Visualisierung der Oberflächen-T-Zell-Rezeptordynamik vierdimensional mit Lattice Light-Sheet-Mikroskopie

Summary

Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie die Lattice Light-Sheet-Mikroskopie verwendet wird, um die Dynamik von Oberflächenrezeptoren in lebenden Zellen vierdimensional zu visualisieren. Hier werden T-Zellrezeptoren auf CD4⁺ primären T-Zellen gezeigt.

Abstract

Die Signalisierung und Funktion einer Zelle wird durch die dynamischen Strukturen und Wechselwirkungen ihrer Oberflächenrezeptoren diktiert. Um die Struktur-Funktions-Beziehung dieser Rezeptoren vor Ort wirklich zu verstehen, müssen wir sie auf der Oberfläche der lebenden Zelle mit genügend raumzeitlicher Auflösung visualisieren und verfolgen. Hier zeigen wir, wie sie die kürzlich entwickelte Lattice Light-Sheet-Mikroskopie (LLSM) verwenden, um T-Zellrezeptoren (TCRs) vierdimensional (4D, Raum und Zeit) an der lebenden Zellmembran abzubilden. T-Zellen sind eine der Haupteffektorzellen des adaptiven Immunsystems, und hier haben wir T-Zellen als Beispiel verwendet, um zu zeigen, dass die Signalisierung und Funktion dieser Zellen durch die Dynamik und Wechselwirkungen der TCRs angetriebenwerden. LLSM ermöglicht 4D-Bildgebung mit beispielloser Raumzeitauflösung. Diese Mikroskopietechnik kann daher in der Biologie allgemein auf eine Vielzahl von Oberflächen- oder intrazellulären Molekülen verschiedener Zellen angewendet werden.

Introduction

Die genaue Dynamik des Molekülhandels und der Streuung auf der dreidimensionalen Zelloberfläche in Echtzeit war ein Rätsel, das es zu lösen gilt. Mikroskopie war schon immer ein Gleichgewicht zwischen Geschwindigkeit, Empfindlichkeit und Auflösung; Wenn ein oder zwei Maximierungen, wird die dritte minimiert. Aufgrund der geringen Größe und der immensen Geschwindigkeit, mit der sich Oberflächenrezeptoren bewegen, ist die Verfolgung ihrer Dynamik eine große technologische Herausforderung für den Bereich der Zellbiologie geblieben. Zum Beispiel wurden viele Studien mit der totalen inneren Reflexionsfluoreszenz (TIRF) Mikroskopie^1,

Protocol

5C. C7 TCR-transgene RAG2 Knockout-Mäuse in B10. Ein Hintergrund wurde in dieser Studie gemäß einem Protokoll verwendet, das vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Chicago genehmigt wurde.

1. Ernte und Aktivierung von T-Zellen

HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls basiert auf früheren Protokollen. Siehe Zitate für weitere Details^20,21.

1. Euthanisieren Sie ein 10-12 Wochen altes 5C. C7 transgene Maus beiderlei Geschlechts (20-25 g) nach dem zugelassenen IACUC-Protokoll (d. h._CO2-Kammer gefolgt von zervikaler Disl....

Results

Hier beschreiben wir die Isolierung, Vorbereitung und Abbildung der primären Maus 5C. C7 T-Zellen mit einem Gitter-Lichtbogenmikroskop. In Abschnitt 3 ist es zwingend erforderlich, das Mikroskop richtig auszurichten und täglich PSF zu sammeln, mit dem die Daten nach der Erfassung dekonvolvenieren können. In Abbildung 2zeigen wir die richtigen Ausrichtungsbilder, die beim Ausrichten des Mikroskops zu sehen sind. Abbildung 2A und

Discussion

Das vorgestellte Protokoll wurde für die Verwendung von CD4⁺ T-Zellen optimiert, die von 5C isoliert wurden. C7-Transgenmäuse auf dem verwendeten LLSM-Instrument und daher andere Zellsysteme und LLSMs müssen möglicherweise unterschiedlich optimiert werden. Dieses Protokoll zeigt jedoch die Kraft der 4D-Bildgebung, da es verwendet werden kann, um die Dynamik eines Oberflächenrezeptors auf einer ganzen Zelle mit der geringsten Verzerrung unter physiologischen Bedingungen zu quantifizieren. Daher gibt es viele mö.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Spritze	BD	309659	Für die T-Zell-Ernte
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148-25ML	Für T-Zellkulturen
5 mm runde Deckgläser	World Precision Instruments	502040	Für die Bildgebung
70um Steriles Zellsieb	Corning	7201431	Für die T-Zell-Ernte
Alexa Fluor 488 Anti-Maus TCR & Beta-Kette Antikörper	BioLegend	109215	für die Bildgebung
fötalem Kälberserum (FBS)	X& Y-Zellkultur	FBS-500	Für T-Zellkultur
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	Denisty Gradient Reagenz für die T-Zell-Ernte
Fluorescein-Natriumsalz	Sigma-Aldrich	F6377	Für die Ausrichtung des Mikroskops
FluoSpheres Carboxylat-modifizierte Mikrosphären	Thermo Fisher Scientific	F8810	Für die Ausrichtung des Mikroskops
Imaris	Bitplane	N/	A-Tracking-Software; Weitere Optionen für Tracking-Software sind Amira oder Trackmate (Fidschi).
Gitter-Lichtblattmikroskop	3i	N/A	Mikroskop Verwendetes
Leibovitz's L-15 Medium, kein Phenolrot	Thermo Fisher Scientific	21083027	Für die Bildgebung
von L-Glutamin	Thermo Fisher Scientific	25030-081	Für T-Zellkultur
LLSpy	Janelia Research Campus	N/A	LLSpy wurde unter Lizenz des Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus, verwendet. Wenden Sie sich an innovation@janelia.hhmi.org, um Zugang zu erhalten. Andere Entfaltungs- und Entksewing-Methoden sind in Bildverarbeitungssoftware wie Fiji, Slidebook, Amira und anderen verfügbar. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/
Motte Cytochrom C (MCC), Sequenz ANERADLIAYLKQATK	Elimbio	Kundenspezifische Synthese	für die T-Zellernte
Penacillin/Streptamycin	Life Technologies	15140122_3683884612	Für T-Zellkultur
Poly-L-Lysin	Phenix Forschungsprodukte	P8920-100ML	für die Bildgebung
Erythrozyten-Lysepuffer	eBioscience	00-4300-54	Für die T-Zell-Ernte
Rekombinante Maus IL-2	Sigma-Aldrich	I0523	Für T-Zellkultur
RPMI 1640 Medium	Corning	MT10040CV	Für T-Zellkulturen
Diabook	3i	N/A	LLSM Bildgebungssoftware
Chirurgische Dissektionswerkzeuge	Nova-Tech International	DSET10	Für die T-Zell-Ernte
T-25 Flaschen	Eppendorf	2231710126	Für T-Zellkultur
Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits	Thermo Fisher Scientific	44685	Für die Zubereitung von Fab