Methodenartikel

NMR-based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

DOI:

10.3791/59928

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30. Juni 2019

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1Department of Chemistry, Adelphi University, 2Department of Chemistry, Washington University in St. Louis, 3Department of Chemistry, Boston University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NMR-basierte Aktivitätsassays wurden entwickelt, um Inhibitoren von zwei Nukleosid-Ribohydrolase-Enzymen zu identifizieren und zu charakterisieren. Es werden Protokolle für anfängliche zusammengesetzte Assays mit 500 m und 250 M, Dosis-Wirkungs-Assays zur Bestimmung der IC-50-Werte, Waschmittel-Gegensieb-Assays, Jump-Dilution-Zähler-Screen-Assays und Assays in E. coli-Vollzellen bereitgestellt.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die NMR-Spektroskopie wird häufig zur Identifizierung und Charakterisierung von Enzyminhibitoren bei der Arzneimittelentdeckung eingesetzt, insbesondere im Rahmen des Fragmentscreenings. NMR-basierte Aktivitätstests sind ideal geeignet, um an den höheren Konzentrationen von Testverbindungen zu arbeiten, die erforderlich sind, um diese schwächeren Inhibitoren zu erkennen. Der Dynamikbereich und die chemische Verschiebungsdispersion in einem NMR-Experiment können Resonanzen von Substrat-, Produkt- und Prüfverbindungen problemlos auflösen. Dies steht im Gegensatz zu spektrophotometrischen Assays, bei denen ausgelesene Interferenzprobleme oft durch Verbindungen mit überlappenden UV-Vis-Absorptionsprofilen entstehen. Da ihnen außerdem Reporterenzyme fehlen, sind die Single-Enzym-NMR-Assays nicht anfällig für gekoppelte Fehlalarme. Dieses Attribut macht sie nützlich als orthogonale Assays, die traditionelle Screening-Assays mit hohem Durchsatz und Banktop-Triage-Assays ergänzen. Detaillierte Protokolle sind für anfängliche zusammengesetzte Assays bei 500 m und 250 M, Dosis-Wirkungs-Assays zur Bestimmung der IC-50-Werte, Waschmittel-Gegensieb-Assays, Jump-Dilution-Zähler-Screen-Assays und Assays in E. coli-Vollzellen vorgesehen. Die Methoden werden mit zwei Nukleosid-Ribohydrolase-Enzymen demonstriert. Die Verwendung von 1H NMR wird für das purinspezifische Enzym gezeigt, während 19F NMR für das Pyrimidin-spezifische Enzym gezeigt wird. Die Protokolle sind allgemein auf jedes Enzym anwendbar, bei dem Substrat- und Produktresonanzen beobachtet und durch NMR-Spektroskopie unterschieden werden können. Um im Zusammenhang mit der Entdeckung von Arzneimitteln am nützlichsten zu sein, sollte die endgültige Konzentration von Substrat nicht mehr als das 2-3-fache seines K-m-Wertes betragen. Die Wahl des NMR-Experiments hängt von der enzymischen Reaktion und den verfügbaren Substraten sowie der verfügbaren NMR-Instrumentierung ab.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) ist für die Charakterisierung und Überwachung von Enzymreaktionen1,2etabliert. Unterschiede in chemischen Verschiebungen und Kopplungsmustern werden verwendet, um Substrat- und Produktresonanzen zu unterscheiden, und relative Resonanzintensitäten werden verwendet, um den Prozentsatz der Reaktion zu quantifizieren. Sowohl der Verbrauch von Substrat als auch die Produktherstellung werden direkt im NMR-Spektrum beobachtet. Dies steht im Gegensatz zur Spektrophotometrie oder Fluoreszenzspektroskopie, bei der der Reaktionszeitverlauf durch eine Änderung der Absorption angezeigt wird, die darauf zurückzuführen ist, dass einige chemische Arten konsumiert oder erzeugt werden. Wie bei den anderen Methoden kann NMR verwendet werden, um Enzymreaktionen in Abhängigkeit von Temperatur, pH oder anderen Lösungsbedingungen zu untersuchen, und die Wirkung von Inhibitoren kann bestimmt werden.

In jüngerer Zeit wurden NMR-basierte Enzymaktivitätstests für das Fragmentscreening3,4gezeigt. NMR-basierte Assays eignen sich ideal für die Arbeit an den höheren Konzentrationen von Testverbindungen (oft bis zu 1 mM), die zum Nachweis dieser schwächeren Inhibitoren erforderlich sind. Der Dynamikbereich und die chemische Verschiebungsdispersion im NMR-Experiment können Resonanzen von Substrat-, Produkt- und Prüfverbindungen problemlos auflösen. Dies ist im Vergleich zu spektrophotometrischen Assays, bei denen ausgelesene Interferenzprobleme häufig durch Verbindungen mit überlappenden UV-Vis-Absorptionsprofilen entstehen. Da ihnen außerdem Reporterenzyme fehlen, sind die Single-Enzym-NMR-Assays nicht anfällig für gekoppelte Fehlalarme. Dieser Vorteil macht sie nützlich als orthogonale Assays, die traditionelle Hochdurchsatz-Screening-Assays und Tischtriage-Assays5ergänzen.

In unserem Forschungslabor werden NMR-basierte Aktivitätstests verwendet, um Inhibitoren von Trichomonas vaginalis Nukleosidribohydrolasen zu identifizieren und zu bewerten. Der T. vaginalis Parasit verursacht die am weitesten verbreitete nicht-virale sexuell übertragbare Krankheit6. Die zunehmende Resistenz gegen bestehende Therapien7 treibt die Notwendigkeit neuartiger, mechanismusbasierter Behandlungen mit essentiellen Nukleosid-Rettungswegenzymen voran, die Primziele8darstellen. NMR-basierte Aktivitätsassays wurden sowohl für Pyrimidin- als auch für Purin-spezifische Enzyme, Uridinnukleosidribohydrolase (UNH)9und Adenosin/Guanosin entwickelt, die Nukleosidribohydrolase (AGNH)10bevorzugen. Die reaktionen, die durch diese beiden Enzyme katalysiert werden, sind in Abbildung 1dargestellt. Die NMR-Assays werden verwendet, um Fragmentbibliotheken auf chemische Ausgangspunkte zu untersuchen,IC-50-Werte zu bestimmen und aggregationsbasierte oder kovalente Bindungsinhibitoren auszusondern11. Die gleichen Assays werden auch übersetzt, um die Enzymaktivität in ganzen Zellen zu bewerten12.

Detaillierte Protokolle sind für anfängliche zusammengesetzte Assays bei 500 m und 250 M, Dosis-Wirkungs-Assays zur Bestimmung der IC-50-Werte, Waschmittel-Gegensieb-Assays, Jump-Dilution-Zähler-Screen-Assays und Assays in E. coli-Vollzellen vorgesehen. Die Protokolle sind allgemein auf jedes Enzym anwendbar, in dem Substrat- und Produktresonanzen beobachtet und durch NMR-Spektroskopie unterschieden werden können. Aus Gründen der Einfachheit wurden drei Annahmen getroffen. Erstens ist das Substrat nicht angegeben. Damit NMR-basierte Aktivitätstests nützlich sind, sollte die Endkonzentration des Substrats nicht mehr als das 2-3x des K m-Wertes4betragen. In den gezeigten Beispielen liegen die Endkonzentrationen von Adenosin und 5-Fluorouridin bei 100 m (Km = 54 m) bzw. 50 m (Km = 15 m). In den Protokollen entspricht die Erreichung dieser Konzentrationen 12 l 5 mM Adenosin oder 12 l mit 2,5 mM 5-Fluorouridin.

Zweitens wurde die in den Protokollen vorgesehene Enzymmenge 5 l so gewählt, dass sie der Menge entspricht, die erforderlich ist, um eine Umwandlung des Substrats in ein Produkt in 30 min zu erreichen. Diese Menge stellt in der Regel eine große Verdünnung aus einem gereinigten Enzymbestand dar, und die Verdünnung muss im Voraus für jedes Enzym bestimmt werden. Gereinigte AGNH- und UNH-Enzym-Lagerlösungen werden bei -80 °C in Aliquots gespeichert, die genügend Enzym für mehrere tausend Reaktionen liefern. Daher muss der Verdünnungsfaktor idealerweise nur alle paar Monate ermittelt oder validiert werden. Drittens ist das spezifische 1D-NMR-Experiment nicht angegeben. In den repräsentativen Ergebnissen wird 1H NMR für AGNH10 und 19F NMR für UNH9gezeigt, wobei das NMR-Experiment in den entsprechenden Referenzen beschrieben wird. Die Wahl des NMR-Experiments hängt von der enzymischen Reaktion und den verfügbaren Substraten sowie der verfügbaren NMR-Instrumentierung ab. Schließlich ist darauf hinzuweisen, dass der beschriebene versuchsweise Ansatz nicht den strengen Anforderungen der quantitativen NMR (qNMR)13,14entspricht. Im Protokoll wird eine prozentuale Reaktion anhand der relativen Intensitätsänderungen der gleichen Resonanz in jedem Spektrum bestimmt, anstatt durch die Bestimmung absoluter Konzentrationen. Dieser Ansatz eliminiert die Notwendigkeit von Änderungen an der Datenerfassung und -verarbeitung sowie für interne oder externe Standards, die für qNMR erforderlich sind.

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Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Erste Test-Compound-Assays bei 500 m und 250 m

  1. Substrat und Testverbindung auf Reaktionen vorbereiten.
    1. Bereiten Sie Lagerlösungen von Substrat (Adenosin oder 5-Fluorouridin) in Wasser und 50 mM Testverbindung in deuteriertem Dimethylsulfoxid (DMSO) vor. Siehe Einführungsabschnitt für Konzentrationen von Substratlösung zu verwenden.
    2. Fügen Sie jeweils 12 l Substrat (Adenosin oder 5-Fluorouridin) zu je vier 1,5 ml Mikrofuge-Röhren, 1–4 hinzu.
    3. Fügen Sie den Röhren 1 (0 min Kontrolle) und 4 (30 min Steuerung) 6 l deuterated DMSO hinzu. Fügen Sie Tube 2 6 l der Prüfmasse hinzu. Fügen Sie 3 l Der Prüfmasse und 3 l deuterated DMSO zu Tube 3 hinzu.
  2. Bereiten Sie eine ausreichende Reaktionsstofflösung vor.
    HINWEIS: Die Stammlösung ist für fünf Reaktionen, die jeweils 517 l Puffer, 60 l Deuteriumoxid und 5 l Enzymlösung (AGNH oder UNH) enthalten. Siehe Einführungsabschnitt für Konzentrationen von Enzymlösung zu verwenden.
    1. 2,59 ml Reaktionspuffer (50 ml Kaliumphosphat, 0,3 M KCl, pH 6,5) zu einem 15 ml konischen Rohr geben. Fügen Sie dem konischen Rohr 300 l Deuteriumoxid hinzu. Fügen Sie dem Konischen 25 L Enzymlösung (AGNH oder UNH) hinzu.
    2. Um das konische Rohr zweimal sanft umkehren, um es zu mischen.
  3. Gleichzeitig die 0 min Kontrollreaktion initiieren und löschen. Übertragen Sie 582 l der Reaktionsstocklösung in ein sauberes Mikrofugenrohr. Fügen Sie diesem Mikrofugenrohr 10 l von 1,5 M HCl hinzu. Übertragen Sie die kombinierte 592 l in Mikrofugeröhre 1. Aspirieren und geben Sie die Probe zweimal in einer langsamen, aber absichtlichen Art und Weise.
  4. Initiieren und führen Sie die restlichen drei Reaktionen in gestaffelter Weise aus. Übertragen Sie bei 0 min 582 l der Reaktionsstocklösung auf Mikrofugenrohr 2. Aspirieren und geben Sie die Probe zweimal in einer langsamen, aber absichtlichen Art und Weise. Wiederholen Sie dies in 30 s Intervallen für Mikrofugenrohre 3 und 4. Warten Sie 30 min.
  5. Quench die Reaktionen. Zum Zeitpunkt 30 min 10 l von 1,5 M HCl zu Mikrofuge 2 hinzufügen. Wiederholen Sie dies in 30 s Intervallen für Mikrofugenrohre 3 und 4. Übertragen Sie 600 l Lösung s. von jeder Mikrofuge in NMR-Röhren.
  6. Erwerben Sie ein 1D-NMR-Spektrum für jede Probe. Verarbeiten Sie die Daten, um eine korrekte Phasing- und Flat-Baseline sicherzustellen.
  7. Berechnen Sie die prozentuale Umwandlung von Substrat für Kontrollspektren.
    1. Überlagern Sie die Spektren für 0 min und 30 min Steuerungen. Skalieren Sie das Substratsignal in der 0 min-Steuerung, um der 30 min-Steuerung zu entsprechen. Beachten Sie diesen Prozentsatz.
    2. Berechnen Sie die prozentuale Umrechnung als (100 – Prozentsatz, der in Schritt 1.7.1 bestimmt wird).
  8. Berechnen Sie die prozentuale Umwandlung des Substrats für Reaktionen, die Testmasse enthalten.
    1. Überlagerungsspektren für die 0 min-Kontrolle und erste Reaktion, die die 500-M-Testverbindung enthält. Skalieren Sie das Substratsignal in der 0 min-Steuerung, um das Spektrum mit der Testverbindung abzugleichen. Beachten Sie diesen Prozentsatz. Berechnen Sie die prozentuale Konvertierung als (100 – Prozentsatz ermittelt).
    2. Wiederholen Sie dies für die zweite Reaktion, die die 250 M Testverbindung enthält.
  9. Berechnen Sie die prozentuale Reaktion und die prozentuale Hemmung für jede Konzentration der Testverbindung.
    1. Berechnen Sie die Prozentuale Reaktion als (1.8.1/1.7.2) x 100.
    2. Berechnen Sie die prozentuale Hemmung als (100 – Prozentsatz, der in Schritt 1.9.1 bestimmt wird).

2. Bestimmung der IC 50-Werte

  1. Substrat und Testverbindung auf Reaktionen vorbereiten.
    1. Bereiten Sie Lagerlösungen von Substrat (Adenosin oder 5-Fluorouridin) in Wasser und 10 mM Testverbindung in deuterated DMSO vor. Siehe Einführungsabschnitt für Konzentrationen von Substratlösung zu verwenden.
  2. Vorbereiten sie serielle Verdünnungen von 10 mM Testmasse (in deuterated DMSO).
    1. Fügen Sie 56 l deuterated DMSO zu fünf 1,5 ml Mikrofugenröhren, 1–5 hinzu.
    2. Fügen Sie 12 l 10 mM Testverbindung zu Tube 1 hinzu und tippen Sie leicht zum Mischen. Testmasse beträgt jetzt 2,5 mM.
    3. Übertragen Sie 12 l von Rohr 1 auf Rohr 2 und tippen Sie leicht zu mischen. Die Testmasse beträgt jetzt 0,63 mM. Übertragen Sie 12 l von Rohr 2 auf Tube 3 und tippen Sie leicht zu mischen. Die Testverbindung beträgt jetzt 0,16 mM. Übertragen Sie 12 l von Rohr 3 auf Tube 4 und tippen Sie leicht zu mischen. Die Testverbindung beträgt jetzt 0,04 mM. Übertragen Sie 12 l von Rohr 4 auf Tube 5 und tippen Sie leicht zu mischen. Die Testverbindung beträgt jetzt 0,01 mM.
  3. 14 1,5 ml Mikrofugenrohre auf Reaktionen vorbereiten.
    1. Fügen Sie jeweils 14 1,5 ml Mikrofugenröhren 14 1,5 ml Substrat (Adenosin oder 5-Fluorouridin) hinzu, 1-14.
    2. Fügen Sie 12 l deuterated DMSO zu den Röhren 1 (0 min Kontrolle) und 14 (30 min Kontrolle) hinzu.
    3. Fügen Sie den Röhrchen 2 und 3 12 l von 10 mM Prüfmasse hinzu. Fügen Sie den Tuben 4 und 5 12 l von 2,5 mM Testmasse hinzu. Fügen Sie den Tuben 6 und 7 12 l 0,63 mM Testmasse hinzu. Fügen Sie den Röhrchen 8 und 9 12 l 0,16 mM Testmasse hinzu. Fügen Sie den Tuben 10 und 11 12 l 0,04 mM Testmasse hinzu. Fügen Sie den Tuben 12 und 13 12 l 0,01 mM Testmasse hinzu.
  4. Bereiten Sie eine ausreichende Reaktionsstofflösung vor, um jeweils 15 Reaktionen auszuführen, die 511 l Puffer, 60 l Deuteriumoxid und 5 l Enzymlösung (AGNH oder UNH) enthalten. Siehe Einführungsabschnitt für Konzentrationen von Enzymlösung zu verwenden.
    1. 7,67 ml Reaktionspuffer (50 ml Kaliumphosphat, 0,3 M KCl, pH = 6,5) zu einem 15 ml konischen Rohr hinzufügen. Fügen Sie dem konischen Rohr 900 l Deuteriumoxid hinzu. Fügen Sie dem Konischen 75 L Enzymlösung (AGNH oder UNH) hinzu.
    2. Umsanft das konische Rohr 2x zum Mischen umkehren.
  5. Führen Sie die in den Schritten 1.3–1.9 beschriebenen Schritte (mit 576 L Reaktionsstofflösung) aus, um die prozentuale Reaktion für jede Testverbindungskonzentration zu bestimmen.
  6. Berechnen Sie den IC 50-Wert mit GraphPad Prism.
    1. Erstellen Sie eine Datentabelle, die das Protokoll der Konzentrationen von Reaktionstests (200 M, 50 M, 12,5 M, 3,13 M, 0,78 m, 0,20 m) mit der prozentualen Reaktion (jeweils zwei Werte) korreliert.
    2. Verwenden Sie eine nichtlineare Kurvenanpassung, um den IC 50-Wert und den Standardfehler zu bestimmen.

3. Detergent Counter Screen Assays bei 100 m und 50 m

  1. Substrat und Testverbindung auf Reaktionen vorbereiten.
    1. Bereiten Sie Lagerlösungen von Substrat (Adenosin oder 5-Fluorouridin) in Wasser und 10 mM Testverbindung in deuterated DMSO vor. Siehe Einführungsabschnitt für Konzentrationen von Substratlösung zu verwenden.
    2. Fügen Sie jeweils acht 1,5 ml Mikrofugenröhren 12 l Substrat (Adenosin oder 5-Fluorouridin) hinzu, 1–8.
    3. Fügen Sie den Rohren 1 und 5 (0 min Kontrollen) und 4 und 8 (30 min Kontrollen) 6 l deuterated DMSO hinzu. Fügen Sie den Röhrchen 2 und 6 6 L der Prüfmasse hinzu. Fügen Sie den Rohren 3 und 7 3 l der Prüfmasse und 3 l deuterated DMSO hinzu.
  2. Bereiten Sie eine ausreichende Reaktionsstofflösung OHNE Waschmittel vor, um fünf Reaktionen auszuführen, die jeweils 517 l Puffer, 60 l Deuteriumoxid und 5 l Enzymlösung (AGNH oder UNH) enthalten. Siehe Einführungsabschnitt für Konzentrationen von Enzymlösung zu verwenden.
    1. 2,59 ml Reaktionspuffer (50 ml Kaliumphosphat, 0,3 M KCl, pH = 6,5) zu einem 15 ml konischen Rohr geben. Fügen Sie dem konischen Rohr 300 l Deuteriumoxid hinzu. Fügen Sie dem Konischen 25 L Enzymlösung (AGNH oder UNH) hinzu.
    2. Umsanft das konische Rohr 2x zum Mischen umkehren.
  3. Bereiten Sie eine ausreichende Reaktionsstofflösung mit 0,01 % v/v Triton X-100 Reinigungsmittel vor, um fünf Reaktionen auszuführen, die jeweils 517 l Puffer, 60 l Deuteriumoxid und jeweils 5 l Enzymlösung (AGNH oder UNH) enthalten.
    1. Fügen Sie 2 l Triton X-100 Waschmittel zu 20 ml Reaktionspuffer hinzu (50 ml Kaliumphosphat, 0,3 M KCl, pH = 6,5). Waschmittellösungen müssen innerhalb von 1 Tag verwendet werden.
    2. Fügen Sie 2,59 ml Reaktionspuffer mit 0,01% Triton X-100 Reinigungsmittel zu einem 15 ml konischen Rohr hinzu. Fügen Sie dem konischen Rohr 300 l Deuteriumoxid hinzu. Fügen Sie dem Konischen 25 L Enzymlösung (AGNH oder UNH) hinzu.
    3. Umsanft das konische Rohr 2x zum Mischen umkehren.
  4. Befolgen Sie bei Tuben 1–4 mit der Reaktionsstofflösung OHNE Waschmittel die in den Schritten 1.3–1.9 beschriebenen Schritte, um die prozentuale Hemmung für jede Konzentration der Prüfmasse zu bestimmen.
  5. Befolgen Sie bei Tuben 5–8 mit der Reaktionsstofflösung MIT 0,01 % v/v Triton X-100 Die in den Schritten 1.3–1.9 beschriebenen Schritte, um die prozentuale Hemmung für jede Testverbindungskonzentration zu bestimmen.

4. Jump-Dilution-Zähler-Bildschirm-Assays

  1. Vorbereitung des Substrats und Der Prüfverbindungen auf Reaktionen
    1. Bereiten Sie Lagerlösungen von Substrat (Adenosin oder 5-Fluorouridin) in Wasser und 10 mM Testverbindung in deuterated DMSO vor. Siehe Einführungsabschnitt für Konzentrationen von Substratlösung zu verwenden.
    2. Fügen Sie 53,8 l Reaktionspuffer (50 mM Kaliumphosphat, 0,3 M KCl, pH = 6,5) zu zwei 1,5 ml Mikrofugenröhren (jeweils), 1 und 2 hinzu. Fügen Sie den Röhrchen 1 und 2 5 L Enzym (AGNH oder UNH) hinzu.
    3. Fügen Sie zwei 1,5 ml Mikrofugenröhren, 3 und 4 (jeweils) 511 l Reaktionspuffer hinzu. Fügen Sie den Rohren 3 und 4 60 l Deuteriumoxid hinzu. Fügen Sie den Röhrchen 3 und 4 5 L Enzym (AGNH oder UNH) hinzu.
    4. Fügen Sie 1,2 l deuterated DMSO zu Tube 1 (30 min Kontrolle) hinzu. Fügen Sie 1,2 l Der Prüfmasse zu Tube 2 hinzu. Fügen Sie 12 l deuterated DMSO zu Tube 3 (30 min Kontrolle) hinzu. Fügen Sie 12 l Der Prüfmasse zu Tube 4 hinzu. Inkubieren Sie für 30 min.
  2. Bereiten Sie zwei 1,5 ml Mikrofugenrohre mit Verdünnungslösung vor.
    1. Fügen Sie jeweils 468 l Reaktionspuffer zu zwei 1,5 ml Mikrofugenröhren, 5 und 6 hinzu. Fügen Sie jedem Rohr (5 und 6) 60 l Deuteriumoxid hinzu.
  3. Bereiten Sie vier 1,5 ml Mikrofugenrohre für die Reaktionen vor.
    1. Fügen Sie jeweils 12 l Substrat (Adenosin oder 5-Fluorouridin) zu vier 1,5 ml Mikrofugenröhren, 7–10 hinzu.
  4. Führen Sie Sprungverdünnungen durch und initiieren Sie die Reaktionen.
    1. 528 l Lösung von Rohr 5 auf Rohr 1 übertragen. Aspirieren und geben Sie die Probe zweimal in einer langsamen, aber absichtlichen Art und Weise. Übertragen Sie 528 l der Lösung von Rohr 6 auf Tube 2. Aspirieren und geben Sie die Probe zweimal in einer langsamen, aber absichtlichen Art und Weise.
    2. Zum Zeitpunkt 0 min 588 l Lösung von Rohr 1 auf Tube 7 übertragen. Aspirieren und geben Sie die Probe 2x in einer langsamen, aber absichtlichen Art und Weise. In 30 s Intervallen 588 l Lösung von Rohr 2 auf Rohr 8, Rohr 3 auf Rohr 9 und Rohr 4 auf Rohr 10 übertragen. Aspirieren und geben Sie die Probe zweimal in einer langsamen, aber absichtlichen Art und Weise. Warten Sie 30 min.
  5. Befolgen Sie bei Den Röhrchen 7–10 die in den Schritten 1.5–1.9 beschriebenen Schritte, um die prozentuale Hemmung für jede Konzentration der Testverbindung zu bestimmen.

5. Zusammengesetzte Assays in E. coli-Ganzenzellen

  1. Bereiten Sie 10 ml Übernachtungskultur von E. coli am Tag vor den Experimenten vor.
  2. Bereiten Sie E. coli-Zellen für NMR-Experimente vor.
    1. Zentrifugieren Sie die Zellen in 1 ml Aliquots für 10 min bei 15.000 x g.
    2. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie jedes Aliquot von Zellen in 1 ml Reaktionspuffer (50 mM Kaliumphosphat, 0,3 M KCl, pH = 6,5) durch Wirbel n. Chr. wieder aus.
  3. Folgen Sie den Abschnitten 1 oder 2 für den gewünschten Test mit den folgenden Änderungen:
    1. Ersetzen Sie 280 l Puffer in der Reaktionsstocklösung durch 280 l resuspendierte Zellen.
    2. Ersetzen Sie 5 l Enzym (AGNH oder UNH) in der Reaktionsstocklösung mit 5 l Puffer.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse für die Prüfung von zwei Verbindungen mit AGNH unter Verwendung von 1H NMR nach Abschnitt 1. Die Enzymreaktion wird am leichtesten beobachtet und quantifiziert durch das Verschwinden von Adenosin-Singlet- und Doublet-Resonanzen bei 8,48 ppm bzw. 6,09 ppm und das Auftreten einer Adenin-Singlet-Resonanz bei 8,33 ppm, wie bei der 30 min-Kontrolle beobachtet spektrum. In Gegenwart von 500 m Verbindung 1 wird kein Produkt gebildet, wie das Fehlen einer ...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die beschriebenen Protokolle sind allgemein auf viele Enzyme anwendbar, sofern die Substrate und/oder Produkte lösbare Signale im NMR-Spektrum aufweisen. Es ist jedoch entscheidend, dass die Konzentration des Substrats nahe an seinem Km-Wert liegt und hoch genug ist, um in einem NMR-Experiment innerhalb eines angemessenen Zeitrahmens nachgewiesen zu werden. Eine Substratkonzentration von nicht mehr als dem 2-3x k m-Wert ist optimal für die Erkennung von wettbewerbsorientierten, nicht wettbewe...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Dr. Dean Brown für die Bereitstellung von Verbindungen aus der AstraZeneca-Fragmentbibliothek und Dr. David Parkin für die Bereitstellung der Enzyme AGNH und UNH. Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom National Institute of Allergy and Infectious Diseases der National Institutes of Health unter der Award-Nummer R15AI128585 an B. J. S. unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar. Research wurde auch von einem Horace G. McDonell Summer Research Fellowship unterstützt, das S. N. M., einer Landesberg-Familie, verliehen wurde. Stipendium an J. A. G. und Fakultätsentwicklungsstipendien und Frederick Bettelheim Research Award von der Adelphi University an B. J. S.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AGNHGereinigtesN/ATVAG_213720
UNHGereinigtesN/ATVAG_092730
AdenosinSigmaA9251
5-FluorouridinSigmaF5130
Dimethylsulfoxid-D6Cambridge Isotope LabsDLM-10-100D, 99,9%
Kaliumphosphat einbasischSigmaP0662
Kaliumphosphat zweibasischSigmaP3786
KaliumchloridSigmaP9541
DeuteriumoxidCambridge Isotope LabsDLM-4-100D, 99,9%
SalzsäureFisher ChemicalA144212
Triton X-100SigmaX100
3-(Trimethylsilyl)propionsäure-2,2,3,3,-d4 saures Natriumsalz (TSP)Sigma269913D, 98%
2,2,2-Trifluorethanol-1,1-d2Sigma612197D, 99,5%
PipetteGilsonF123602PIPETMAN Classic P1000
PipetteGilsonF123601PIPETMAN Classic P200
PipetteGilsonF123600PIPETMAN Classic P20
MikrofugenröhrchenFisher Scientific05-408-129
Konische RöhrchenCorning352099
MikrozentrifugeEppendorf5418
Vortex-MischerFisher Scientific02215365
NMR-RöhrchenNorell502-7Oder je nach NMR
NMR-SpektrometerBrukerN/ EineAvanceIII500
Prism SoftwareGraphPad N/AVersion 5.04

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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