Dieser Artikel stellt einen nützlichen In-vitro-Assay dar, um die Fähigkeit des konditionierten Mediums aus Tumorzellen zu bewerten, Makrophagen anzuziehen.
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Methodenartikel
In Vitro-Assay zur Untersuchung der Tumor-Makrophage-Interaktion
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Tumorassoziierte Makrophagen (TAMs) machen einen großen Prozentsatz der Zellen in der Tumormasse für verschiedene Krebsarten aus. Glioblastom (GBM), ein bösartiger Hirntumor ohne Heilung, hat bis zu die Hälfte der Tumormasse TAMs. TAMs können pro-tumoral oder anti-tumoral sein, abhängig von der Aktivierung bestimmter Gene in den Zellen. Genetische Mutationen in den Tumoren können durch die Regulierung der Zytokinexpression die Rekrutierung von TAMs in die Tumormikroumgebung beeinflussen. Hier beschreiben wir einen quantitativen zellbasierten Assay zur Beurteilung der Makrophagenrekrutierung durch das konditionierte Medium aus den Tumorzellen. Dieser Test verwendet die menschliche Makrophagen-Zelllinie MV-4-11, um die Makrophagen-Anziehung durch das konditionierte Medium aus dem Glioblastom zu untersuchen, was eine hohe Reproduzierbarkeit und geringe Variabilität ermöglicht. Die mit diesem Test generierten Daten können zu einem besseren Verständnis der Wechselwirkung zwischen dem Tumor und der Tumormikroumgebung beitragen. Ähnliche Assay kann verwendet werden, um Interaktion zwischen den Tumorzellen und anderen Immunzellen zu bewerten, einschließlich T-Zellen und natürliche Killerzellen (NK) Zellen.
Einleitung
Makrophagen sind Immunzellen mit hoher phäkotypischer und funktioneller Heterogenität1. Sie spielen eine wichtige Rolle in den Wirtsabwehrsystemen, Gewebereparatur, Entwicklung und Tumorprogression1. TAMs sind Makrophagen in der Mikroumgebung von soliden Tumoren. Bestimmte TAMs können das Tumorwachstum fördern, indem sie t zellvermittelte zytotoxische Aktivität hemmen, die Tumormikroumgebung (TME) modulieren, Angiogenese, Invasion und Metastasierung fördern2,3,4, 5. TAMs gehören zu den häufigst....
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Protokoll
1. Mittlere Vorbereitung
-
Vorbereitung des serumfreien Stammzellmediums
- Die 50x B27-Ergänzung, den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF, 20 g/ml in 10 mM Essigsäure mit 0,1% BSA) und den Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF, 20 g/ml in 10 mM Essigsäure mit 0,1% BSA) auftauen.
- Fügen Sie 500 l EGF (Endkonzentration 20 ng/ml), 500 l FGF (Endkonzentration 20 ng/ml), 10 ml 50x B27 bis 500 ml Dulbeccos modifizierte Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) und 5 ml mit 100x Penicillin/Streptomycin (Penrep/Strep). Invertieren Sie die Flasche 4-6 mal zu mischen, Filter sterilisieren durch eine 500 ml 0,1 m Filtrationsbecher. Die Fl....
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Ergebnisse
Die Ergebnisse werden in der Regel über Balkendiagramme angezeigt (Beispiel in Abbildung 1). Stichproben mit hohen 480/520-Werten deuten darauf hin, dass die konditionierten Medien eine hohe Kapazität zur Rekrutierung von Makrophagen haben. Je nach experimentellem Bedarf können zusätzliche Kontrollen einbezogen werden. Zum Beispiel kann man neutralisierende Antikörper verwenden, um die konditionierten Medien zu behandeln, um die Makrophagen-Chemotaxis abzusch.......
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Diskussion
In diesem Protokoll gibt es mehrere wichtige Schritte: 1) Auswahl der Transwell-Einfügung. Für die Zelllinie MV-4-11 funktionieren 5 m Transwell-Einsätze gut. Bei anderen Zelllinien, wie z. B. der häufig verwendeten Monozytenzelllinie THP-1, kann jedoch eine andere Porengröße besser funktionieren. 2) Da verschiedene Zelllinien mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten wachsen, ist es wichtig, die Lautstärke der konditionierten Medien an die Zellenzahlen anzupassen. Dazu können zellfreie Medien, die unter den gleichen exper.......
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Offenlegungen
William A. Weiss ist Mitbegründer von StemSynergy Therapeutics. Zhenyi An hat nichts zu verraten.
Danksagungen
Grant Support: Z. An received support from Alex es Lemonade Stand Foundation, American Brain Tumor Association, NIH T32CA108462 and Program for Breakthrough Biomedical Research, which is partially funded by the Sandler Foundation. W. Weiss wurde durch NIH-Stipendien R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103 unterstützt; Die Samuel G. Waxman Cancer Research Foundation; und den Stuhl Evelyn und Mattie Anderson.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,1 μ m Filterbecher | Thermo fisher | 566-0010 | |
| 0,45 μ m Filtereinheit | Millipore | SLHA033SS | |
| 10 mL serologische Pipetten | Olympus Kunststoffe | 12-104 | |
| 15 ml sterile Zentrifugenröhrchen | Olympus Kunststoffe | 28-103 | |
| 1 ml Pipettenspitze | ART molekulare Bioprodukte | 2779-RI | |
| 2 ml Aspirierpipette | Falcon | 357558 | |
| 24-Well-Platte | Millipore | ECM507 | Teil von ECM507, oder kann separat erworben werden |
| 4x Lysepuffer | Millipore | ECM507 | Teil von ECM507, oder kann separat erworben werden |
| 5 μ m Transwell-Einsatz | Millipore | ECM507 | Teil von ECM507, oder kann separat erworben werden |
| 75 cm2 | Kolben Corning | 430641U | |
| Accutase | Innovative Zelltechnologien | AT-104 | |
| B27 | Gibco | 12587-010 | |
| CyQuant Dye | Millipore | ECM507 | Teil von ECM507, oder kann separat erworben werden |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 10565-018 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| FGF | Peprotech | 100-18B | |
| IMDM | Gibco | 12440-053 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Kugelschreiber | Strep Gibco | 15140-122 | |
| Trypanblau | Biorad | 1450021 |
Referenzen
- Liu, Y., Cao, X. The origin and function of tumor-associated macrophages. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 1-4 (2015).
- Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Front....
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Nachdrucke und Genehmigungen
