Bewertung von oxidativen Schäden in den primären Maus-Augen-Oberflächenzellen/Stammzellen als Reaktion auf Uv-C-Schäden (UV-C)

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert den gleichzeitigen Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), lebenden Zellen und abgestorbenen Zellen in lebenden Primärkulturen aus Maus-Augenoberflächenzellen. 2',7'-Dichlorfluoresceindiacetate, Propidiumiodid und Hoechst-Färbung werden verwendet, um die ROS,, abgestorbene Zellen und lebende Zellen zu bewerten, gefolgt von Bildgebung und Analyse.

Zusammenfassung

Die Augenoberfläche ist aufgrund verschiedener Umwelteinflüsse regelmäßig abnutzend. Die Exposition gegenüber UV-C-Strahlung stellt eine Gesundheitsgefährdung am Arbeitsplatz dar. Hier zeigen wir die Exposition von Primärstammzellen von der Maus-Augenoberfläche gegenüber UV-C-Strahlung. Die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) ist die Auslesung des Ausmaßes von oxidativem Stress/Schäden. In einer experimentellen In-vitro-Einstellung ist es auch wichtig, den Prozentsatz der toten Zellen zu bewerten, die durch oxidativen Stress erzeugt werden. In diesem Artikel zeigen wir die 2',7'-Dichlorfluoresceindiacetate (DCFDA) Färbung von UV-C-exponierten primären Augenoberflächenstammzellen der Maus und deren Quantifizierung auf der Grundlage der fluoreszierenden Bilder der DCFDA-Färbung. DCFDA Färbung entspricht direkt der ROS-Generation. Wir zeigen auch die Quantifizierung von toten und lebenden Zellen durch gleichzeitige Färbung mit Propidiumiodid (PI) bzw. Hoechst 3332 bzw. dem Prozentsatz der DCFDA (ROS-positiven) und PI-positiven Zellen.

Einleitung

Die Augenoberfläche (OS) ist eine funktionelle Einheit, die hauptsächlich aus der äußeren Schicht und drüsensen Epithelie von Hornhaut, lachrymaler Drüse, meibomianischer Drüse, Bindehaut, einem Teil der Augenlidränder und Innervationen besteht, die Signale¹transduce. Die transparente kuppelförmige Hornhautschicht lenkt das Licht auf die Netzhaut. Dieses avaskuläre Gewebe besteht aus zellulären Komponenten wie Epithelzellen, Keratozyten und Endothelzellen und azellulären Komponenten wie Kollagen und Glycosaminoglycans². Das Gebiet wird von Tränen entwässert, die auch die meisten Nährstoffe liefern. Die anatomische Positi....

Protokoll

Das Experiment wurde an primären Augenzellen/Stammzellen durchgeführt, die vom Schweizer Albino-Mausauge abgeleitet wurden. Die Verwendung von Tieren zur Augenernte für dieses Experiment wurde vom Institutional Animal Ethical Committee, Yenepoya (Considered to be University) genehmigt (IEAC-Zulassungsnummer, 6a/19.10.2016).

1. Zubereitungen von Reagenzien

HINWEIS: Die Ableitung von Primärzellen/Stammzellen von der Augenoberfläche der Maus geht über den Rahmen dieses Protokolls hinaus. Daher zeigen wir die UV-C-Expositionsdosen, reagenzvorbereitung zur Beurteilung von ROS, lebende und abgestorbene Zellen und deren Q....

Ergebnisse

DCFDA ist ein farbloser Farbstoff, der eine chemisch reduzierte Form von Fluorescein ist, die als Indikator für den Nachweis von ROS in Zellen verwendet wird. Dieser Farbstoff wird in Zellen eingeschlossen und leicht zu fluoreszierendem Dichlordihydrofluorescein (DCF) oxidiert, das eine grüne Fluoreszenz aussendet. Diese Fluoreszenz kann mit fluoreszierender Mikroskopie nachgewiesen werden. Die Zellen können visualisiert und mit der ROS-Akkumulation wie folgt korreliert werden: (i) lebende Zellen ohne ROS emittieren hohe.......

Diskussion

Die hier beschriebene DCFDA-Färbemethode ermöglicht die Visualisierung von ROS in primären augenförmigen, mit UV-C-Strahlung behandelten primären okulären Lebendenzellen der Maus. Ein Vorteil dieser Färbemethode ist, dass sie es den Forschern auch ermöglicht, die unmittelbaren Auswirkungen von UV-C (3 Stunden nach UVC-Exposition) auf die lebenden Zellen und deren gleichzeitige Aufzählung für den Prozentsatz von ROS-positiven sowie abgestorbenen Zellen zu untersuchen. Darüber hinaus können die Zellen, da die Färbemethode .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2',7'-Dichlorfluoresceindiacetat (DCFDA)	Sigma	D6883	2',7'-Dichlorfluoresceindiacetat ist eine fluorogene Sonde und für Zellen durchlässig. Es wird zur Quantifizierung von reaktiven Sauerstoffspezies verwendet.
Zellkulturschale (35 mm)	Eppendorf	SA 003700112	Sterile Schalen für die Kultivierung der Zellen.
DMEM High Glucose	HiMedia	AT007	Das am weitesten verbreitete Zellkulturmedium enthält 4500 mg/L Glukose.
Fötales Rinderserum, EU-Herkunft	HiMedia	RM99955	Einer der wichtigsten Bestandteile von Zellkulturmedien. Es liefert Wachstumsfaktoren, Aminosäuren, Proteine, fettlösliche Vitamine wie A, D, E und K, Kohlenhydrate, Lipide, Hormone, Mineralien und Spurenelemente.
GlutMax	Gibco, Thermo Fisher Scientific	35050061	Wird als Ergänzung und Alternative zu L-Glutamin verwendet. Es hilft bei der Verbesserung der Lebensfähigkeit und des Wachstums der Zellen.
HL-2000 Hybrilinker	UVP		Hybridisierungsofen/UV-Vernetzer
Hoechst 33342	Sigma	B2261	Hoechst Färbung ist sowohl für lebende als auch für tote Zellen durchlässig. Es bindet an doppelt verhungerte DNA, unabhängig davon, ob die Zelle tot oder lebendig ist.
Matrigel	Corning		Basalmembran-Matrix
MEM Nicht-essentielle Aminosäuren (100X)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11140050	Wird als Ergänzung verwendet, um das Zellwachstum und die Lebensfähigkeit zu erhöhen.
Penicillin-Streptomycin (Pen-Streptomycin)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15140122	Penicillin und Streptomycin wird verwendet, um die bakterielle Kontamination in Kultur zu verhindern.
Propidiumiodid	Sigma	P4170	Fluoreszierender Farbstoff, der nur für tote Zellen durchlässig ist. Es bindet an die DNA und hilft bei der Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen.
TryplE Express	Thermo Fisher Scientific		Sanftes Zelldissoziationsmittel
ZOE Fluoreszierender Zell-Imager	Bio-rad