Methodenartikel

Visualisierung der Oberflächen-T-Zell-Rezeptordynamik vierdimensional mit Lattice Light-Sheet-Mikroskopie

DOI:

10.3791/59914

⸱

30. Januar 2020

 , 
1Committee on Cancer Biology, The University of Chicago, 2Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie die Lattice Light-Sheet-Mikroskopie verwendet wird, um die Dynamik von Oberflächenrezeptoren in lebenden Zellen vierdimensional zu visualisieren. Hier werden T-Zellrezeptoren auf CD4+ primären T-Zellen gezeigt.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Signalisierung und Funktion einer Zelle wird durch die dynamischen Strukturen und Wechselwirkungen ihrer Oberflächenrezeptoren diktiert. Um die Struktur-Funktions-Beziehung dieser Rezeptoren vor Ort wirklich zu verstehen, müssen wir sie auf der Oberfläche der lebenden Zelle mit genügend raumzeitlicher Auflösung visualisieren und verfolgen. Hier zeigen wir, wie sie die kürzlich entwickelte Lattice Light-Sheet-Mikroskopie (LLSM) verwenden, um T-Zellrezeptoren (TCRs) vierdimensional (4D, Raum und Zeit) an der lebenden Zellmembran abzubilden. T-Zellen sind eine der Haupteffektorzellen des adaptiven Immunsystems, und hier haben wir T-Zellen als Beispiel verwendet, um zu zeigen, dass die Signalisierung und Funktion dieser Zellen durch die Dynamik und Wechselwirkungen der TCRs angetriebenwerden. LLSM ermöglicht 4D-Bildgebung mit beispielloser Raumzeitauflösung. Diese Mikroskopietechnik kann daher in der Biologie allgemein auf eine Vielzahl von Oberflächen- oder intrazellulären Molekülen verschiedener Zellen angewendet werden.

Einleitung

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Die genaue Dynamik des Molekülhandels und der Streuung auf der dreidimensionalen Zelloberfläche in Echtzeit war ein Rätsel, das es zu lösen gilt. Mikroskopie war schon immer ein Gleichgewicht zwischen Geschwindigkeit, Empfindlichkeit und Auflösung; Wenn ein oder zwei Maximierungen, wird die dritte minimiert. Aufgrund der geringen Größe und der immensen Geschwindigkeit, mit der sich Oberflächenrezeptoren bewegen, ist die Verfolgung ihrer Dynamik eine große technologische Herausforderung für den Bereich der Zellbiologie geblieben. Zum Beispiel wurden viele Studien mit der totalen inneren Reflexionsfluoreszenz (TIRF) Mikroskopie1,2,3durchgeführt, die eine hohe zeitliche Auflösung hat, aber nur ein sehr dünnes Stück der T-Zell-Membran (ca. 100 nm) abbilden kann und daher Ereignisse vermisst, die weiter entfernt in der Zelle geschehen. Diese TIRF-Bilder zeigen auch nur einen zweidimensionalen Abschnitt der Zelle. Im Gegensatz dazu können superhochauflösende Techniken wie die stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM)4, die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM)5und die stimulierte Emissionserschöpfungsmikroskopie (STED)6die Abbe-Beugungsgrenze des Lichts überwinden. Diese Techniken haben eine hohe räumliche Auflösung (20 nm Auflösung)4,5,6,7, aber sie dauern oft viele Minuten, um ein vollständiges zweidimensionales (2D) oder dreidimensionales (3D) Bild zu erhalten, und daher geht die zeitliche Auflösung verloren. Darüber hinaus können Techniken wie STORM und PALM, die auf blinkenden Signalen basieren, Ungenauigkeiten bei der Zählungvon 8,9haben. Elektronenmikroskopie hat bei weitem die höchste Auflösung (bis 50 pm Auflösung)10; es kann sogar dreidimensional mit fokussierter Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie (FIB-SEM) durchgeführt werden, was zu bis zu 3 nm XY und 500 nm Z Auflösung11führt. Jede Form der Elektronenmikroskopie erfordert jedoch eine harte Probenvorbereitung und kann nur mit festen Zellen oder Geweben durchgeführt werden, wodurch die Möglichkeit einer Bildgebung von Lebendenproben im Laufe der Zeit ausgeschlossen wird.

Techniken zur Erzielung der hohen raumzeitlichen Auflösung, die erforderlich ist, um die Dynamik von Oberflächen- und intrazellulären Molekülen in lebenden Zellen in ihrer wahren physiologischen 3D-Natur zu identifizieren, werden erst vor kurzem entwickelt. Eine dieser Techniken ist Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12, die eine strukturierte Lichtplatte verwendet, um photobleaching drastisch zu senken. Entwickelt im Jahr 2014 von Nobelpreisträger Eric Betzig, die hohe axiale Auflösung, geringe Photobleaching und Hintergrundgeräusche, und die Fähigkeit, gleichzeitig Hunderte von Ebenen pro Sichtfeld bilden LLS Mikroskope überlegen Widefield, TIRF und konfokale Mikroskope12,13,14,15,16,17,18,19. Diese vierdimensionale (x, y, z und zeit) Bildgebungstechnik, die zwar noch beugungsbegrenzt ist (200 nm XYZ-Auflösung), hat eine unglaubliche zeitliche Auflösung (wir haben eine Bildrate von etwa 100 fps erreicht, was zu einem 3D-rekonstruierten Zellbild mit 0,85 Sekunden pro Frame führt) für die 3D-Raumerfassung.

LLSM kann im Allgemeinen verwendet werden, um die Echtzeitdynamik von Molekülen innerhalb einer Zelle auf Einzelmolekül- und Einzelzellebene zu verfolgen, insbesondere in stark motilen Zellen wie Immunzellen. Zum Beispiel zeigen wir hier, wie man LLSM verwendet, um die T-Zell-Rezeptor-Dynamik (TCR) zu visualisieren. T-Zellen sind die Effektorzellen des adaptiven Immunsystems. TCRs sind verantwortlich für die Erkennung von Peptid-MHC (pMHC) Liganden, die auf der Oberfläche von antigenpräsentierenden Zellen (APC) angezeigt werden, die die Auswahl, Entwicklung, Differenzierung, Dasschicksal und Funktion einer T-Zelle bestimmen. Diese Erkennung tritt an der Schnittstelle zwischen T-Zellen und APCs auf, was zu lokalisierten Rezeptorclustern führt, um die so genannte immunologische Synapse zu bilden. Während bekannt ist, dass TCRs an der immunologischen Synapse für die T-Zell-Effektorfunktion unerlässlich sind, sind noch unbekannt die zugrunde liegenden Mechanismen des Echtzeit-TCR-Handels zur Synapse. LLSM hat es uns ermöglicht, die Dynamik von TCRs vor und nach dem Handel mit der resultierenden pMHC-TCR-Interaktion in Echtzeit zu visualisieren (Abbildung 1). LLSM kann daher verwendet werden, um aktuelle Fragen der prägenden Dynamik von TCRs zu lösen und Erkenntnisse zu liefern, um zu verstehen, wie eine Zelle zwischen selbst- und fremder Antigene unterscheidet.

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Protokoll

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5C. C7 TCR-transgene RAG2 Knockout-Mäuse in B10. Ein Hintergrund wurde in dieser Studie gemäß einem Protokoll verwendet, das vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Chicago genehmigt wurde.

1. Ernte und Aktivierung von T-Zellen

HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls basiert auf früheren Protokollen. Siehe Zitate für weitere Details20,21.

  1. Euthanisieren Sie ein 10-12 Wochen altes 5C. C7 transgene Maus beiderlei Geschlechts (20-25 g) nach dem zugelassenen IACUC-Protokoll (d. h.CO2-Kammer gefolgt von zervikaler Dislokation).
  2. Mauskarkasse gründlich mit 70% Ethanol besprühen, um das Fell einzuweichen und in einen BSL-2 Sicherheitsschrank zu bringen.
  3. Drehen Sie die Maus auf die rechte Seite und machen Sie einen kleinen Schnitt in der Körperhöhle mit chirurgischer Schere. Entfernen Sie die Milz mit chirurgischen Zangen. Mit einer chirurgischen Schere das Bindegewebe nach Bedarf abschneiden.
  4. Legen Sie die Milz in ein 70-m-Pore-Mesh-Zellsieb und zerkleinern Sie mit der Rückseite eines 1 ml Spritzenkolbens. Waschen Sie das Sieb gründlich mit komplettem RPMI (RPMI mit 10% fetalem Rinderserum [FBS], 2 mM L-Glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin, 50 m 2-Mercaptoethanol).
  5. Zentrifugieren Sie die einzellige Suspension von Splenozyten bei 300 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand.
    HINWEIS: Das Pellet an dieser Stelle wird rot sein.
  6. Setzen Sie die Splenozyten in 5 ml RBC-Lysepuffer aus. 5 min inkubieren, dann mit 5 ml komplettem RPMI löschen.
  7. Zentrifugieren Sie die einzellige Suspension von Splenozyten bei 300 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand.
    HINWEIS: Das Pellet sollte an dieser Stelle weiß und nicht rot sein.
  8. Setzen Sie das Pellet in 5 ml vollständigem RPMI wieder aus.
  9. In einen T-25-Kolben übertragen und 10 M Mottencytochrom-C (MCC, Sequenz ANERADLIAYLKQATK) hinzufügen. Legen Sie die Zellen in einen Zellkultur-Inkubator bei 37 °C, 5%CO2 über Nacht.
  10. Am nächsten Tag, fügen Sie rekombinante Maus IL-2 zu einer endgültigen Konzentration von 100 U/ml.
  11. Beobachten Sie für die folgenden Tage, fügen Sie frische Medien hinzu, wenn die aktuellen Medien gelb werden. T-Zellen sterben ab, wenn sie in gelben Medien über 48 h unbeaufsichtigt bleiben. Zellen sind bereit, 6-10 Tage nach der Ernte zu verwenden.

2. Vorbereiten von Zellen

  1. 5 mm runde Deckelscheiben mit 0,1% Poly-L-Lysin für 10 min inkubieren. Absaugen und natürlich trocknen lassen.
  2. Verwenden Sie ein Dichtegradientenreagenz (siehe Materialtabelle), um abgestorbene Zellen zu trennen und 1 x 106 T-Zellen und 1 x 106 APCs (CH27-Zellen21,22 mit zytosolischem mCherry) separat zu erhalten.
    HINWEIS: Zellen werden mit einem Hämozytometer gezählt.
    1. Fügen Sie 3 ml Dichtegradientenreagenz zu einem 15 ml konischen Rohr hinzu und fügen Sie Zellen tropfenweise an den Rand des Rohres hinzu. Nicht mischen. Zentrifuge bei 930 x g für 10 min bei 4 °C; Beschleunigung/Verzögerung verwenden: SLOW/SLOW. Entfernen Sie die dünne mittlere Zellschicht zwischen dem gesamten Medium und dem Dichtegradientenreagenz sorgfältig, indem Sie jeden Zelltyp in separate konische Röhren setzen.
      HINWEIS: Es ist notwendig, mehr Zellen vorzubereiten, als für die Bildgebung benötigt werden, da wir feststellen, dass 50% im Durchschnitt während des Prozesses verloren gehen. Je mehr Zellen für den Prozess verwendet werden, desto einfacher ist es, sie aus dem Dichtegradienten zu ernten. Wir verwenden 4-8 ml beider Zelltypen, um überschüssige Zellen zu gewährleisten. Falls gewünscht, können Zellen vor diesem Schritt gezählt werden, um das benötigte Volumen sicherzustellen. Alle zusätzlichen Zellen werden wieder in ihre jeweiligen Kolben gesteckt.
    2. Waschen Sie beide Röhren von T-Zellen und CH27-Zellen dreimal mit 5 ml komplettem RPMI (300 x g für 5 min). Entsorgen Sie den Überstand jedes Mal während der Wäsche. Setzen Sie jede Röhre in 1 ml kompletten RPMI aus und zählen Sie zellen durch ein Hämozytometer.
  3. Resuspend 1 x 106 APCs in 500 l komplette RPMI und fügen Sie 10 M MCC. Inkubieren für 3 h bei 37 °C, 5%CO2. Waschen Sie Zellen dreimal mit 500 l komplettem RPMI (300 x g für 5 min). Entsorgen Sie die Überräube.
  4. Resuspend 1 x 106 T-Zellen in 500 l komplettem RPMI. Fügen Sie 2 g Anti-TCR-Alexa488-markierte Fab (Klon H57) zu 500 l Zellen hinzu. 30 min bei 37 °C, 5%CO2inkubieren. Waschen Sie Zellen dreimal mit 500 l vollständigem RPMI (300 x g für 5 min). Überstand nach jeder Wäsche entsorgen.
    HINWEIS: Der divalente Anti-TCR-Antikörper wurde mit einem Fab-Präparat-Kit (siehe Materialtabelle) in monovalente Fab geschnitten, um eine Vernetzung der T-Zellrezeptoren durch den divalenten Antikörper zu vermeiden (dieser Schritt ist optional).
  5. Setzen Sie beide Zelltypen in 500 l bildgebenden Medien (phenolrotfreies Leibovitz-Medium L-15 mit 10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 2 mM L-Glutamin) aus.

3. Durchführung der LLSM-Tagesausrichtung

ANMERKUNG: (Wichtig) Dieses Ausrichtungsprotokoll basiert auf dem verwendeten LLSM-Instrument (siehe Tabelle der Materialien). Jedes LLSM kann unterschiedlich sein und unterschiedliche Ausrichtungsstrategien erfordern, insbesondere solche, die selbst erstellt wurden. Führen Sie die entsprechende Routineausrichtung durch und fahren Sie mit Abschnitt 4 fort.

  1. Fügen Sie dem LLSM-Bad 10 ml Wasser plus 30 l Fluorescein (1 mg/ml)-Gehalt hinzu (ca. 10 ml Volumen), drücken Sie Bild (Home), um das Objektiv in die Bildposition zu verschieben, und betrachten Sie ein einzelnes Bessel-Laserstrahlmuster. Richten Sie den Laserstrahl mithilfe der Führungen und des voreingestellten Interessenbereichs (ROI) aus, um den Strahl zu einem dünnen Muster in alle Richtungen zu gestalten.
    1. Der Strahl sollte auch in der Finderkamera fokussiert erscheinen. Verwenden Sie zwei Spiegelneigungsregler, Top-Mikrometer, Fokus und Emissionsobjektivkragen, um sich anzupassen. Siehe Abbildung 2A,B für korrekt ausgerichteten Balken.
  2. Waschen Sie das Bad und Ziele mit mindestens 200 ml Wasser, um Fluorescein vollständig zu entfernen.
  3. Bildstandard-Fluoreszenzperlen in den bildgebenden Medien (vorbereitet durch Anhaften von Perlen an einem 5 mm-Coverslip mit Poly-L-Lysin, siehe Tabelle der Materialien;dies kann vorbereitet und wiederverwendet werden) für physikalische Punktausbreitungsfunktion (PSF) in bildgebenden Medien.
    HINWEIS: Es kann nur eine Perle für die spätere Verarbeitung in Sicht sein, also versuchen Sie, eine Perle zu finden, die sich selbst im Betrachter befindet oder leicht abgeschnitten werden kann, um eine einzelne Perle zu erhalten.
    1. Schalten Sie dither ein, indem Sie in der Box "X Galvo" auf 3 setzen. Drücken Sie Live, um das aktuelle Feld anzuzeigen. Bewegen Sie sich entlang der Z-Richtung, um den Deckelzettel und die Perlen zu finden. Finden Sie die Mitte einer Perle, indem Sie sich entlang Z bewegen, drücken Sie Stopp, um den Laser anzuhalten. Überprüfen Sie 3D, drücken Sie Center und drücken Sie dann Execute. Dadurch werden die Daten erfasst.
    2. Passen Sie den Neigungsspiegel, den Objektivkragen und das Fokusmikrometer manuell für höchste Grauwerte an, und passen Sie sie dann bei Bedarf an, um die richtigen Muster für objektive Scan-, z-Galvo-, z+objektive (totPSF) und Sample-Scan-Erfassungsmodi (samplePSF) zu erhalten. Siehe Abbildung 2C-F für richtig eingestellte Projektionen der maximalen Intensität (MEP).
      HINWEIS: Die verschiedenen Aufnahmemodi (Objektivscan, z galvo, z+objektiv und Sample-Scan) ändern die Art und Weise, wie sich das Lichtblatt durch die Probe bewegt. Alle Scan-Modi sollten für die Ausrichtung verwendet werden.
    3. Der Beispielscan zeigt, wie Daten während des Experiments gesammelt werden. Sammeln Sie die Probe PSF, indem Sie Execute im Sample-Scan-Modus für Dekewing und Dekonvolution drücken (siehe Abschnitt 5). Wechseln Sie die Laser in den Dreifarbenmodus (488, 560, 647) und drücken Sie erneut ausführen.
      HINWEIS: Da die LLSM-Bilder in einem Winkel (57,2°) aufgenommen wurden, werden im "Sample Scan"-Modus aufgenommene Bilder in diesem Winkel gesammelt und daher "verzerrt". De-Skewing ist der Prozess der Korrektur für diesen Winkel und "Neuausrichtung" des Bildes auf einen echten Z-Stack. Diese Daten müssen in bildgebenden Medien und in allen Kanälen gesammelt werden, die während des Experiments abgebildet werden. Wenn dies nicht ordnungsgemäß gesammelt wird, werden die Daten nicht ordnungsgemäß entstellt. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Medien auf 37 °C (oder die gewünschte Versuchstemperatur) erwärmt wurden.

4. Einrichten von Zellen mit LLSM

  1. Fügen Sie 100.000 APCs (50 l) von Schritt 2,5 bis zu einem kreisförmigen Abdeckungsrutsch mit 5 mm Durchmesser ab Schritt 2.1 hinzu und lassen Sie sie sich für 10 min begleichen.
  2. Fetten Sie den Probenhalter und fügen Sie dann die coverslip-Zellseite dazu. Fügen Sie einen Tropfen Bildmedien auf der Rückseite des Coverslip hinzu, um Blasen zu vermeiden, bevor Sie sie in das Bad legen. Schrauben Sie den Probenhalter auf den Piezo, und drücken Sie Bild (Home).
  3. Suchen Sie einen Abbild-APC, um sicherzustellen, dass die LLSM- und Bildverarbeitungssoftware (siehe Tabelle der Materialien)ordnungsgemäß funktioniert.
    ANMERKUNG: Wir stellen uns bei einer Schrittgröße von 0,4 m mit 60 Z-Schritten und einer Belichtung von 10 ms für zwei Farben mit dither auf 3, was zu 1,54 s pro Bildbild mit einer Auflösung von 200 nm XY und 400 nm Z führt. Diese Einstellungen müssen möglicherweise basierend auf der Zellgröße, der gewünschten Z-Auflösung und der Signalstärke der verwendeten fluoreszierenden Etikettierungstechnik angepasst werden. Der Laserstromverbrauch variiert auch je nach verwendeter fluoreszierender Etikettierungstechnik.
    1. Drücken Sie Live, um das aktuelle Bild anzuzeigen. Bewegen Sie sich entlang Z, um den Deckbedeckungsschlupf und die Zellen zu finden.
    2. Suchen Sie die Mitte eines APC, indem Sie sich in Z-Richtung bewegen, und drücken Sie dann Stopp, um den Laser anzuhalten. Überprüfen Sie 3D und geben Sie die gewünschten Einstellungen ein (siehe Schritt 4.3.1), drücken Sie Center und drücken Sie dann Execute. Dadurch werden die Daten erfasst.
  4. Senken Sie die Stufe, um die Position zu laden, und fügen Sie 50 L T-Zellen in bildgebenden Medien (100.000 Zellen, ab Schritt 2.5) tropfenweise direkt über den Deckelschlupf hinzu. Am besten lassen Sie einen Tropfen am Ende der Pipettenspitze bilden und berühren Sie dann die Spitze an der Badeflüssigkeit. Erhöhen Sie die Bühne zurück, indem Sie auf "Bild (Return)" klicken.
  5. Beginnen Sie mit der Bildgebung. Stellen Sie sicher, dass Sie die gewünschte Stapelgröße und Zeitrafferlänge festlegen. Zum Beispiel, Bild 60 z-Stacks bei einer Schrittgröße von 0,4 m und Eingabe 500 Zeitrahmen. (Typischerweise) stoppen Sie die Aufnahme, bevor 500 Frames erreicht werden, um Photobleichungen zu vermeiden. Verwenden Sie den Live-Modus, um nach Zellpaaren zu suchen, und wenn bereite und gewünschte Einstellungen eingegeben wurden, drücken Sie Ausführen, um Daten zu sammeln. Siehe Film 1 und Abbildung 1 für ein Beispiel.

5. SpurOberflächendynamik

  1. Exportieren Sie die Daten aus der Imaging-Software (siehe Tabelle der Materialien). Dadurch werden Z-Stack-TIF-Dateien für jeden Zeitpunkt in jeder Farbe erstellt.
  2. Zuerst die Daten deskew und dekonvolvenieren.
    HINWEIS: Wir verwenden die LLSpy-Pipeline unter Lizenz von HHMI Janelia Research Campus18, aber Dekewing und Dekonvolution sind auch in mehreren Bildverarbeitungssoftwares verfügbar (siehe Tabelle der Materialien).
  3. Entbleichen Sie die Daten.
    HINWEIS: Wir verwenden Fidschis Bleichmittel-Funktion mit Histogramm-Matching (Fidschi-Pfad: Bild | Anpassen | Bleichkorrektur | Histogramm Matching | OK).
  4. Importieren in die Tracking-Software (siehe Materialtabelle). Verfolgen Sie Cluster gemäß Denksoftware-Spezifikationen. Siehe Film 2 für ein Beispiel.
    HINWEIS: Die Tracking-Ergebnisse hängen von der verwendeten Tracking-Software, dem gewählten Algorithmus, den ausgewählten gewünschten Ausgabeparametern usw. ab. In der von uns verwendeten Tracking-Software (siehe Tabelle der Materialien) haben wir uns beispielsweise dafür entschieden, der Software zu erlauben, unregelmäßige Formen zu verfolgen, anstatt jedem Feature einen einzelnen Punkt zuzuweisen, da TCR-Cluster nicht in perfekte Sphären organisiert sind. Darüber hinaus haben wir 35 Parameter gesammelt, einschließlich Geschwindigkeit, Richtung, Lautstärke, Intensität, Fläche, Standort und Spurdauerinformationen. Unterschiedliche Methoden oder Parameter sind jedoch von Vorteil, um verschiedene Fragen zu beantworten.
    1. Wenn Tracking nicht gewünscht ist, verwenden Sie das ClearVolume-Plugin für Fidschi zum Visualisieren und Erstellen von Filmen aus Hyperstack-Daten.

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Ergebnisse

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Hier beschreiben wir die Isolierung, Vorbereitung und Abbildung der primären Maus 5C. C7 T-Zellen mit einem Gitter-Lichtbogenmikroskop. In Abschnitt 3 ist es zwingend erforderlich, das Mikroskop richtig auszurichten und täglich PSF zu sammeln, mit dem die Daten nach der Erfassung dekonvolvenieren können. In Abbildung 2zeigen wir die richtigen Ausrichtungsbilder, die beim Ausrichten des Mikroskops zu sehen sind. Abbildung 2A und

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das vorgestellte Protokoll wurde für die Verwendung von CD4+ T-Zellen optimiert, die von 5C isoliert wurden. C7-Transgenmäuse auf dem verwendeten LLSM-Instrument und daher andere Zellsysteme und LLSMs müssen möglicherweise unterschiedlich optimiert werden. Dieses Protokoll zeigt jedoch die Kraft der 4D-Bildgebung, da es verwendet werden kann, um die Dynamik eines Oberflächenrezeptors auf einer ganzen Zelle mit der geringsten Verzerrung unter physiologischen Bedingungen zu quantifizieren. Daher gibt es viele mö...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir möchten die Beratung und Anleitung von Dr. Vytas Bindokas von der University of Chicago würdigen. Wir danken der Integrated Light Microscopy Core Facility der University of Chicago für die Unterstützung und Wartung des Gitter-Lichtbogenmikroskops. Diese Arbeit wurde durch den NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 und den NSF Career Award 1653782 (To J.H.) unterstützt. J.R. wird vom NSF Graduate Research Fellowships Program unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 mL SpritzeBD309659Für die T-Zell-Ernte
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM3148-25MLFür T-Zellkulturen
5 mm runde DeckgläserWorld Precision Instruments502040Für die Bildgebung
70um Steriles ZellsiebCorning7201431Für die T-Zell-Ernte
Alexa Fluor 488 Anti-Maus TCR & Beta-Kette AntikörperBioLegend109215für die Bildgebung
fötalem Kälberserum (FBS)X& Y-ZellkulturFBS-500Für T-Zellkultur
FicollGE Healthcare17-1440-02Denisty Gradient Reagenz für die T-Zell-Ernte
Fluorescein-NatriumsalzSigma-AldrichF6377Für die Ausrichtung des Mikroskops
FluoSpheres Carboxylat-modifizierte MikrosphärenThermo Fisher ScientificF8810Für die Ausrichtung des Mikroskops
ImarisBitplaneN/A-Tracking-Software; Weitere Optionen für Tracking-Software sind Amira oder Trackmate (Fidschi).
Gitter-Lichtblattmikroskop3iN/AMikroskop Verwendetes
Leibovitz's L-15 Medium, kein PhenolrotThermo Fisher Scientific21083027Für die Bildgebung
von L-GlutaminThermo Fisher Scientific25030-081Für T-Zellkultur
LLSpyJanelia Research CampusN/ALLSpy wurde unter Lizenz des Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus, verwendet. Wenden Sie sich an innovation@janelia.hhmi.org, um Zugang zu erhalten. Andere Entfaltungs- und Entksewing-Methoden sind in Bildverarbeitungssoftware wie Fiji, Slidebook, Amira und anderen verfügbar. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/
Motte Cytochrom C (MCC), Sequenz ANERADLIAYLKQATKElimbioKundenspezifische Synthesefür die T-Zellernte
Penacillin/StreptamycinLife Technologies15140122_3683884612Für T-Zellkultur
Poly-L-LysinPhenix ForschungsprodukteP8920-100MLfür die Bildgebung
Erythrozyten-LysepuffereBioscience00-4300-54Für die T-Zell-Ernte
Rekombinante Maus IL-2Sigma-AldrichI0523Für T-Zellkultur
RPMI 1640 MediumCorningMT10040CVFür T-Zellkulturen
Diabook3iN/ALLSM Bildgebungssoftware
Chirurgische DissektionswerkzeugeNova-Tech InternationalDSET10Für die T-Zell-Ernte
T-25 FlaschenEppendorf2231710126Für T-Zellkultur
Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation KitsThermo Fisher Scientific44685Für die Zubereitung von Fab
von

Referenzen

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