Messung der Proliferation von vaskulären glatten Muskelzellen mit Hilfe der Klickchemie

Zusammenfassung

Proliferation ist ein kritischer Teil der zellulären Funktion, und eine gemeinsame Auslesung verwendet, um potenzielle Toxizität von neuen Medikamenten zu bewerten. Die Messung der Proliferation ist daher ein häufig verwendeter Assay in der Zellbiologie. Hier präsentieren wir eine einfache, vielseitige Methode zur Messung der Proliferation, die in haftenden und nicht haftenden Zellen eingesetzt werden kann.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit einer Zelle, sich zu vermehren, ist integraler Bestandteil der normalen Funktion der meisten Zellen, und dysregulation der Proliferation ist das Herzstück vieler Krankheitsprozesse. Aus diesen Gründen ist die Messung der Proliferation ein gängiges Werkzeug zur Bewertung der Zellfunktion. Die Zellproliferation kann einfach durch Zählen gemessen werden; dies ist jedoch ein indirektes Mittel zur Messung der Proliferation. Ein gängiges Mittel zur direkten Erkennung von Zellen, die sich auf die Teilung vorbereiten, ist die Einbindung von markierten Nukleosidanalogien. Dazu gehören das radioaktive Nukleosid-Analog3 H-Thymidin plus nicht-radioaktive Nukleosid-Analoga wie 5-Brom-2'-Deoxyuridin (BrdU) und 5-Ethynyl-2-Deoxyuridin (EdU). Die Einbindung von EdU wird durch Klickchemie erkannt, die im Vergleich zu BrdU mehrere Vorteile hat. In diesem Bericht stellen wir ein Protokoll zur Messung der Proliferation durch die Einbeziehung von EdU zur Verfügung. Dieses Protokoll enthält Optionen für verschiedene Auslesungen, zusammen mit den Vor- und Nachteilen der einzelnen. Wir diskutieren auch Orte, an denen das Protokoll optimiert oder geändert werden kann, um den spezifischen Anforderungen des geplanten Experiments gerecht zu werden. Schließlich berühren wir die Möglichkeiten, wie dieses Basisprotokoll zur Messung anderer Zellmetaboliten geändert werden kann.

Einleitung

Proliferation ist ein kritischer Teil der Zellfunktion^1,2. Die Kontrolle der Proliferation beeinflusst normale Prozesse wie Entwicklung und pathologische Prozesse wie Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Hyperplastisches Wachstum von vaskulären glatten Muskelzellen, zum Beispiel, wird angenommen, dass ein Vorläufer der Arteriosklerose³. Veränderungen in der Zellproliferation werden auch verwendet, um die potenzielle Toxizität neuer Medikamente zu bewerten. Angesichts ihrer weitverbreiteten Wirkung ist die Messung der Proliferation eine tragende Säule vieler Laboratorien auf Zellbiolog....

Protokoll

1. Nachweis von EdU mit Fluoreszenzetikett

1. Aktienlösungen
   1. Bereiten Sie eine 5 mM EdU-Lagerlösung vor, indem Sie 12,5 mg EdU auf 10 ml doppelt destilliertes_{H2 O}hinzufügen.
   2. Bereiten Sie die Etikettierlösungskomponenten vor: 200 mM tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amin (THPTA) (100 mg in 1,15 mL H₂O), 100 mM CuSO₄ (15,95 mg in 1 mL_H2O; frisch machen), 10 mM Cy3 Picolyl-Azid (1 mg in 95,3 ml H₂O , gelagert in 5 L Aliquots bei -20 °C) und 1 M Natriumascorbat (200 mg in 1 ml_H2O; frisch machen).
   3. Resazurin-Stammlösung in einer Konzentration von 0,15 mg/ml vorbereiten. ....

Ergebnisse

In Abbildung 2zeigen wir die Ergebnisse von drei verschiedenen Experimenten zur Messung der Verbreitung von VSMC als Reaktion auf PDGF. Nach dem Anbau der Zellen in Medien, die für SMCs formuliert wurden, führten wir das Experiment in serumfreiem DMEM durch, um mögliche Auswirkungen von Serum oder Wachstumsfaktoren auf die Proliferation zu eliminieren. In Abbildung 2A vergleichen wir die Ergebnisse aus demselben Experiment mit einer fluoreszierenden vs. luminesz.......

Diskussion

Die Einbeziehung von EdU ist eine einfache, einfache Möglichkeit, die Zellproliferation zu messen; es ist besonders nützlich für anhängliche Zellen¹³. Unser Protokoll verwendet glatte Muskelzellen, aber es ist anwendbar auf jede anhängliche Zelle (epitheliale, endotheliale, etc.). Obwohl das Protokoll nicht kompliziert ist, ist der einzige entscheidende Schritt die Herstellung der Etikettierungslösung – die Zutaten müssen in der angegebenen Reihenfolge hinzugefügt werden. Darüber hinaus, wie chemi.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin	Carbosynth	NE08701
Biotin Picolylazid	Click Chemistry Tools	1167-5
CuSO4	Fisher Scientific	C1297-100G
Cy3 Picolylazid	Click Chemistry Tools	1178-1
Cytation Plate Reader	Biotek
EVOS Mikroskop	Thermo Fisher Scientific
Wasserstoffperoxid-Lösung	Sigma-Aldrich	216763
Na-Ascorbat	Sigma-Aldrich	11140-250G
NucBlue Fixzell-Färbungs-Bereitschaftssonden	Invitrogen	R37606	DAPI Nuklearfärbung
Odyssey Blockierungspuffer	Li-Cor	927-40000	Blockierungspuffer
Paraformaldehyd-Elektronenmikroskopie		Dienstleistungen 15710
PBS	Fisher Scientific	SH3002802
Natriumchlorid	Sigma Life Science	S3014-5kg
Streptavidin Meerrettichperoxidase Konjugat	Life Technologies	S911
Supersignal-ELISA Femto	Thermo Scientific	PI137075	ELISA-Substrat
Synergy Plate Reader	Biotek
THPTA	Click Chemistry Tools	1010-100
Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl)	Fisher Scientific	BP153-500
Triton X 100	Bio-Rad	1610407
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100