NMR-basierte Aktivitätsassays wurden entwickelt, um Inhibitoren von zwei Nukleosid-Ribohydrolase-Enzymen zu identifizieren und zu charakterisieren. Es werden Protokolle für anfängliche zusammengesetzte Assays mit 500 m und 250 M, Dosis-Wirkungs-Assays zur Bestimmung der IC-50-Werte, Waschmittel-Gegensieb-Assays, Jump-Dilution-Zähler-Screen-Assays und Assays in E. coli-Vollzellen bereitgestellt.
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Methodenartikel
NMR-based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die NMR-Spektroskopie wird häufig zur Identifizierung und Charakterisierung von Enzyminhibitoren bei der Arzneimittelentdeckung eingesetzt, insbesondere im Rahmen des Fragmentscreenings. NMR-basierte Aktivitätstests sind ideal geeignet, um an den höheren Konzentrationen von Testverbindungen zu arbeiten, die erforderlich sind, um diese schwächeren Inhibitoren zu erkennen. Der Dynamikbereich und die chemische Verschiebungsdispersion in einem NMR-Experiment können Resonanzen von Substrat-, Produkt- und Prüfverbindungen problemlos auflösen. Dies steht im Gegensatz zu spektrophotometrischen Assays, bei denen ausgelesene Interferenzprobleme oft durch Verbindungen mit überlappenden UV-Vis-Absorptionsprofilen entstehen. Da ihnen außerdem Reporterenzyme fehlen, sind die Single-Enzym-NMR-Assays nicht anfällig für gekoppelte Fehlalarme. Dieses Attribut macht sie nützlich als orthogonale Assays, die traditionelle Screening-Assays mit hohem Durchsatz und Banktop-Triage-Assays ergänzen. Detaillierte Protokolle sind für anfängliche zusammengesetzte Assays bei 500 m und 250 M, Dosis-Wirkungs-Assays zur Bestimmung der IC-50-Werte, Waschmittel-Gegensieb-Assays, Jump-Dilution-Zähler-Screen-Assays und Assays in E. coli-Vollzellen vorgesehen. Die Methoden werden mit zwei Nukleosid-Ribohydrolase-Enzymen demonstriert. Die Verwendung von 1H NMR wird für das purinspezifische Enzym gezeigt, während 19F NMR für das Pyrimidin-spezifische Enzym gezeigt wird. Die Protokolle sind allgemein auf jedes Enzym anwendbar, bei dem Substrat- und Produktresonanzen beobachtet und durch NMR-Spektroskopie unterschieden werden können. Um im Zusammenhang mit der Entdeckung von Arzneimitteln am nützlichsten zu sein, sollte die endgültige Konzentration von Substrat nicht mehr als das 2-3-fache seines K-m-Wertes betragen. Die Wahl des NMR-Experiments hängt von der enzymischen Reaktion und den verfügbaren Substraten sowie der verfügbaren NMR-Instrumentierung ab.
Einleitung
Die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) ist für die Charakterisierung und Überwachung von Enzymreaktionen1,2etabliert. Unterschiede in chemischen Verschiebungen und Kopplungsmustern werden verwendet, um Substrat- und Produktresonanzen zu unterscheiden, und relative Resonanzintensitäten werden verwendet, um den Prozentsatz der Reaktion zu quantifizieren. Sowohl der Verbrauch von Substrat als auch die Produktherstellung werden direkt im NMR-Spektrum beobachtet. Dies steht im Gegensatz zur Spektrophotometrie oder Fluoreszenzspektroskopie, bei der der Reaktionszeitverlauf durch eine Änderung der Absorption angezei....
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Protokoll
1. Erste Test-Compound-Assays bei 500 m und 250 m
- Substrat und Testverbindung auf Reaktionen vorbereiten.
- Bereiten Sie Lagerlösungen von Substrat (Adenosin oder 5-Fluorouridin) in Wasser und 50 mM Testverbindung in deuteriertem Dimethylsulfoxid (DMSO) vor. Siehe Einführungsabschnitt für Konzentrationen von Substratlösung zu verwenden.
- Fügen Sie jeweils 12 l Substrat (Adenosin oder 5-Fluorouridin) zu je vier 1,5 ml Mikrofuge-Röhren, 1–4 hinzu.
- Fügen Sie den Röhren 1 (0 min Kontrolle) und 4 (30 min Steuerung) 6 l deuterated DMSO hinzu. Fügen Sie Tube 2 6 l der Prüfmasse hinzu. Fügen Sie 3 l Der Prüfmasse und 3 l deuterated DMSO zu....
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Ergebnisse
Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse für die Prüfung von zwei Verbindungen mit AGNH unter Verwendung von 1H NMR nach Abschnitt 1. Die Enzymreaktion wird am leichtesten beobachtet und quantifiziert durch das Verschwinden von Adenosin-Singlet- und Doublet-Resonanzen bei 8,48 ppm bzw. 6,09 ppm und das Auftreten einer Adenin-Singlet-Resonanz bei 8,33 ppm, wie bei der 30 min-Kontrolle beobachtet spektrum. In Gegenwart von 500 m Verbindung 1 wird kein Produkt gebildet, wie das Fehlen einer .......
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Diskussion
Die beschriebenen Protokolle sind allgemein auf viele Enzyme anwendbar, sofern die Substrate und/oder Produkte lösbare Signale im NMR-Spektrum aufweisen. Es ist jedoch entscheidend, dass die Konzentration des Substrats nahe an seinem Km-Wert liegt und hoch genug ist, um in einem NMR-Experiment innerhalb eines angemessenen Zeitrahmens nachgewiesen zu werden. Eine Substratkonzentration von nicht mehr als dem 2-3x k m-Wert ist optimal für die Erkennung von wettbewerbsorientierten, nicht wettbewe.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Wir danken Dr. Dean Brown für die Bereitstellung von Verbindungen aus der AstraZeneca-Fragmentbibliothek und Dr. David Parkin für die Bereitstellung der Enzyme AGNH und UNH. Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom National Institute of Allergy and Infectious Diseases der National Institutes of Health unter der Award-Nummer R15AI128585 an B. J. S. unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar. Research wurde auch von einem Horace G. McDonell Summer Research Fellowship unterstützt, das S. N. M., einer Landesberg-Familie, verliehen wurde. Stipe....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| AGNH | Gereinigtes | N/A | TVAG_213720 |
| UNH | Gereinigtes | N/A | TVAG_092730 |
| Adenosin | Sigma | A9251 | |
| 5-Fluorouridin | Sigma | F5130 | |
| Dimethylsulfoxid-D6 | Cambridge Isotope Labs | DLM-10-100 | D, 99,9% |
| Kaliumphosphat einbasisch | Sigma | P0662 | |
| Kaliumphosphat zweibasisch | Sigma | P3786 | |
| Kaliumchlorid | Sigma | P9541 | |
| Deuteriumoxid | Cambridge Isotope Labs | DLM-4-100 | D, 99,9% |
| Salzsäure | Fisher Chemical | A144212 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| 3-(Trimethylsilyl)propionsäure-2,2,3,3,-d4 saures Natriumsalz (TSP) | Sigma | 269913 | D, 98% |
| 2,2,2-Trifluorethanol-1,1-d2 | Sigma | 612197 | D, 99,5% |
| Pipette | Gilson | F123602 | PIPETMAN Classic P1000 |
| Pipette | Gilson | F123601 | PIPETMAN Classic P200 |
| Pipette | Gilson | F123600 | PIPETMAN Classic P20 |
| Mikrofugenröhrchen | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Konische Röhrchen | Corning | 352099 | |
| Mikrozentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Vortex-Mischer | Fisher Scientific | 02215365 | |
| NMR-Röhrchen | Norell | 502-7 | Oder je nach NMR |
| NMR-Spektrometer | Bruker | N/ Eine | AvanceIII500 |
| Prism Software | GraphPad N | /A | Version 5.04 |
Referenzen
- Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. NMR in Molecular Biology. , Academic Press. New York. (1981).
- Evans, J. N. S. Biomolecular NMR spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1995).
- Dalvit, C., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
