Summary
我们演示了一种利用荧光显微镜在阿拉伯拟南芥中精子核形态测定成功或失败受精的方法。
Abstract
开花植物有一个独特的性生殖系统，称为"双受精"，其中每个精子细胞精确与卵细胞或中心细胞融合。因此，两个独立的受精事件几乎同时发生。受精卵细胞和中枢细胞分别发育成酶和内膜。因此，精确控制双施肥对后续种子发育至关重要。双重受精发生在雌性野味（胚胎囊），这是深隐藏，覆盖着厚厚的卵巢和卵巢组织。这种双倍施肥的构造使得对双施肥的观察和分析相当困难，造成了目前双施肥机制问题仍未解决的局面。对于施肥调节器潜在候选者的功能评估，施肥的体称分析非常重要。为了判断在阿拉伯拟南芥中受精的完成情况，用标记精子核的荧光信号的形状作为指标。未能受精的精子细胞由雌性配子外的凝聚荧光信号指示，而成功受精的精子细胞则通过与雌性配子核的结核核的减压信号表示。此处描述的方法提供了一个工具，用于确定在体内条件下成功或失败的受精。
Introduction
开花植物通过双重受精产生种子，这个过程由在Gamete血浆膜1、2上局部的蛋白质之间的相互作用直接控制。开花植物雄性配子，一对精子细胞，在花粉中发育。授粉后生长的花粉管将一对精子细胞输送到雌性配子、卵细胞和中心细胞，这些细胞在胚胎囊中发育。雄性配子和雌性配子相遇后，配子表面的蛋白质促进识别、附着和融合，以完成双重受精。在以前的研究中，雄性Gamete膜蛋白：2（GCS1）/HAPLESS2（HAP2）3、4和GAMETE表达2（GEX2）5被确定为参与Gamete融合的受精调节剂，附件。我们最近鉴定出一种雄性gamete特异性膜蛋白，DUF679 DOMAIN，第9蛋白（DMP9），作为参与Gamete相互作用的受精调节剂。我们发现，DMP9表达的减少导致在A.thaliana6的双重受精期间对卵细胞受精的显著抑制。
由于双受精发生在胚胎囊中，胚胎囊嵌入在卵巢组织进一步包裹的卵子中，因此很难观察和分析双重受精过程状态。因此，仍有许多不明确的点，阻碍对双施肥控制的整体机制的全面了解。建立观察技术，以跟踪在体内条件下的双重受精过程中配子的行为，对于对施肥调节器的潜在候选物进行功能分析是必不可少的。最近的研究已经产生了标记线，其中Gamete亚细胞结构被标记与荧光蛋白。在本文中，我们演示了一种简单而快速的协议，用于观察从人工授粉的皮斯蒂尔衍生的胚胎囊中发生的双重受精。使用精子细胞核标记线HTR10-mRFP7，每个雌性胶合物的受精状态可以基于精子核信号形态进行区分。我们的方案侧重于精子核在受精时的变化，可以有效地获得足够的数据进行统计证明。具有HTR10-mRFP背景（DMP9 KD/HTR10-mRFP）的DMP9-敲落线用作雄性植物，以显示单一施肥模式。该协议也适用于其他施肥调节器的功能分析。
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Protocol
1. 人工授粉
注：在开始该过程之前，需要一对 5 号钳子。
- 在生长室的16-h光/8-h暗循环下，在22°C下生长A.thaliana（Col-0）。
注：用剪刀切割和去除第一个开发的花茎，以促进开枝芽的发展。大力种植植物（切割第一茎后2-3周;植物高度约25厘米）适合分析。 - 要削弱花蕾（图1B）、花瓣（图1C）和花蕾（图1D），使用第5号钳子（图1A）。。在顶部看到花瓣的芽是最好的。
注：使用合适的女性游戏标记线。在这个协议中，我们使用野生植物作为雌性父。 - 消瘦后十五至十八小时，在阶段 138时用钳子捏住灯丝，取取DMP9KD/HTR10-mRFP花的摇号。
- 要授粉，轻轻拍打一个被污辱的污名几次与脱皮器。
2. 准备观察的奥图勒
注：需要以下物品：连接双面胶带的滑动玻璃、5 号钳子、27 G 注射针和解剖显微镜。
- 授粉后7至8小时（HAP），收集皮斯蒂尔并将其放在双面胶带上，然后用钳子轻轻按压以固定在胶带上（图2A，A'）。
注：大多数卵泡在皮斯蒂尔接受至少一个花粉管10HAP 9。如果来自第一个花粉管的两个或任一个精子细胞不能受精，第二个花粉管将被卵子吸引，由于受精恢复系统10。为了分析第一个花粉管的精子核形态，建议最迟在10HAP完成卵子制备。 - 在解剖显微镜下使用注射针切断卵巢的上、下端（图2B，B'）。
- 通过移动注射针的尖端，沿着注射针的两侧（图2C，C'）切开卵巢壁。
注：浅插入注射针，以防止排卵从隔膜分离。 - 使用注射针恒在卵巢壁上（ 图2D，D'）。
- 捏住卵子所连接的隔膜底部，用钳子小心地抬起它（图2E）。
- 将卵子转移到滑动玻璃上的一滴水中，用盖玻璃轻轻盖上，在荧光显微镜下观察（图2E，E'）。
3. 显微镜
注：在这个协议中，我们使用了一个装有荧光滤镜立方体的荧光显微镜（见材料表）、数码相机和附带的软件。
- 使用 20x 或 40x 物镜和配备的数码相机获取含有 mRFP 标记的精子核的卵子图像。
- 确认胚胎囊中标有mRFP标记的精子核的数量。
注：含有两个mRFP标记精子核的卵子可以包括在种群大小中进行统计分析。 - 确认胚胎囊中每个mRFP标记精子核的形状和位置。
注：从花粉管中释放后，一对含有浓缩的mRFP标记精子核在卵子和中心细胞之间被局部化。例如，在chalazal端侧检测到的具有解压缩的mRFP标记精子核表示中心细胞受精。通过使用合适的雌性gamete膜标记线（如补充图1所示），精子细胞是否正在进行质粒化（在膜融合后，但在卡约加米之前）可以清楚地监测。
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Representative Results
用DMP9 KD/HTR10-mRFP授粉的皮斯蒂尔的卵泡在7-8HAP上被收集并观察。
大多数卵泡在卵细胞（微皮侧）和中细胞（夏拉扎尔端侧）的细胞核位置分别含有两个解压缩的mRFP标记精子核（图3A），表明成功的双重受精。此外，在中心细胞核处观察到含有解压缩mRFP标记精子核的卵子，以及卵细胞外的凝结mRFP标记精子核（图3B），表明单受精。在双受精失败的情况下，在卵细胞和中心细胞的边界处观察到两个浓缩的mRFP标记精子核（图3C），如gcs1突变精子细胞（图3D）3，4.
在使用DMP9KD/HTR10-mRFP花粉的分析中，很少观察到含有单个浓缩mRFP标记精子核（图4A）或三个或更多mRFP标记精子核（图4B）的卵子。
图1：花蕾适合消瘦。（A） 第11阶段的花蕾，在顶部显示花瓣的碎片。（B-D）花蕾，其中被切除了花瓣 （B） 和花瓣 （C）， 然后被完全去除 （D）.另一个去功能化尚未发生。比例尺 = 1 毫米。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：卵泡样品制备的流量。程序由插图 （A-E） 和照片 （A'-E'） 显示.（A， A'）在连接到滑动玻璃的双面胶带上放置一个皮片，其上部和下端用注射针切断。（B， B'）卵巢壁沿着雷梅的两侧被切开。（C， C'）卵巢壁的两侧被打开、避开，并压在胶带上进行固定。（D， D'）阵列中连接卵子的隔膜暴露。（E， E'）隔膜的一端被捏起，用钳子抬起来。带有连接卵子的隔膜被转移到滑动玻璃上的一滴水中。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：精子核信号形态判断的受精表型在卵泡。（A） 由两个解压缩的 mRFP 标记精子核（箭头）指示的成功双重受精。（B）由DMP9KD/HTR10-mRFP精子细胞进行单受精，由一个解压缩的mRFP标记精子核（箭头）和一个浓缩的mRFP标记精子核（箭头）指示。（C） DMP9KD/HTR10-mRFP精子细胞通过两个浓缩的mRFP标记精子核（箭头）指示的双重受精失败。（D） gcs1HTR10-mRFP精子细胞双受精失败的例子。使用用RFP标记卵细胞核（EN）的标记线。在18HAP时，两个凝聚的mRFP标记精子核（箭头）在没有受精的情况下被拘捕。（E） 卵泡的图解图.EC = 卵细胞，CC = 中央细胞，SC = 协同细胞，ES = 胚胎囊，MP = 微皮，CHZ = chalazal 端。刻度条 = 20 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4：其他潜力受精表型。与DMP9KD/HTR10-mRFP授粉的卵子很少包含单个浓缩的mRFP标记精子核（A），或三个或更多浓缩的mRFP标记精子核（B）（箭头）。刻度条 = 20 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
补充图1：受精期间在质粒体中凝聚精子核，与女性血浆膜标记线结合判断。pFWA：：GFP-PIP，其中中央细胞血浆膜可视化被用作女性母体（GFP）。GFP-PIP也标记内膜12。卵子包含两个浓缩的mRFP标记的精子核（箭头;RFP）。正宗端侧（箭头）处的RFP信号显示在中心细胞（合并）中，表明精子核处于质粒体（在配子膜融合后，但在卡约加米之前）。右侧的面板是合并图像中由虚线包围的区域的放大倍率。用星号标记的空白区域对应于中心细胞核的位置。虚线表示面向卵细胞的中央细胞的轮廓。刻度条 = 20 μm。请点击此处下载此文件。
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Discussion
HTR10-mRFP标签父色素（即，可视化精子细胞核），和动态在双受精已报告7。从花粉管中释放后，HTR10-mRFP标记的精子核仍然凝结。然而，每个精子核在与受精的雌性体细胞核合并后，在Gamete膜融合7后三到四个小时被解压缩。未受精的精子细胞保持浓缩，如在胚胎囊中所示，在胚胎囊中gcs1精子细胞在没有受精的情况下被吸收（图3D）。通常，当肥的HTR10-mRFP用作花粉母时，57.9%~17.8%（均值= s.d.;n = 16分），在7-8 HAP的卵子中含有两个mRFP标记的精子核信号，以及几乎所有的信号（97.2%）解压缩，反映成功的双重受精（类似的信号模式如图3A所示）。在DMP9KD/HTR10-mRFP的情况下，观察到含有两个mRFP标记精子核的卵子，其频率与HTR10-mRFP相似，但其中17.6%的卵子表现出单受精6。我们采用HTR10-mRFP动力学，使用荧光显微镜观察体内大量卵泡。该协议简单快捷，能够收集足够的数据进行统计证明。以该协议为首例，证明了DMP9KD/HTR10-mRFP精子细胞对中枢细胞单受精的意义。
根据从一个花粉管中提取的HTR10-mRFP标记精子核的形态差异，将受精模式分为三种表型：（1）成功双受精，其特征是两次解压HTR10-mRFP标记精子核（图3A）;（2）单受精，具有一个浓缩的HTR10-mRFP标记精子核和一个解压缩的HTR10-mRFP标记精子核（图3B）;和（3）失败的双受精，其中有两个浓缩的HTR10-mRFP标记精子核（图3C）。
应考虑表型 （2） 和 （3） 的其他潜在原因。据报道，精子细胞在半体外培养条件下释放到胚胎囊后几分钟内，分别开始与卵细胞或中心细胞进行质粒。此外，第一次和第二次受精之间存在几分钟的时滞，尽管没有偏好卵子细胞和中心细胞11的受精顺序。因此，表型（2）中的一对浓缩和去浓缩精子核可能表示受精而不是单受精之间的时滞。为了确认表型（2）中显著频率的单施肥的发生，应检查一些足以进行统计分析的样本。表型（3），它有两个浓缩精子核（图3C），可以反映精子细胞在血浆膜融合12之前或质粒和卡约米之间的一段静止期。因此，7-8 HAP的两个浓缩精子核不能完全反映双重受精的"失败"，有必要在授粉后观察卵子，以评估双受精的成败。在这方面，建议在16-18 HAP进行卵子观察，因为大多数卵子会用第一个花粉管提供的精子细胞完成双重受精，而未受精的精子核的HTR10-mRFP信号将一直持续到下一个授粉日，如图3D所示。
单浓缩HTR10-mRFP标记精子核（图4A）的模式很少被检测到，这可能是由于单受精结果，受精母体中另一个父体HTR10-mRFP信号迅速消失。在此分析中，由于受精恢复系统10接受第二个花粉管，三个或三个以上HTR10-mRFP标记的精子核也被检测为罕见病例（图4B）。在此协议中，这些病例被排除在数据之外，因为跟踪从一个花粉管派生的两个精子细胞的行为对于准确评估至关重要。
由于雌性配子在胚胎囊中的位置的极性受到很好的调节（即，卵细胞和中枢细胞分别在微皮拉侧和chalazal侧分化），哪些雌性配子正在受精，可以由相对判断mRFP标记的精子核的位置。然而，在区分未受精和质原状态时存在局限性，因为这两种状态都由浓缩精子核信号指示。为了准确评估在体细胞膜融合后是否发生质粒，当精子核被浓缩时，需要使用雌性gamete膜标记线，如高桥等人（2018）6报道。例如，当一个pFWA：：GFP-PIP植物12，其中中央细胞血浆膜被可视化作为女性父母使用，很明显，与中央细胞融合的精子细胞是在质粒体（补充图1).
总之，我们描述的协议可用于统计评估每个雌性球体受精的成败。虽然需要使用女性血浆膜标记来判断血浆体，但我们的方法对受精调节器的功能分析是有用的。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了日本科学促进协会KAKENHI赠款（JP17H05832至T.I.）的支持，以及日本千叶大学植物化学植物分子科学战略优先研究促进方案的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX51 | Olympus | Epifluorescence microscope | |
| Cover glass | Matsunami glass | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6 |
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| Double-sided tape | Nichiban | NW-15S | 15 mm width |
| DP72 | Olympus | Degital camera | |
| Forceps | Vigor | Any No. 5 forceps are available | |
| Growth chamber | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7 |
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| Injection needle | Terumo | NN-2719S | 27 G |
| Slide glass | Matsunami glass | S9443 | |
| SZX9 | Olympus | Dissecting microscope | |
| U-MRFPHQ | Olympus | Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565) | |
| UPlanFL N 40x | Olympus | Objective lens (NA 1.3), oil-immersion | |
| UPlanSApo 20x | Olympus | Objective lens (NA 0.75), dry |
References
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