Summary
Protokol, genetik olmayan kusurlu transkripsiyon uzaması için in vitro murine karsinom modelini ayrıntılarıyla anlatır. Burada, CDK9 kronik inhibisyonu taklit etmek ve klinik olarak aşırı TEkesinlikle fenomen çalışma pro-inflamatuar yanıt genleri boyunca RNA Pol II üretken uzama bastırmak için kullanılır, tüm kanser türlerinin yaklaşık% 20 mevcut.
Abstract
Daha önce kanserlerin bir alt kümesi mRNA transkripsiyon uzaması (TE) yaygın eksiklikleri ile küresel transkripsiyonel deregülasyon ile tanımlanır bildirdik-biz TEkesinliklegibi kanserler diyoruz . Özellikle, TEkesinlikle kanserler, interferon/JAK/STAT ve TNF/NF-κB yolları gibi genlerin büyük bir kümesinde sahte transkripsiyon ve hatalı mRNA işleme ile karakterizedir ve bunların bastırılmasına yol açar. Renal hücreli karsinom ve metastatik melanom hastalarında tümörlerin TEkesinlikle alt tipi immünoterapide kötü yanıt ve sonuç ile anlamlı olarakilişkilidir. TEkesinlikle kanserleri araştırmanın önemi göz önüne alındığında-immünoterapikarşı önemli bir barikat portends gibi-Bu protokolün amacı bu yaygın, genetik olmayan çalışma için bir in vitro TEkesinlikle fare modeli kurmaktır kanserlerde transkripsiyonel anormallikler ve yeni anlayışlar kazanmak, mevcut ilaçlar için yeni kullanımlar, ya da bu tür kanserlere karşı yeni stratejiler bulmak. RNA polimeraz II'nin (RNA Pol II) C-terminal tekrar etki alanında (CTD) serin2 kalıntısının fosforilasyonunun giderilmesi için kronik flavopiridol aracılı CDK9 inhibisyonunun kullanımını ayrıntılarıyla anlatıyoruz ve RNA Pol II'nin verimli transkripsiyona salınımını baskılıyoruz. Uzama. TEkanserlerinin spesifik somatik mutasyonlar altında sınıflandırılmadığı göz önüne alındığında, farmakolojik bir model avantajlıdır ve en iyi şekilde gözlenen yaygın transkripsiyonel ve epigenetik kusurları taklit eder. Flavopiridol'un optimize edilmiş bir sublethal dozu kullanımı, transkripsiyon uzaması ve mRNA işleme kusurlarında genetik olmayan yaygın bozulmanın genelleştirilebilir bir modelini oluşturmada, klinik olarak gözlenen TE'yi yakından taklit eden tek etkili stratejidir. kesinlikle özellikleri. Bu nedenle, TE bu modelkesinlikle incelemek için kaldıraçlı olabilir, bağışıklık aracılı hücre saldırısına karşı onları sağlayan hücre özerk faktörler.
Introduction
Hemen hemen tüm aktif genlerin ekspresyonunda önemli bir hız sınırlayıcı adım RNA polimeraz II (RNA Pol II) organizatörün proksimal verimli uzama1,2duraklama geçiştir. Transkripsiyonel uzamanın epigenetik disregülasyonununTEolarak tanımlanan birden fazla insan malignitesinin ilerlemesine yardımcı olduğu göz önüne alındığında, kötü yanıt alabilen pro-inflamatuar yanıt yollarında suboptimal sinyalizasyona yol açar ve immünoterapisonucu 3, Bu protokolün kapsamlı amacı kanserlerde bu yaygın olmayan genetik transkripsiyonel anormallikleri incelemek için yararlı bir in vitro model kurmaktır. Bu ışıkta, CDK9'un kronik farmakolojik inhibisyonu transkripsiyon uzaması ve mRNA işleme kusurlarında genetik olmayan yaygın bozulmanın genelleştirilebilir bir modelini oluşturmak için etkili bir stratejidir. Kronik CDK9 inhibisyonu kullanmanın ardındaki mantık, RNA Pol II'nin C-terminal tekrar etki alanında (CTD) serin2 kalıntısının fosforilasyonunu ortadan kaldırarak RNA Pol II'nin verimli transkripsiyon uzaması için bastırılmasıdır. Ayrıca, TEkesinlikle kanserler, bizim grup tarafından daha önce açıklanan3,herhangi bir özel somatik mutasyon altında sınıflandırılır değildir. Bu nedenle, genetik olmayan (farmakolojik) bir model avantajlıdır ve en iyi onlarda gözlenen yaygın transkripsiyonel ve epigenetik kusurları taklit eder. Buradaki yöntem, minüri kanseri hücrelerinin kronik flavopiridol tedavi modelinin oluşumunu ve karakterizasyonunu ayrıntılarıyla anlatmaktadır. Bu yöntem, daha uzun genomik uzunluklarla karakterize genler boyunca transkripsiyon uzaması, tnf/NF-κB ve interferon/STAT sinyalizasyonu gibi indükleyici ifadeler ile transkripsiyon uzama3,4,5. Genel olarak, transkripsiyonel uzama kusurları bu optimize edilmiş murine hücre hattı modeli-bilgimizin yeni açıklanan TEkesinlikle tümörler ilim için tek model-anti-tümör bağışıklık atağına direnç sürücüler, yararlanmak için yararlı bir sistem render ve bağışıklık aracılı hücre atağına karşı kanserlerde çekirdek transkripsiyon makinelerinde genetik olmayan kusurların güvenlik açıklarını inceleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Cincinnati Çocuk Araştırma Vakfı Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi ve Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi tüm hayvan deneysel prosedürlerini (IACUC protokolü #2017-0061 ve IBC protokolü #IBC2016-0016) onayladı ve bunlar deneyler, NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nda açıklandığı gibi standartlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. RNA Pol II'nin flavopiridol tedavisi ile kronik inhibisyonu—temel strateji
- Tohum B16/F10 fare melanom hücreleri düşük yoğunluklu (0.2 x 106) kendi karşılık orta (Dulbecco's Modifiye Kartal Orta [DMEM], 10% fetal sığır serum [FBS], 1% penisilin ve streptomisin [Pen /Strep]) ve inkümet bir gecede 10 cm kültür plakası 37 °C,% 5 CO2 nemli inkübatör.
- Ertesi gün, hücreleri 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve rna Pol II uzama faktörü p-TEFb (siklin T/CDK9) bir inhibitörü olan flavopiridol'un öldürücü dozu (25 nM olarak tahmin edilir) ile yeni bir kültür ortamı grubu ekleyin. alt-culturing.
- Flavopiridol tedavisi bir hafta sonra, TEkesinlikle kanserlerde görülen transkripsiyonel uzama kusurları çeşitli özelliklerini özetlemek için modelyeteneğini değerlendirmek için doğrulayıcı tahliller gerçekleştirin.
2. Oluşturulan fare TEkesinlikle modelinde kusurlu RNA Pol II fonksiyonu ve interferon (IFN) yolu ve tümör nekroz faktörü (TNF) yol sinyalinin bozulmasını değerlendirmek için doğrulayıcı immünoblot tsay
- Kültür eşit sayıda (105) flvopiridol tedavi B16/F10 fare melanom hücreleri ve ebeveyn B16/F10 fare melanom hücreleri 12 kuyu plakaları iki farklı setleri (RNA Pol II fonksiyonel karakterizasyonu için bir set ve sitokin için diğer set stimülasyon) 37 °C'de %5 CO2 nemli bir inkübatör gecede.
- Ertesi gün, sitokin stimülasyon setindeki hücreleri fare IFN-γ, IFN-α (5 ng/mL) veya TNF-α (5 ng/mL) ile 37 °C'de 45 dakika boyunca tedavi edin.
- Şimdi, hem sitokin hem de RNA Pol II fonksiyonel karakterizasyonundaki hücrelerden protein özü tonu aşağıdaki şekilde radioimmunoenanaliz (RIPA) lysis tamponu kullanarak kümelenir:
- Hücreleri 1x PBS ile yıkayın ve kuyu başına 50 μL lysis tampon ile lyse. Kazıyın ve sonra 4 °C, 21.130 x glysed hücreleri pelet .
- Deterjan çözünmesi (Bradford veya benzer bir test) sonrasında protein konsantrasyonu için standart bir kolorimetrik test kullanarak hücre lysate supernatants protein ölçün.
- Her numuneden %4−−%18 sodyum dodecyl sülfat (SDS) poliakrilamid jeli ile çalışmak için eşit miktarda ölçülen protein (15 μg) yükleyin ve bunları poliviniliden diflorür (PVDF) membranlara aktarın.
- PVDF membranlarını tris-tamponlu tuzlu tuzlu−polisorbat 20 (TBST) içinde %5 kuru sütte bloke edin ve ardından 4 °C'de primer antikorlarla bir gecede kuluçka (RNA Pol II 1:1000; p-SER2 RNA Pol II 1:1000; p-SER5 RNA Pol II 1:1000; p-SER5 RNA Pol II 1:1000; p-SER5 RNA Pol II 1:1000; p-SER5 RNA Pol II 1:1000; p-SER5 RNA Pol II 1:1000; H3K36me3 01:2000; toplam H3 01:2000; STAT1 1:1000; p-STAT1 1:1000; NFκB 1:1000; p-NFκB 1:1000; β-Actin 1:5000) %5 büyükbaş serum albumin.
- Ertesi gün, PVDF membranları oda sıcaklığında 15 dakika (RT) için 1x TBST ile yıkayın ve uygun ikincil antikorlarla (RNA Pol II, p-SER2 RNA Pol II ve p-SER5 RNA Pol II; anti-tavşan (1:5000) h3K36me3 için, toplam H3, STAT1, p-STAT1, NFκB ve p-NFκB) rt 50 dakika. Gelişmiş kemilüminesans ile ticari olarak kullanılabilir horseradish peroksidaz (HRP) substrat kullanarak protein sinyalleri tespit.
NOT: β-Actin birincil kullanılan HRP konjuge, bu nedenle ikincil olmadan geliştirilebilir.
3. Oluşturulan fare TEkesinlikle modelinde mRNA işleme kusurlarını değerlendirmek için doğrulayıcı bir titre
- Tohum eşit sayıda (0.2 x 106) flavopiridol tedavi B16/F10 fare melanom hücreleri ve ebeveyn B16/F10 fare melanom hücreleri 6-iyi plakalar 37 °C bir% 5 CO2 nemli inkübatör gecede.
- Bir RNA ekstraksiyon reaktifi veya kiti(Malzeme Tablosu)kullanarak % 60 birleşme yle kültürlü hücrelerden toplam RNA ayıklayın.
- RRNA'yı toplam çıkarılan RNA'dan aşağıdaki şekilde tüketin:
NOT: Düşük girişli bir protokol, rRNA'yı tüketmek için ticari olarak kullanılabilen bir kitten ortaklaşa kullanılmıştır- Bir su banyosu veya ısı bloğunu 70−75 °C'ye, 37 °C'de başka bir su banyosu veya ısı bloğu ayarlayın.
- 1 μL seçici rRNA tükenme probu ve mikrosantrifüj tüpünde 30 μL hibridizasyon tamponu ile toplam RNA'yı (100−500 ng in 2 μL nükleaziçermeyen su) ekleyin, girdap ile hafifçe karıştırın ve 5 dk için 70−75 °C'de inküleyin.
- Şimdi, tüpleri 37 °C'lik bir su banyosu/ısı bloğuna aktarın ve numunenin 30 dakika boyunca 37 °C'ye soğumasını bekleyin.
- Selektif rRNA tükenme probu manyetik boncukları girdap ile yeniden askıya alın ve aliquot 75 μL boncuk1,5 mL RNase içermeyen mikrosantrifüj tüp.
- Boncuk süspansiyonu 1 dk. Yavaşça aspire ve supernatant atın. 75 μL nükleaz içermeyen su ekleyerek ve manyetik ayırma sonrasında süpernatant atarak boncukları bir kez daha yıkamatekrarlayın.
- Yıkanmış boncukları 75 μL hibritleştirme tamponunda yeniden askıya alın ve 25°L'ini başka bir tüpe yerleştirin ve daha sonra kullanmak üzere 37 °C'de saklayın.
- Kalan 50°L boncukları 1 dk boyunca manyetik ayırıcıya yerleştirin ve süpernatantı atın. 20 μL hibritleştirme tamponundaki boncukları yeniden askıya alın ve daha sonra kullanmak üzere 37 °C'de saklayın.
- RNA/selektif rRNA tükenme probu karışımının 30 dakika boyunca 37 °C'ye soğutulmasından sonra, numuneyi tüpün dibine kadar toplamak için tüpü kısaca santrifüj edin.
- RNA/selektif rRNA tükenme probu karışımının 33 μL'lik kısmını 3.3.7 adımdan hazırlanan manyetik boncuklara aktarın. Düşük hızlı girdap ile karıştırın.
- Tüpü 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka sırasında, yavaşça zaman içeriğini karıştırın. Tüpün altına örnek toplamak için kısa santrifüj izledi.
- Tüpü rRNA-sonda kompleksini peletlemek için 1 dakika boyunca manyetik bir ayırıcıya yerleştirin. Bu kez supernatant atmayın. Supernatant rRNA-tükenmiş RNA içerir.
- Adım 3.3.6'dan 25 μL'lik boncuk tüpünü 1 dk. Aspire için manyetik bir ayırıcıya yerleştirin ve süpernatantı atın. Ad 3.3.11'den yeni boncuk tüpüne supernatant ekleyin. Düşük hızlı girdap ile karıştırın.
- Tüpü 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka sırasında, yavaşça zaman içeriğini karıştırın. Kısaca tüpün altına örnek toplamak için tüp santrifüj.
- Tüpü rRNA-sonda kompleksini peletlemek için 1 dakika boyunca manyetik bir ayırıcıya yerleştirin. Supernatant atmayın. RRNA'da tükenmiş RNA içeren süpernatantı (yaklaşık 53°L) yeni bir tüpe aktarın.
- RNA veriminin konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile ölçün.
- Aşağıdaki şekilde poliA+ RNA ayıklamak için oligo (dT)25 içeren manyetik boncuklar için giriş olarak rRNA tükenmiş örneklerin yarısını kullanın:
NOT: Manyetik boncukyüzeyine bağlı oligo dT dizileri kullanarak polyA kuyruk haberci RNA izole bu protokol ticari olarak kullanılabilir kiti(Tablo Malzemeler)co-opted edilmiştir.- Şişedeki oligo dT boncuklarını kısaca >30 s için girdap layarak yeniden askıya alın ve 200 μL oligo dT boncuklarını bir tüpe aktarın. Aynı birimde (200 μL) bağlama arabelleği ekleyin ve yeniden askıya alın.
- 1 dakika için bir mıknatıs tüp yerleştirin ve supernatant atın. Şimdi, mıknatıstan tüpü çıkarın ve yıkanmış oligo dT boncukları 100 μL bağlayıcı tamponda yeniden askıya alın.
- RRNA tarafından tükenmiş toplam RNA numunesinin hacmini 10 mM Tris-HCl pH 7,5 ile 100°L'ye ayarlayın. Şimdi, 100 μL bağlayıcı arabellek ekleyin.
- Isı 65 °C için 2 dakika ikincil RNA yapıları bozmak için. Şimdi, hemen buzun üzerine yerleştirin.
- Toplam 200 μL'lik RNA'yı 100°L yıkanmış boncuklara ekleyin. Iyice karıştırın ve RT 5 dakika boyunca bir rotor üzerinde sürekli dönerek bağlama izin verin.
- 1-2 dakika için mıknatıs üzerine tüp yerleştirin ve dikkatle tüm supernatant çıkarın ve dikkatle tüm supernatant çıkarın.
- Tüpü mıknatıstan çıkarın ve 200 μL Yıkama Tamponu ekleyin.
- Çıkarılan poliA+ RNA'nın saflığını ve konsantrasyonu bir spektrofotometre ile ölçün.
NOT: 1.90−2.00 260/280 oranı ve tüm RNA örnekleri için 2.00−2.20 260/230 oranı kabul edilebilir kabul edilir. - Bölüm 3.3'ten alınan rRNA tükenmiş örneklerin kalan yarısını protein A sütunlarına (RNA immünopresimünoenaz [RIP] kitinde sağlanan, Malzeme Tablosundasağlanan) monoklonal 7-methylguanozin kullanarak beş asal kapaklı RNA'ları immünopprepitite etmek için kullanın aşağıdaki şekilde antikor:
NOT: Ticari olarak kullanılabilen RNA immünoentri kiti kullanılarak m7G kapaklı haberci RNA'yı izole etme protokolü birlikte kullanılmıştır ve daha da değiştirilmiştir.- Proteini yıkayın Antioriyi boncuklara önceden bağlamak için üreticiprotokolüne göre RIP kitinden elde edilen manyetik boncuklar.
- Kitinden 100 μL yıkama tamponu askıda bir mikrocentrifuge tüp boncuklar için 7-metilguanozin antikor (tavşan IgG sağlanan kiti sağlanan tavşan IgG) 3 μg aktarın.
- RT. Centrifuge tüpleri kısa bir süre için 30 dakika düşük hız rotasyonu ile kuluçka ve sonra bir manyetik ayırıcı tüpler yerleştirin, kaldırmak ve supernatant atın.
- Tüpleri çıkarın ve kısa bir süre için kit ve girdaptan 500 μL yıkama tamponu ekleyin. Tüpleri kısa bir süre sonra manyetik ayırmayı bir kez daha merkeze, süpernatantı çıkarın ve atın.
- Adım 3.6.4'u bir kez daha tekrarlayın.
- Önceden yıkanmış 7-metilguanozin antikor bağlı boncuklar için (bölüm 3.3) tükenmiş rRNA yaklaşık 120 ng ekleyin. 1 μL RNase inhibitörü ekleyin. HAFIF ajitasyon ile 1−1.5 saat boyunca RT'de kuluçka.
- 10 s için 300 x g boncuk aşağı spin ve yeni bir mikrosantrifüj tüp kapaksız (non-7-metilguanozin) mRNA içeren supernatant kaldırın.
- 100 μL yıkama tamponu ekleyin ve benzer şekilde iki kez daha yıkayın. Havuz toplanan supernatant aynı mikrosantrifüj tüp uncapped etiketli (non-7-metilguanozin) mRNA. Buzda saklayın.
- 7 M üre lysis tampon (ULB) içeren 300 μL üre lysis tampon (ULB) ile boncuklardan kapaklı (7-metilguanozin) mRNA, %2 SDS, 0,35 M NaCl, 10 mM EDTA ve 10 mM Tris, pH 7.5 boncukları 65 °C'de 2−3 dk ısıtarak emdirin.
- 300 μL'lik eluted numuneleri (kapaklı ve kapaksız mRNA) 300 μL fenol:chloroform:isoamyl alkol (25:24:1; ticari olarak mevcuttur) (4 °C'de saklanır) karıştırın. Ters çevirerek iyice karıştırın ve yaklaşık 10 dakika bekletin sonra yavaşça tekrar karıştırın.
- 2 dk için 18.928 x g santrifüj ve dikkatle taze tüp üst tabaka pipet ve alt tabaka atın.
- Örneklere 300 μL fenol ekleyin:kloroform:isoamyl alkol (25:24:1; 4 °C'de depolanır). 1 dk. Dikkatli, yeni bir tüp için üst tabaka pipet ve alt tabaka atın 18.928 x g de ters ve sonra santrifüj tarafından iyice karıştırın.
- Kapaklı ve kapaksız RNA'ya 300 μL 2-porpanol ve 30 μL 3 M sodyum asetat (pH 5.2) ekleyin. Numuneyi birkaç kez ters çevirin ve -20 °C'ye 20 saat ekadar koyun.
- Şimdi, 4 °C'de 10 dk için 18.928 x g'de numuneleri santrifüj edin. Supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve %70 etanol 500 μL ekleyin.
- 4 °C'de 10 dk için 18.928 x g tekrar santrifüj. Supernatant'ı dikkatlice atın ve rt'deki peleti 5 dakikadan az bir süre kurulayın.
- RNA veriminin saflığını ve konsantrasyonu bir spektrofotometre ile ölçün. 260/280 oranı 1.90−2.00 aralığında, 260/230 oranı ise tüm RNA numuneleri için 2.00−2.20 aralığında olmalıdır.
4. FasL aracılı hücre ölümüne fare TEkesinlikle model in yanıtını değerlendirmek için doğrulayıcı bir tofme
- Tohum eşit sayıda (30.000 hücre) flavopiridol tedavi B16/F10 fare melanom hücreleri ve ebeveyn B16/F10 fare melanom hücreleri kendi ilgili ortamda 96-iyi kültür plaka (DMEM) ve kuluçka gecede 37 °C, 5% CO2 nemli Inkübatör.
- Hücreleri farklı konsantrasyonlarda honun6FasL (0.1−1000 ng/mL) ile tedavi 10 g/mL anti-His antikor ve inkübat24 saat için 37 °C, 5% CO2 nemli inkübatör.
- 1x PBS arabellek ile yıkayarak ölü hücreleri çıkarın. RT 20 dakika için% 4 paraformaldehit bağlı hücreleri düzeltin.
- Musluk suyundaki tabakları hafifçe durulayarak fazla lekeyi çıkarın. RT'de tabakları kurutun.
- 1x PBS'de çözünmüş 1x nonionic yüzey aktif antonun 100 μL'lik kristal menekşesini yeniden çözündürün ve mikroplaka okuyucuda 570 nm'de emiciliği ölçerek hücre yoğunluğunu ölçün.
5. Araştırmacı tsay fare TEkesinlikle model antijen spesifik sitotoksik T-hücre atamı yanıtını değerlendirmek için
- OT-I CD8+ sitotoksik T-hücre atasının (CTL) izolasyonu ve aktivasyonu
- CD8+ hücrelerini FARE CD8 T hücre izolasyon kiti kullanarak manyetik hücre ayırma ile OT-I TCR Tg RAG-1−/− farelerin dalaklarından arındırın:
- Tam RPMI ortamlarında iki OT-I TCR Tg RAG-1−/− fareden iki dalak hasat edin.
- 20 mL RPMI dolu 50 mL'lik bir tüpte tutulan 70 m'lik filtredeki dalakları püre haline getirin ve filtrede sadece yağ kalana kadar şırınganın arkasını kullanarak.
- 4 °C'de 5 dk için 220 x g'de akışı santrifüj edin. Supernatant atın.
- Bir önceki santrifüj adımından dalak peletine 1 mL kırmızı kan hücresi (RBC) lysis tamponu ekleyin ve 1 dk boyunca karışımı pipetlendirin.
- 10 mL'ye kadar RPMI ekleyerek çözeltiyi nötralize edin.
- Santrifüj 220 x g'de 5 dk 4 °C'de. Supernatant atın ve RPMI 10 mL yeniden askıya.
- Saymak için küçük bir aliquot alın. Kalan santrifüj 220 x g'de 5 dk 4 °C'de.
- Sayılan her milyon hücre için, ticari olarak kullanılabilir manyetik ayırma sistemi arabelleği (Mojo arabelleği veya benzer bir arabellek) 1 mL pelet resuspend.
- Adım 5.1.1.8'de her 1 mL peletli hücre için hacim 100 μL'lik bir antikor kokteyli hazırlayın. Antikor kokteyl içerir: biotin anti-CD4, CD105, CD45R/B220, CD11c, CD49b, TER-119, CD19, CD11b, TCR γ / δ, ve CD44.
- 1 mL peletli hücrelere bu kokteyl ekleyin ve 15 dakika buz üzerinde tutun.
- 1 mL yeniden askıda peletli dalak hücrelerine eklenen antikor kokteylinin her 100 μL'sine 100°L manyetik (streptavidin) boncuk ekleyin. 15 dakika buzüzerinde tutun.
- 7 mL ticari olarak kullanılabilir manyetik ayırma sistemi tampon ekleyin. Şimdi, taze bir tüp karışımı yaklaşık 3−4 mL aliquot. Iyice karıştırın ve 5 dakika boyunca mıknatıs için düzeltin.
- Sıvıyı buz üzerinde taze bir tüpe dekant (CD8+ hücreleri içerir). Şimdi, kalan 3−4 mL karışımı adım 5.1.1.12'den tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca mıknatısa sabitle. Sıvıyı (izole edilmiş CD8+ hücrelerinin ikinci partisi) buzda tutulan ilk CD8+ hücresini içeren aynı tüpe yerleştirin.
- Tohum mühendislik yapışık fibroblast APC-(MEC. B7' ye. SigOVA) belirli bir ovalbumin ifade hattı (OVA)-türetilmiş, H-2Kb-sınırlı peptid epitop ova257-264 (SIINFEKL), co-uyarıcı molekül B7.1 ile birlikte, 75.000 hücreleri iyi başına 24-iyi plakalar, 37 ° C, 5% CO2 nemlendirilmiş inkuvtor.
NOT: Kullanılan yapışık fibroblast, Dr. Edith Janssen'in CCHMC'deki laboratuvarından bir hediyedir. Çizgi aslında Dr Stephen P. Schoenberger's lab La Jolla Enstitüsü Alerji ve İmmünoloji6için oluşturuldu. - 24 saat sonra, Hepes tampon, sodyum pirüuvat, L-glutamin ve yüksek glikoz ile ticari olarak kullanılabilir Iscove modifiye Dulbecco's orta (IMDM) ile Bir kez APC monolayer yıkayın ve 0.5 x 106 saf OT-I CD8 + hücreleri ekleyin (adım 5.1.1.13) IMDM 2 mL 50 mM β-ME, 2 mL EDTA, 4 mM L-glutamin ve HEPES ve %10 FBS ile desteklenir.
- 20 saat sonra, yapışmaz OT-I hücrelerini yavaşça hasat edin (yüzen OT-I hücreleri ile kültür çanağının içinde ortam toplayarak ve hücreleri 191 x g'de 2 dk için peletleyerek; uygun OT-I hücrelerini sayarak) ve ortak kültür için aktarın.
- CD8+ hücrelerini FARE CD8 T hücre izolasyon kiti kullanarak manyetik hücre ayırma ile OT-I TCR Tg RAG-1−/− farelerin dalaklarından arındırın:
- Cd8+ hücrelerinin B16/F10-OVA hücreleri ile ortak kültürü
- B16/F10 (antijen ovalbumin eksikliği), işlenmemiş B16/F10-OVA ve B16/F10-OVA hücreleri ile ortak kültürde 1:1 (her biri 300.000 hücre) oranında 1:1 (her biri 300.000 hücre) oranında tohum OT-I-türetilmiş CD8+ hücreleri ve B16/F10-OVA hücreleri 1 hafta boyunca flavopiridol (25 nM) ile ön işlemden geçirilmiştir, tam DMEM ile 6 iyi yemeklerde %5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde 37 °C'de 20 saat boyunca ortam.
- 20 saat sonra, OT-I-türetilmiş CD8+ hücrelerini çıkarın (yüzen OT-I türetilmiş CD8+ hücreleriyle kültür çanağının içinde ortam toplayarak). Yapışık B16/F10-OVA hücrelerini 1x PBS'de yıkayın.
- Ekli B16/F10-OVA hücrelerinin üç grubu 5 dk. Pesin içeren %0,05 EDTA'da 191 x g'de tripsinli hücreleri 5 dk.
- Hasat edilen B16/F10-OVA hücrelerini soğuk PBS'de (%0,5 FBS ve %0,05 sodyum azit içeren) canlılık boyası ve ilgili etiketli antikorlarla (düzeltilebilir canlılık boya e780, AF647 konjuge fare CD8 ve BV421 konjuge fare CD45 ile) kuluçkaya yatırarak lekeleyin ).
- B16/F10-OVA hücrelerinin üç grubuncanlılığını akış sitometrisi ile analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, 25 nM'de flavopiridol ile kronik sub-lethal(Şekil 2)tedavisi ile elde edilen bir TEkesinlikle hücre modeli oluşturmak için ayrıntılı bir şema(Şekil 1)salıyoruz. Şekil3'te, flavopiridol ile tedavinin 3 gününde, B16 OVA hücreleriKESINLIKLE TE'nin kısmi özelliklerini gösterir, ancak bir haftalık tedaviden sonra, B16/F10 OVA hücreleri RNA Pol II'nin CTD'sinde derin bir fosforilasyon kaybı gösterir. H3K36me3 önemli bir azalma ile-bir histone değişiklik ekson sınırları ve run-away şifreli transkripsiyonların bir inhibitörü tanımlanmasında karıştığı. Sonuç olarak, TEkesinlikle hücre modeli, yanlış kapaklı ve poli-adenatedilmiş olmayan mRNA'ların(Şekil 4A,B)açıkça artmış oranlarıyla kritik mRNA işleme kusurlarını gösterir. Ayrıca Şekil 5 ve Şekil 6'daanahtar inflamatuar yanıt yolu genlerinin ve FasL aracılı hücre ölüm yolunun spesifik baskısı görülmektedir. STAT1 ve NFκB'nin interferona (IFN-α, IFNγ) ve TNF-α uyarılmış fosforilasyonuna karşı uygulanan direnç ve ölüm reseptörü ligand FasL tarafından hücre ölümüne karşı dirençkesinlikle TE'ye karşı bir immün hücre atasının sitotoksisitesini önemli ölçüde azaltır. Tümör. Bu doğrulayıcı teknikler transkripsiyon uzaması etkisinin kronik perturbasyonunun uyarıcıya duyarlı genler üzerinde geniş bir yelpazede ki etkisini ve belirli bir fare hücresi hattı modelinde böyle bir tedirginliğin yeterli olup olmadığını test etmek için tasarlanmıştır. inflamatuar yanıt sinyalgenlerinde fonksiyonel mRNA'nın akut azlığı,TE'nin temel özeneklerini taklit ederek klinik olarak kanserler. Flavopiridol tedavisi çalışmamıza dayanarak, RNA Pol II CTD'nin ikinci serink kalıntısı (pSER2) fosforilasyonun bastırılması kritik öneme sahip olup transkripsiyon uzaması işareteder. Herhangi bir fare karsinom hücre hattı için bir sublethal doz büyüme ve hücre hattının canlılık hızı üzerinde önemsiz bir etkiye sahip ek olarak pSER2 düzeylerinde bir azalma elde etmelidir. 25 nM flavopiridol tedavilerinde pSER2 ve H3K36me3 düzeylerinde sürekli bir azalma görmemize rağmen, hem pSTAT1 hem de pNFκB düzeylerinin (sırasıyla IFN-α, IFNγ ve TNF-α stimülasyonunda) baskıyı garanti etmez. Her fare karsinom hücre hattı benzersizdir (belirli bir süre içinde farklı laboratuvarlarda yetiştirilen B16/F10 OVA veya CT26 hücreleri biraz değişmiş etkilere sahip olabilir) ve flavopiridol'un baskılayıcı etkilerini kısmen kurtaran JAK1 veya CCNT1'e sahip olabilirler. inflamatuar yanıt yolu genleri. Bu gibi durumlarda, flavopiridol aracılı etkilerin zamansallığını ve JAK1 veya CCNT1 ile kurtarılmasını anlamak için pSTAT1 ve pNFκB düzeylerinin kinetiklerinin farklı zaman noktalarında (5−70 dk) kontrol edilmesi gerekebilir. Buna göre, JAK1 ve/veya CCNT1'in bu modeli oluşturmak için yıkılması gerekebilir.
Flavopiridol modeli kurulduktan ve yukarıda belirtilen tahliller kullanılarak karakterize edildikten sonra, TEhücre modelinin sitotoksik T-hücre (CTL) saldırısına karşı direnç sağlayıp sağlamadığını test etmek için keşif niteliğinde bir tahlil salıyoruz. Optimize edilmiş protokolümüze dayanarak, flavopiridol, OVA geninin (B16 OVA) aktive CD8+ CTL'leri (OVA257-264 epitopuna özgü) ile birlikte inkübe edilen B16/F10 hücrelerini (Dr.'den bir hediye) seçici toksisiteye sahip olarak tedavi etti. Stephen P. Schoenberger'in laboratuvarı6) OT-I CTL aracılı tümör lysis duyarlı değildi. B16/F10 OVA hücreleri (flavopiridol ile önceden tedavi edilmez) bu sistemde büyük hücre ölümü geçirmiş, B16/F10 ebeveyn hücreleri ise OVA antijenini ifade etmedikleri için hayatta kalmıştır (Şekil 7). Bu önerilen araştırmacı titresonucu kronik flavopiridol indüklenen TEkesinlikle in vivo bile anti-tümör bağışıklık atağı kaçmak için bir araç ihsan olabilir açıktır. Bu daha fazla in vivo tümör modellerinde invivo tümör modellerinde innate ve adaptif anti-tümör bağışıklık yanıtları kaçmak için TEkesinlikle modellerin eğilimini kontrol etmek için test edilebilir. Anti-asialo tedaviler tümör taşıyan farelerde vivo NK hücrelerinin aktivitesini düzenlemek için kullanılabilir. Ayrıca, immün kontrol noktası tedavisi (anti-CTLA4 ve anti-PD1) TEkesinlikle tümör taşıyan fareler uygulanabilir.
Bütünlük içinde, TEkesinlikle önerilen araştırmacı tahlil birlikte diğer tümör-immün test koşulları bir bütün ev sahibi bu TEkesinlikle hücre modeli birleştiren yarar göstermektedir doğrulayıcı tahliller. Bu model tümör hücrelerinde kusurlu transkripsiyonel uzaması ve bağışıklık hücresi etkileşimlerine verdikleri yanıttan kaynaklanan moleküler ayrıntıları ayrıştırmaya yardımcı olabilir.
Şekil 1: İş akışının şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kronik olarak düşük doz flavopiridol ile tedavi edilen B16 OVA hücrelerinin hücre büyüme özellikleri: Tedavi sonrası belirtilen günlerde kontrol ve flavopiridol ile tedavi edilen hücrelerin Canlılık (canlılık reaktifi ile ölçülür). Bu rakam Modur ve ark.3'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: RNA Pol II ve histon profilini değerlendirmek için doğrulayıcı bir tama: B16 OVA hücrelerinde 72 saat veya 1 hafta boyunca flavopiridol ile tedavi edilen histon ve RNA Pol II işaretlerinin immünolekeleri. Bu rakam Modur ve ark.3'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: mRNA işleminde ciddi kusurları değerlendirmek için doğrulayıcı bir titreşme. 5′-kapaksız 5'-kapaklı (A)ve 3′-non-poliadenylated 3′-poliadenylated (B) mRNA konsantrasyonları rRNA konsantrasyonları belirtilen hücre hatlarında tükenmesi sonra oranları. Hata çubukları, üç teknik çoğaltmaya dayalı standart sapmayı temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Sitokin stimülasyon profilini değerlendirmek için doğrulayıcı bir titreşme. STAT1, pSTAT1, NFκB ve p NFκB immünolekeleri kontrol edilir ve flavopiridol önceden tedavi edilen B16 OVA hücreleri IFN-α, IFNγ veya TNF-α ile 30 dk (5 ng/mL) uyarılabilir. Bu rakam Modur ve ark.3'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Fasl aracılı hücre ölümüne karşı direnci değerlendirmek için doğrulayıcı bir titreşme in vitro. Kontrol ve flavopiridol önceden tedavi B16 OVA hücreleri FasL ile tedavi 24 saat okuma canlılık tsay ile ölçülen. Bu rakam Modur ve ark.3'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Tekesinlikle antijen sınırlı sitotoksik T hücre aracılı saldırı in vitro direnç değerlendirmek için keşif titre. Sol: keşif titreci diyagramşeması. Sağ: OT-I farelerin dalaklarından izole edilmiş cd8 + CTLs (1:1 oran) ile birlikte yetiştirilen B16/F10-OVA hücrelerinin göreceli canlılığı. P: Welch iki örnekt-test. Bu rakam Modur ve ark.3'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNA Pol II uzama kontrolü malign hücrelerin yararına uyarıcı duyarlı gen ekspresyonunu düzenleyen belirleyici bir kol olarak ortaya çıkmıştır5,7,8. Uzama ve müteakip mRNA üretimi için organizatör-proksimal duraklama üstesinden P-TEFb9,10,11kinaz aktivitesi gerektirir. Modelimiz, tekesinlikle kanserlerde Pol II uzaması sırasında gözlenen kusurları taklit etmek için, temel siklin bağımlı kizaz CDK9 inhibitörü olan flavopiridol (25 nM) kullanır— grubumuz tarafından keşfedilen kanserlerde daha önce bilinmeyen bir fenotip daha önce3.
CDK9 kinaaz aktivitesi uzun Pol II büyük alt biriminin CTD serin2 kalıntıfosforilasyon için gerekli olduğu bilinmektedir. Eleştirel olarak, B16/F10 OVA'da CDK9'un (1 hafta için 25 nM) kronik inhibisyonu ile flavopiridol tedavisini optimize etmeyi başardık, CTD fosforilasyonunun inhibe edilmesine ek olarak, 1 hafta boyunca 25 nM flavopiridol tedavisi uygun transkripsiyonel post-transkripsiyonel önler beklenmeyen bir şekilde mRNA değişiklikleri ve etkili pro-inflamatuar yanıt sinyal genleri gibi uzun genler boyunca p-TEFb bağımlı üretken uzama abrogates, önemli ölçüde hem de mRNA ve ifade kalıplarını değiştirerek protein düzeyleri. Bilgimiz dahilinde, literatürde aynı başarıyı etkin bir şekilde başaran başka bir model yoktur.
Bu kolay kurmak, TE genelleştirilebilir modelikesinlikle incelemek için kaldıraçlı olabilir, tekesinlikle kanserbağışıklık aracılı hücre saldırısına uyum sağlayan hem transkripsiyonel hem de epigenetik değişiklikler. Ayrıca, bu murine modeli kesinlikleTEkorur -toplam ve fosfo gibi azalma- RNA Pol II düzeyleri 21 gün in vivo büyüme tahlili flavopiridol serbest sonra3 (burada protokolde belirtilmeyen), bu istikrar ölçüde düşündüren in vivo deney için genetik olmayan bir model. Ancak, diğer minnet hatları için flavopiridol tam sublethal dozu optimize etmek için dikkatli alınmalıdır (örneğin, yaklaşık 20 nM flavopiridol tedavisi 1 hafta için MC38 murine karsinom hattı için sublethal doz; bu protokolde kullanılmaz), hücre varyasyonunun etkisi kaplama yoğunluğu, kültür koşulları ve sitokin stimülasyon koşulları farklı rürçizgileriçin değişebilir. Burada açıklanan protokol, kronik CDK9 inhibisyonu ilekesinlikle-benzeri özellikler te üretimi için kritik olduğu bilinen değişkenleri en aza indirmek için temel bir çerçeve sağlar. Buna ek olarak, T47D ve CAL51 gibi insan karsinom hücre hatları, benzer TEkesinlikleortaya çıkan kısa vadeli (3 gün) flavopiridol tedavileri ile test edilmiştir -RNA Pol II profilleri gibi, flavopiridol tabanlı kronik inhibisyon yararlılığını gösteren CDK9 aracılı transkripsiyon uzama bile model insan hatları tekesinlikleçalışmak için oluşturma .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen NCI (CA193549) ve CCHMC Araştırma İnovasyon Pilot ödülleri tarafından Kakajan Komurov ve Savunma Bakanlığı (BC150484) ödülü Navneet Singh tarafından desteklendi. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Kanser Enstitüsü veya Savunma Bakanlığı'nın resmi görüşlerini temsil etmez. Fon layıcıların çalışmanın tasarımı, veri toplama ve analizi, yayımlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hhis6FasL | Cell Signaling | 5452 | |
| 10X TBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| 12 well plates | Falcon | 353043 | |
| 20% methanol | Fisher Chemical | A412-4 | |
| 24-well plates | Falcon | 351147 | |
| 4–18% SDS polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561086 | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 5% dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| 7-Methylguanosine antibody | BioVision | 6655-30T | |
| 96-well plates | Cellstar | 655180 | |
| AF647-conjugated mouse CD8 | Biolegend | 100727 | |
| antibiotic and antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| anti-His antibody | Cell Signaling | 2366 P | |
| Anti-Rabit | Cell Signaling | 7074 | Dilution 1:5000 |
| Anti-Rat | Cell Signaling | 7077S | Dilution 1:5000 |
| Bradford assay Kit | Bio-Rad | 5000121 | |
| BSA | ACROS Organics | 24040-0100 | |
| BV421-conjugated mouse CD45 | Biolegend | 109831 | |
| crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Dynabeads Oligo (dT)25 | Ambion | 61002 | |
| FBS | Gibco | 45015 | |
| Fixable Live/Dead staining dye e780 | eBioscience | 65-0865-14 | |
| Flavopiridol | Selleckchem | S1230 | |
| H3k36me3 | Abcam | ab9050 | Dilution 1:2000 |
| IFN-α | R&D systems | 12100-1 | |
| IFN-γ | R&D systems | 485-MI-100 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | |
| NF-κB | Cell Signaling | 8242s | Dilution 1:1000 |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| p-NF-κB | Cell Signaling | 3033s | Dilution 1:1000 |
| p-Ser2-RNAPII | Active Motif | 61083 | Dilution 1:500 |
| p-Ser5-RNAPII | Active Motif | 61085 | Dilution 1:1000 |
| p-STAT1 | Cell Signaling | 7649s | Dilution 1:1000 |
| RiboMinu Eukaryote Kit | Ambion | A10837-08 | |
| RIPA buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | |
| RNAPII | Active Motif | 61667 | Dilution 1:1000 |
| STAT1 | Cell Signaling | 9175s | Dilution 1:1000 |
| TNF-α | R&D systems | 410-MT-010 | |
| total H3 | Cell Signaling | 4499 | Dilution 1:2000 |
| Tri reagent | Sigma | T9424 | |
| Triton | Sigma | T8787-50ML | |
| Tween 20 | AA Hoefer | 9005-64-5 | |
| β-Actin | Cell Signaling | 12620S | Dilution 1:5000 |
| β-ME | G Biosciences | BC98 |
References
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews Genetics. 13 (10), (2012).
- Margaritis, T., Holstege, F. C. Poised RNA polymerase II gives pause for thought. Cell. 133 (4), 581-584 (2008).
- Modur, V., et al. Defective transcription elongation in a subset of cancers confers immunotherapy resistance. Nature Communications. 9 (1), 4410 (2018).
- Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-145 (2009).
- Adelman, K., et al. Immediate mediators of the inflammatory response are poised for gene activation through RNA polymerase II stalling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (43), 18207-18212 (2009).
- van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. Naïve CTLs Require a Single Brief Period of Antigenic Stimulation for Clonal Expansion and Differentiation. Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).
- Gilchrist, D. A., et al. Regulating the regulators: the pervasive effects of Pol II pausing on stimulus-responsive gene networks. Genes & Development. 26 (9), 933-944 (2012).
- Danko, C. G., et al. Signaling pathways differentially affect RNA polymerase II initiation, pausing, and elongation rate in cells. Molecular Cell. 50 (2), 212-222 (2013).
- Nechaev, S., Adelman, K. Pol II waiting in the starting gates: Regulating the transition from transcription initiation into productive elongation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms. 1809 (1), 34-45 (2011).
- Zhou, M., et al. Tat modifies the activity of CDK9 to phosphorylate serine 5 of the RNA polymerase II carboxyl-terminal domain during human immunodeficiency virus type 1 transcription. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5077-5086 (2000).
- Palancade, B., Bensaude, O. Investigating RNA polymerase II carboxyl‐terminal domain (CTD) phosphorylation. European Journal of Biochemistry. 270 (19), 3859-3870 (2003).
