasser, 5 l 10x Taq-Puffer, 1 l dNTP, 2 l von 25 -M Vorwärtsprimer (Tabelle 1), 2 l von 25 -M-Reverse-Primer (Tabelle1), 0,5 l Taq und 10 l der umgekehrttranskribierten cDNA ab Schritt 4,6 .
2. Führen Sie die folgende PCR-Reaktion: 94 °C für 2 min, dann 20 Zyklen von 94 °C für 45 s, 50 °C für 75 s und 72 °C für 60 s.
3. Führen Sie eine zweite PCR-Reaktion von ca. 2-4 weiteren Zyklen mit 5 l Produkt ab Schritt 5.2 aus. Mischen Sie: 34,8 l Wasser, 5 l 10x Taq-Puffer, 1 l dNTP, 1 l von 25 -M Vorwärtsprimer (Tabelle1), 1 l von 25 -M Reverse Primer (Tabelle 1) und 0,2 l Taq-Polymerase. Befolgen Sie die gleichen Thermocycler-Parameter, die in Schritt 5.2 beschrieben sind.
   HINWEIS: Der Zweck von zwei PCR-Reaktionen – mit der ersten für 20 Zyklen und die zweite für nur 2-4 mehr – ist sicherzustellen, dass die Menge der cDNA verstärkt in einem dynamischen Bereich (d. h. nicht eine gesättigte Menge).

6. Agarose-Gel-Reinigung

1. Bereiten Sie ein 4% Agarose-Gel mit niedrigschmelzender Agarose vor. Laden Sie 40 l oder mehr des PCR-Produkts auf das Gel, zusammen mit dem Ladefarbstoff. Laden Sie 100 bp und 25 bp Größe Marker.
   HINWEIS: Die 25 bp Leiter hilft, verstärktes Produkt von Linker-Linker-Ligationsprodukten zu unterscheiden. Niedrigschmelzende Agarose-Gele müssen mit größerer Sorgfalt gegossen werden als herkömmliche Agarose-Gele, so genau folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
2. Wählen Sie für die Gelextraktion die Zyklusnummer aus, die auf dem Gel sichtbar, aber nicht gesättigt ist (normalerweise 22–24 Zyklen). Wählen Sie ähnliche Intensitätsbänder aus, wenn Sie mehrere Samples ausführen.
3. Schneiden Sie das Band, das über dem 125 bp-Band liegt (das dunklere Band auf 25 bp Leiter; siehe Abbildung 1D). Befolgen Sie mit einem Gel-Extraktionskit die Anweisungen des Herstellers, um Puffer auf Basis eines 4%-Gels hinzuzufügen, und schütteln Sie dann, um Agarose im Puffer bei Raumtemperatur aufzulösen.
   HINWEIS: Das Lösen bei 55 °C erhöht das Potenzial für Linker-Linker-Ligation.
4. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers zur Gelextraktion und leuchten Sie in 30 l Elutionspuffer oder Wasser. Wenn das Produkt schwach auf dem Gel aussah, dann reduzieren Sie die Elution auf 20 l.
5. Messen Sie die cDNA-Konzentration mit einer empfindlichen Technik, und bereiten Sie die Beispielbibliothek für die Sequenzierung vor. Die Vorbereitung hängt von der Art der verwendeten Sequenzierung ab.
   HINWEIS: Die Mindestanforderungen für eine Sequenzierungsbibliothek sind in der Regel ein Volumen von 10 L von 10 Mio. M. Wenn die Konzentrationen zu niedrig sind, fallen Pool- und Ethanolproben aus, um die Bibliothek auf die gewünschte Konzentration zu bringen.
6. Sequenzieren Sie die Proben mit verfügbaren Geräten. Ein gängiges Beispiel wäre, Samples mit einem Kit für 50 bp Einzellesevorgänge auszuführen, um etwa 15-25 Millionen Lesevorgänge in einem FASTQ-Ausgabeformat zu erhalten.

Kleine RNA-Sequenzausrichtung und Bioinformatik

7. Daten-Upload

1. Laden Sie FASTQ-Dateien herunter, die bei jedem Sequenzierungslauf generiert wurden. Laden Sie eine Liste von microRNA Haarnadelsequenzen von miRbase.org^8,9,10herunter.
2. Generieren Sie ein Galaxy-Konto auf www.usegalaxy.org und laden Sie eine FASTQ-Datei mit Sequenzlesevorgängen in dieses Konto hoch.
3. Laden Sie eine Textdatei mit Barcodesequenzen in das Galaxy-Konto hoch, z. B. barcodes.txt, das als Textdatei verfügbar ist (Ergänzende Tabelle 1).
4. Laden Sie eine FASTA-Datei mit microRNA-Haarnadeln aus einer Datenbank wie miRBase.org in das Galaxy-Konto hoch. Beispiele für Maus (mousehairpins.fa) oder menschliche (humanhairpins.fa) mikroRNA-Vorstufen sind in Der Ergänzenden Tabelle 2 und ergänzender Tabelle 3aufgeführt.

8. Adapterentfernung, Barcode-Sortierung und Trimmung

1. Navigieren Sie auf der linken Registerkarte zu Genomische Dateimanipulation > FASTA/FASTQ > Clipadaptersequenzen.
2. Geben Sie in der Eingabedatei im FASTA- oder FASTQ-Formatdie FASTQ-Datei aus der Dropdown-Liste ein. Ändern Sie die minimale Sequenzlänge auf 18. Ändern Sie Quelle in Benutzerdefinierte Sequenz eingeben. Geben Sie CTGTAGGCein. Behalten Sie alle anderen Standardparameter bei. Klicken Sie auf Ausführen.
   HINWEIS: Sequenzlesevorgänge, die kürzer als 18 Nukleotide sind, lassen sich nur schwer mikroRNAs zuordnen und enthalten viele Abbauprodukte.
3. Navigieren Sie auf der linken Registerkarte zu Genomische Dateimanipulation > FASTA/FASTQ > Barcode Splitter.
   HINWEIS: Galaxy-Funktionen und Header werden regelmäßig aktualisiert, sodass die Suchfunktion möglicherweise erforderlich ist, um ein gleichwertiges Werkzeug oder seinen Speicherort zu finden. Kommerzielle Kits mit indizierten Primern sind oft bereits nach Barcode sortiert. Daher sind dieser Schritt und der Barcode-Trimmschritt nicht notwendig, wenn sie von einem kommerziellen Kit aus beginnen.
4. Damit Barcodes verwendet werdenkönnen, zeigen Sie auf barcodes.txt. Damit die Bibliothek geteilt werdenkann, verwenden Sie Clip für die im vorherigen Schritt erstellte Datendatei. Geben Sie unter Anzahl der zulässigen Nichtübereinstimmungen 1ein. Klicken Sie auf Ausführen.
5. Trimmen Sie die ersten 4 Nukleotide: Navigieren Sie zu Textmanipulationen > Führende oder nachfolgende Zeichenschneiden . Klicken Sie für das Eingabe-Datasetauf das Ordnersymbol, bei dem es sich um eine Dataset-Sammlung handelt. Wählen Sie die Batchdatei von Beispielen aus, die das Label Barcode Splitter auf datenenthält. Geben Sie in Trim von Anfang bis zu dieser Position 5ein. In Ist Eingabe-Dataset im FASTQ-Format? Geben Sie Jaein. Klicken Sie auf Ausführen. Die Ausführung kann mehrere Minuten dauern.

9. Ausrichtung der Lesevorgänge an microRNAs

1. Navigieren Sie in Galaxy zur Genomikanalyse > RNA-Seq > Sailfish Transkriptquantifizierung¹¹.
2. Wählen Sie für die Frage Ein Referenztranskriptome aus Ihrer Historie aus oder verwenden Sie einen integrierten Index? Wählen Sie Eines aus der Historieverwenden aus. Geben Sie die hochgeladene Datei mousehairpins.fa aus der Dropdown-Liste ein. Klicken Sie in der FASTA/Q-Datei auf das Ordnersymbol, um eine Datasetsammlung zu verwenden, und wählen Sie die Datei aus, die Trim on collectionenthält. Klicken Sie auf Ausführen. Die Ausführung kann mehrere Minuten dauern.
3. Klicken Sie im Historischen Tab auf der rechten Seite auf Sailfish on collection… das ist eine Liste mit 19 Artikeln. Klicken Sie auf jede einzelne Datei und klicken Sie auf das Festplattensymbol, um es auf dem lokalen Computer zu speichern. Individuell heruntergeladene Dateien müssen zuerst dekomprimiert werden. Möglicherweise müssen sie auch mit einer .txt-Erweiterung zum Importieren in eine Kalkulationstabelle erneut gespeichert werden.
4. Öffnen Sie jede Tabellenkalkulationsdatei in, und benennen Sie die Spalte NumReads in die Behandlungsbedingung um. Führen Sie die Spalten zusammen, um eine Matrix von microRNAs in der ersten Spalte zu generieren, und lesen Sie die Anzahl pro Bedingung in nachfolgenden Spalten.
5. Um differenziell ausgedrückte microRNAs für jede Behandlungsbedingung zu berechnen, verwenden Sie die Datei mit rohen microRNA-Lesezahlen als Eingabe für Programme wie DESeq2¹². DESeq2 ist in Galaxy in der Registerkarte Genomikanalyse > RNA-seq > DESeq2 vorhanden.
6. Konvertieren Sie rohe Lesevorgänge in normalisierte microRNA-Lesezahlen. Die Zählungen werden durch die folgende Berechnung zur Bibliothekssequenztiefe der Bibliothek normalisiert: [(Rohlese-/Gesamt-MicroRNA-Lesungen) * (1.000.000 – Anzahl der gezählten microRNAs) + 1].
   HINWEIS: Diese Berechnung bietet einen normalisierten Lesewert pro Million (RPM) zugeordneter microRNAs, der über Datasets und biologische Bedingungen hinweg verglichen werden kann. Bei der Ausgabe handelt es sich um eine datei mit Durchlader. Sailfish stellt eine tpm-Ausgangsspalte bereit, obwohl dieser Wert durch die microRNA-Haarnadellänge normalisiert wird, was in diesem Zusammenhang nicht notwendig ist.
7. Wiederholen Sie ggf. die Ausrichtung mit benutzerdefinierten Eingabesequenzen (z. B. einem Vektor), um Lesevorgänge zu identifizieren, die diese Zuordnung bereitgestellten Konstrukten wie shRNAs zugeordnet werden.

Representative Results

Discussion

Trotz der Identifizierung von microRNAs vor über 20 Jahren¹³, bleibt der Prozess der microRNA-Sequenzierung mühsam und erfordert spezielle Ausrüstung, die Laboratorien daran hindert, routinemäßig interne Protokolle zu übernehmen¹⁴. Andere Techniken können microRNAs gleichzeitig bewerten, wie microRNA-Mikroarrays und Multiplexexpressionspanels; Diese Ansätze sind jedoch insofern begrenzt, als sie nur die in ihrem Prüfpunkt vorhandenen microRNAs quantifizieren. Aus diesem Grund vermissen sie wichtige Merkmale der kleinen RNA-Sequenzierung, wie die Identifizierung neuartiger microRNAs, und von microRNA-Isoformen – Nukleosid-Veränderungen, die wichtige biologische Funktion haben können^6,7,15 .

Wenn Sie ein neues Experiment starten, ist die Verwendung eines kommerziellen Anbieters oft am einfachsten, da sie technischen Support und benutzerfreundlichkeit bieten. Für die microRNA-Sequenzierung stehen mehrere kommerzielle Optionen zur Verfügung, die multiplexiert werden können, um die Arbeitslast bei der Verarbeitung großer Probenmengen (>100) zu reduzieren. Diese kommerziellen Kits werden ständig verbessert, was sowohl ein Vorteil als auch ein Nachteil ist. Einerseits haben die Unternehmen, die diese Kits herstellen, neuartige microRNA-Erfassungsmethoden entwickelt, zum Beispiel durch Zirkulierung ihrer 5 und 3 Enden vor der Sequenzierung oder durch die Verwendung degenerierter Linker mit zufälligen Sequenzen an jedem Ende, um Ligationsverzerrungen zu reduzieren. Sie haben auch Methoden entwickelt, um Adapterdimere zu entfernen, beispielsweise durch Ligantion von doppelsträngigen Adaptern oder Hybridisierung komplementärer Oligonukleotide. Auf der anderen Seite empfehlen kommerzielle Kits gegen Die Änderung oder Änderung eines Schritts. Daher, wenn irgendwelche Aktualisierungen an einem Kit vorgenommen werden, ist es schwierig oder unmöglich, Daten aus alten und neuen Versionen von Kits sowie Daten aus Kits von verschiedenen kommerziellen Anbietern zu vergleichen. Hier haben wir ein Protokoll beschrieben, das angesichts kommerzieller Alternativen durchhält. Unser Fokus auf Gelreinigungsschritte – während sie dem Protokoll Zeit geben – ermöglicht eine konsistente mikroRNA-Erfassung und Reproduzierbarkeit über die vielen Jahre, die wir verwendet haben. Es wurden mehrere Auswertungen der Reproduzierbarkeit zwischen kommerziellen Kits und internen Protokollen vorgenommen, und wir verweisen den Leser auf einige dieser Studien^16,17,18,19. Wichtig ist, dass die Schritte, die wir für die Bioinformatik-Analyse von microRNAs skizzieren, unabhängig von der Wahl des Kits oder des internen Protokolls eingesetzt werden können.

Die MicroRNA-Sequenzierung wird oft durch die Wahl der Barcodes gestört: In einigen Fällen ist die Ligationseffizienz der verschiedenen Barcodes möglicherweise nicht gleichwertig, was zu voreingenommenen Sequenzverteilungen in den Proben²⁰führt. Es wird nun empfohlen, degenerierte Basen am 5- und 3-Ende zu verwenden, um Ligationsverzerrungen bestimmter microRNAs^21,22zu minimieren. In diesem Protokoll haben wir diese Ligationsprobleme nicht beobachtet und konsistente Auslesungen für technische und biologische Repliken beobachtet, die mit verschiedenen Barcodes^5,6,7,23, aber es ist wichtig, sich ihrer bewusst zu sein. Zu den Methoden zur Vermeidung von Ligationsverzerrungen gehört die Einbeziehung von Indexprimern in die PCR-Primer oder das Hinzufügen eines oder mehrerer zufälliger RNA-Nukleoside am 3. Ende der 5-Adapter-Sequenz (Tabelle 1). Die Einführung einer oder mehreren synthetischen Spike-in-RNA, wie z. B. der C. elegans miR-39 microRNA²⁴, ist auch eine Option für Normalisierungszwecke, die für Situationen mit geringem Ertrag, wie die Quantifizierung von microRNAs aus Exosomen, von entscheidender Bedeutung ist. Ebenso haben wir für die RNA-Ligation erfolgreich T4-RNA-Ligase 1 verwendet, aber Ligation mit weniger Voreingenommenheit wurde für eine abgeschnittene Form von T4 RNA Ligase 2²⁵nachgewiesen. Schließlich sind Superscripts III und IV alternative Reverse-Transkriptionsenzyme, die wir ohne Probleme verwendet haben.

Die Wahl der microRNA-Datenbank kann auch die endgültigen normalisierten Ergebnisse beeinflussen. Eine Herausforderung bei der Kuratierung von microRNA-Datenbanken besteht darin, dass mehrere neuartige kleine RNAs, die als microRNAs aufgeführt sind, tatsächlich Fragmente von Wiederholungselementen und keine bona fide microRNAs²sind. Es wurden Anstrengungen unternommen, um microRNAs, die nicht den Standardkriterien entsprechen, zurückzuziehen, so dass die nächste Version einer microRNA-Datenbank verfeinert wird; Die nächste Iteration enthält jedoch auch neue Kandidaten, die bestätigt werden müssen. Wenn wiederholte microRNAs in Ausrichtungen einbezogen werden, können sie die Ergebnisse verzerren und Daten aus vorhandenen microRNAs überfordern. Daher ist die Verwendung gut kuratierter Datensätze von microRNAs aus verschiedenen Arten wesentlich^26,27. Wir haben die größte Reproduzierbarkeit erfahren, wenn wir kleine RNA-Sequenzierungslesevorgänge auf kuratierte Listen konservierter microRNAs ausrichten und diese Haarnadeln in Zusatztabelle 2 und Zusatztabelle 3aufgenommen haben. Diese Listen entsprechen Schätzungen von etwa 500 hochkonfidenzstarken microRNAs im menschlichen Genom^2,26.

Wie bei jeder Technik sollten die Ergebnisse mit einem orthogonalen Ansatz bestätigt werden. Wir haben erfolgreich kleine RNA-Sequenzierungsergebnisse mit kleinen RNA-Nordbloten reproduziert, die radioaktiv markierte Sonden enthalten, um die Größe und relative Häufigkeit von Kandidaten-MicroRNAs^6,7,23zu bestätigen. Quantitative PCR von microRNAs mit Split-Read-Sequenzierung und Bestätigung von Ziel-mRNA-Änderungen mit qPCR und Western Blotting sind weitere Optionen für die Validierung.

Zusammenfassend haben wir eine Methode zur Isolierung und Sequenzung von microRNAs und zur Durchführung von Achsenangleichungen an vorhandenen microRNA-Datenbanken bereitgestellt. Die Erschwinglichkeit der Reagenzien und Geräte und der Einsatz von Open-Source-Tools für die Analyse sollten dieses Protokoll für jedermann zugänglich machen. Schließlich kann dieses Protokoll in jedem Gewebe oder jeder Zelllinie verwendet werden, um hoch reproduzierbare, hochwertige Lesevorgänge zu liefern.

Materials

100 bp DNA ladder	NEB	N3231
19:1 bis-acrylamide	Millipore Sigma	A9926
25 bp DNA step ladder	Promega	G4511
Acid phenol/chloroform	ThermoFisher	AM9720
Acrylamide RNA loading dye	ThermoFisher	R0641
Ammonium persulfate (APS)	Biorad	161-0700
Bioanalyzer instrument	Agilent	G2991AA	For assessing RNA quality and concentration
Chloroform	Fisher Scientific	C298-500
Ethanol (100%)	Sigma	E7023
Gel Loading Buffer II	ThermoFisher	AM8547
GlycoBlue	ThermoFisher	AM9516	Blue color helps in visualizing pellet
HCl	Sigma	320331
KOH	Sigma	P5958
Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm	Genesee	45-109
miRVana microRNA isolation kit	ThermoFisher	AM1560
miSeq system	Illumina	SY-410-1003	For generating small RNA sequencing data
NaCl	Fisher Scientific	S271-500
Nusieve low-melting agarose	Lonza	50081
Parafilm (laboratory sealing film)	Millipore Sigma	P7793
Poly-ethylene glycol 8000	NEB	included with M0204
ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit	NEB	E6560S
QIAquick Gel Extraction kit	Qiagen	28704
Qubit Fluorometer	ThermoFisher	Q33226	For quantifying DNA concentration
Qubit RNA HS Assay kit	ThermoFisher	Q32855
Razor Blades	Fisher Scientific	12640
Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes	Fisher Scientific	02-681-331
T4 RNA ligase 1	NEB	M0204
T4 RNA Ligase 2, truncated K227Q	NEB	M0351S
TapeStation	Agilent	G2939BA	For assessing RNA quality and concentration
Taq DNA Polymerase	NEB	M0273X
TEMED	Biorad	161-0800
Tris Base pH 7.5	Sigma	10708976001
Tris-buffered EDTA	Sigma	T9285
Trizol	ThermoFisher	15596026
UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml)	Invitrogen	15585-011
Universal miRNA cloning linker	NEB	S1315S
Urea	Sigma	U5378