Methodenartikel

Messung der Proliferation von vaskulären glatten Muskelzellen mit Hilfe der Klickchemie

DOI:

10.3791/59930

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30. Oktober 2019

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1Department of Neuroscience, Cell Biology, and Physiology, Wright State University, 2Department of Surgery, Boonshoft School of Medicine, Wright State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Proliferation ist ein kritischer Teil der zellulären Funktion, und eine gemeinsame Auslesung verwendet, um potenzielle Toxizität von neuen Medikamenten zu bewerten. Die Messung der Proliferation ist daher ein häufig verwendeter Assay in der Zellbiologie. Hier präsentieren wir eine einfache, vielseitige Methode zur Messung der Proliferation, die in haftenden und nicht haftenden Zellen eingesetzt werden kann.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Fähigkeit einer Zelle, sich zu vermehren, ist integraler Bestandteil der normalen Funktion der meisten Zellen, und dysregulation der Proliferation ist das Herzstück vieler Krankheitsprozesse. Aus diesen Gründen ist die Messung der Proliferation ein gängiges Werkzeug zur Bewertung der Zellfunktion. Die Zellproliferation kann einfach durch Zählen gemessen werden; dies ist jedoch ein indirektes Mittel zur Messung der Proliferation. Ein gängiges Mittel zur direkten Erkennung von Zellen, die sich auf die Teilung vorbereiten, ist die Einbindung von markierten Nukleosidanalogien. Dazu gehören das radioaktive Nukleosid-Analog3 H-Thymidin plus nicht-radioaktive Nukleosid-Analoga wie 5-Brom-2'-Deoxyuridin (BrdU) und 5-Ethynyl-2-Deoxyuridin (EdU). Die Einbindung von EdU wird durch Klickchemie erkannt, die im Vergleich zu BrdU mehrere Vorteile hat. In diesem Bericht stellen wir ein Protokoll zur Messung der Proliferation durch die Einbeziehung von EdU zur Verfügung. Dieses Protokoll enthält Optionen für verschiedene Auslesungen, zusammen mit den Vor- und Nachteilen der einzelnen. Wir diskutieren auch Orte, an denen das Protokoll optimiert oder geändert werden kann, um den spezifischen Anforderungen des geplanten Experiments gerecht zu werden. Schließlich berühren wir die Möglichkeiten, wie dieses Basisprotokoll zur Messung anderer Zellmetaboliten geändert werden kann.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proliferation ist ein kritischer Teil der Zellfunktion1,2. Die Kontrolle der Proliferation beeinflusst normale Prozesse wie Entwicklung und pathologische Prozesse wie Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Hyperplastisches Wachstum von vaskulären glatten Muskelzellen, zum Beispiel, wird angenommen, dass ein Vorläufer der Arteriosklerose3. Veränderungen in der Zellproliferation werden auch verwendet, um die potenzielle Toxizität neuer Medikamente zu bewerten. Angesichts ihrer weitverbreiteten Wirkung ist die Messung der Proliferation eine tragende Säule vieler Laboratorien auf Zellbiologiebasis.

Die Zellproliferation kann durch einfaches Zählen von Zellen gemessen werden, wenn sich die Zellpopulation von Interesse ziemlich schnell teilt. Bei langsamer wachsenden Zellen ist die Zellanzahl möglicherweise weniger empfindlich. Die Proliferation wird oft durch die Einbindung von markierten Nukleosid-Analogen gemessen. Obwohl der Goldstandard 3H-Thymidin-Einbau ist, kommen viele Laboratorien angesichts der Verfügbarkeit neuerer, nicht-radioaktiver Alternativen von dieser Methode weg. Dazu gehören zytoplasmatische Fluoreszenzfarbstoffe, der Nachweis von Zellzyklus-assoziierten Proteinen und die Einbeziehung nicht-radioaktiver Nukleosid-Analoge wie 5-Brom-2'-Deoxyuridin (BrdU) und 5-Ethynyl-2-Deoxyuridin (EdU)4.

Zytoplasmatische Farbstoffe, wie Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidylester (CFSE), detektieren die Proliferation, da sich die Intensität des Farbstoffs jedes Mal halbiert, wenn sich die Zelle teilt5. Diese Technik wird häufig in der Durchflusszytometrie für nicht anhaftende Zellen verwendet. Es wurde nicht viel für anhängnisende Zellen verwendet, aber mit der neuen Generation von bildgebenden Plattenlesern kann sich dies ändern. Der Nachweis von Zellzyklus-assoziierten Proteinen durch Antikörper-basierte Techniken (Durchflusszytometrie, Immunhistochemie usw.) wird häufig für Gewebe oder nicht anhaftende Zellen verwendet. Diese Zellen/Gewebe müssen vor der Färbung fixiert und permeabilisiert werden. Nukleosid-Analoga BrdU und EdU ähneln sich in der Annäherung an 3H-Thymidin, jedoch ohne die Unannehmlichkeiten der Radioaktivität. Die Aufnahme von BrdU wird durch Anti-BrdU-Antikörper nachgewiesen, und daher müssen Zellen vor der Färbung fixiert und permeabilisiert werden. Darüber hinaus müssen Zellen mit DNase behandelt werden, um das BrdU-Epitop freizulegen.

Die Einbindung von EdU wird durch Klickchemie erkannt, bei der Alkyn- und Azidgruppen in Gegenwart von katalytischem Kupfer zusammen "klicken". Beide Gruppen können als biosynthetisch eingebautes Molekül oder Detektionsmolekül4dienen. Kommerziell erhältliche Nukleosid-Analoga haben die Alkyngruppe angeschlossen. Bei Proliferationstests wird daher das alkyne-funktionalisierte Nukleosid-Analog durch ein Azid nachgewiesen, das mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder einem anderen Marker konjugiert ist. Die Eingemeindung von EdU hat mehrere Vorteile gegenüber BrdU. Erstens, da Alkyn- und Azidgruppen nicht in Säugetierzellen gefunden werden, ist diese Wechselwirkung sehr spezifisch mit einem niedrigen Hintergrund6. Da beide Gruppen klein sind, müssen sich Zellen keiner DNA-Denaturierung unterziehen, um das Nukleosid-Analog zu belichten, wie es für BrdU7erforderlich ist. Schließlich ist Click Chemistry sehr vielseitig und kann für die metabolische Kennzeichnung von DNA, RNA, Protein, Fettsäuren und Kohlenhydraten8,9,10,11verwendet werden. Befindet sich das metabolisch beschriftete Ziel auf der Zelloberfläche, können lebende Zellen als12bezeichnet werden. Darüber hinaus können Zellen für immunfluoreszierende Färbung mit Antikörpern weiterverarbeitet werden.

Das folgende Protokoll beschreibt die Verwendung von EdU-Inkorporation und Klickchemie, um die Proliferation in menschlichen vaskulären glatten Muskelzellen zu messen (Abbildung 1). Wir zeigen drei verschiedene Möglichkeiten auf, wie die Integration von EdU gemessen werden kann, repräsentative Ergebnisse aus jeder und ihre Vor- und Nachteile. Die Messung der Proliferation mittels Klickchemie ist besonders nützlich für anhantibe, langsamer wachsende Zellen. Darüber hinaus ist die Morphologie der Zelle gut gepflegt und auch antikörperbasierte Färbungen können durchgeführt werden.

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Protokoll

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1. Nachweis von EdU mit Fluoreszenzetikett

  1. Aktienlösungen
    1. Bereiten Sie eine 5 mM EdU-Lagerlösung vor, indem Sie 12,5 mg EdU auf 10 ml doppelt destilliertesH2 Ohinzufügen.
    2. Bereiten Sie die Etikettierlösungskomponenten vor: 200 mM tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amin (THPTA) (100 mg in 1,15 mL H2O), 100 mM CuSO4 (15,95 mg in 1 mLH2O; frisch machen), 10 mM Cy3 Picolyl-Azid (1 mg in 95,3 ml H2O , gelagert in 5 L Aliquots bei -20 °C) und 1 M Natriumascorbat (200 mg in 1 mlH2O; frisch machen).
    3. Resazurin-Stammlösung in einer Konzentration von 0,15 mg/ml vorbereiten. Filter sterilisieren und 1 ml Aliquots bei 4 °C lagern.
      HINWEIS: Picolyl-Azid ist konjugiert mit verschiedenen Fluoren, Biotin und Meerrettichperoxidase (HRP) erhältlich.
  2. Beschriften Sie vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMC) mit EdU.
    HINWEIS: Menschliche VSMCs wurden von Iliasarterien durch Auswuchs aus explantierten Gewebestücken isoliert. Wenn in Serum freie Medien mit Insulin, Transferrin, Selen diese Zellen exprimieren VSMC Marker Smoothelin, glatte Muskel Myosin schwere Kette (SM-MHC) und SMC -actin13.
    1. Platte vaskuläre glatte Muskelzellen bei 2 x 104/ml in Dulbeccos modifiziertem Eagle es Medium (DMEM) in einer 96-Well-Platte.
      HINWEIS: Zellen werden bei 37 °C in glatten Muskelzellmedien mit 2% fetalem Rinderserum angebaut.
    2. (Optional) Lassen Sie mehrere Stunden für die Einhaltung über Nacht. Fügen Sie jedem Brunnen 20 L Resazurin-Bestände hinzu. Inkubieren bei 37 °C für 3 h. Lesen Sie das Fluoreszenzsignal in einem Plattenleser (560ex, 594em). Ersetzen Sie Medien durch frisches DMEM.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist optional. Resazurin wird verwendet, um Zellzahlen zu normalisieren und für eine gute Variabilität in der Beschichtung14zu berücksichtigen.
    3. Phosphat gepufferte Kochungskochin (PBS) oder Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF) 30 ng/ml zu 3-6 Brunnen pro Behandlung zu Beginn der Kulturperiode hinzufügen und 72 h inkubieren.
    4. 5 mM EdU-Lager auf 1 mM verdünnen. Fügen Sie jedem Brunnen (Endkonzentration 20 m) für die letzten 24 h der 72-H-Kulturperiode 2 L hinzu. Fügen Sie EdU nicht zu einem Satz von Replikationen hinzu. Diese Brunnen werden verwendet, um Die Fluoreszenz/Lumineszenz im Hintergrund zu bestimmen.
      HINWEIS: Die Dauer der Kultur und Beschriftung mit EdU ist für glatte Muskelzellen optimiert, muss jedoch möglicherweise pro Zelltyp geändert werden.
  3. Fixzellen in Paraformaldehyd (PFA).
    1. Entfernen Sie die Medien und fügen Sie 150 l 4% PFA (in PBS) pro Brunnen für 10 min bei Raumtemperatur hinzu.
    2. Entfernen Sie PFA und fügen Sie 150 l Polyethylenglykol tert-Octylphenylether (TX-100) (in Wasser) pro Brunnen für 30 min bei Raumtemperatur hinzu.
    3. Entfernen Sie TX-100, indem Sie dreimal mit PBS waschen.
      VORSICHT: PFA ist giftig, behandeln Sie mit Sorgfalt.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Feste Zellen können in PBS bei 4 °C gespeichert werden.
  4. Erkennen Sie integrierte EdU.
    1. Herstellung einer Etikettierlösung (10 ml pro 96 Wellplatte, mit inneren 60 Brunnen) kurz vor der Verwendung durch Zugabe von Reagenzien aus Lagerlösungen in der folgenden Reihenfolge: THPTA 20 l, CuSO4 20 l, Cy3 picolyl Azid 5 l, Na Ascorbat 100 l zu PBS für ein Gesamtvolumen von 10 ml.
    2. Entfernen Sie PBS aus Brunnen und fügen Sie jedem Bohrgut 150 L Etikettierlösung hinzu. 30 min bei 37 °C inkubieren. Um alle Kerne zu erkennen, fügen Sie jedem Brunnen 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) hinzu. Lesen Sie auf einem Fluoreszenzplattenleser (Cy3 550ex, 570em; DAPI 350ex, 470em) oder Bild auf einem Mikroskop.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Feste und gebeizte Zellen können in PBS bei 4 °C gelagert und zu einem späteren Zeitpunkt abgebildet werden.

2. Nachweis von EdU mittels Lumineszenz

  1. Vollständige Abschnitte 1.1–1.3.
  2. Bereiten Sie Tris-gepufferte Salin mit 0,1% Polysorbat 20 (TBST) vor.
  3. Blockieren Sie Brunnen.
    1. Fügen Sie jedem Brunnen 150 l Blockierpuffer (Materialtabelle) hinzu und brüten 90 min bei Raumtemperatur.
    2. Entfernen Sie den Sperrpuffer und waschen Sie dreimal mit 200 L PBS.
  4. Erkennen Sie integrierte EdU.
    1. Machen Sie Etikettierlösung, wie in Schritt 1.4.1 angegeben, und ersetzen Sie Biotin picolyl Azid durch Cy3 Picolyl-Azid.
    2. Waschen Sie die Brunnen fünfmal mit 200 l TBST, mit Schütteln, 3 min pro Wäsche.
    3. Endogene Peroxidasen mit 150 l von 0,3%H2O2 für 20 min bei Raumtemperatur ablöschen.
    4. H2O2 entfernen und fünfmal mit 200 L TBST waschen, mit Schütteln 3 min pro Wäsche.
    5. Verdünnung der Streptavidin-Meerrettichperoxidase (SA-HRP; 1:200) in TBST und fügen Sie jedem Brunnen 50 l hinzu. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
    6. Waschen Sie fünfmal mit 200 l TBST, mit Schütteln, 3 min pro Wäsche.
    7. Fügen Sie jedem Brunnen 50 L chemilumineszierendes enzymgebundenes Immunsorbent-Assay (ELISA)-Substrat(Tabelle der Materialien)hinzu.
    8. Lesen Sie sofort in Plattenleser in der Lage, Lumineszenz zu erkennen.

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Ergebnisse

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In Abbildung 2zeigen wir die Ergebnisse von drei verschiedenen Experimenten zur Messung der Verbreitung von VSMC als Reaktion auf PDGF. Nach dem Anbau der Zellen in Medien, die für SMCs formuliert wurden, führten wir das Experiment in serumfreiem DMEM durch, um mögliche Auswirkungen von Serum oder Wachstumsfaktoren auf die Proliferation zu eliminieren. In Abbildung 2A vergleichen wir die Ergebnisse aus demselben Experiment mit einer fluoreszierenden vs. luminesz...

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Diskussion

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Die Einbeziehung von EdU ist eine einfache, einfache Möglichkeit, die Zellproliferation zu messen; es ist besonders nützlich für anhängliche Zellen13. Unser Protokoll verwendet glatte Muskelzellen, aber es ist anwendbar auf jede anhängliche Zelle (epitheliale, endotheliale, etc.). Obwohl das Protokoll nicht kompliziert ist, ist der einzige entscheidende Schritt die Herstellung der Etikettierungslösung – die Zutaten müssen in der angegebenen Reihenfolge hinzugefügt werden. Darüber hinaus, wie chemi...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Katie Carroll für die technische Unterstützung. Wir danken auch Dr. David Cool und dem Proteomics Analysis Laboratory für die Anleitung und Bereitstellung des Cytation Imaging Plate Readers. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Wright State Foundation (an L.E.W.) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
5-Ethynyl-2'-DesoxyuridinCarbosynthNE08701
Biotin PicolylazidClick Chemistry Tools1167-5
CuSO4Fisher ScientificC1297-100G
Cy3 PicolylazidClick Chemistry Tools1178-1
Cytation Plate ReaderBiotek
EVOS MikroskopThermo Fisher Scientific
Wasserstoffperoxid-LösungSigma-Aldrich216763
Na-AscorbatSigma-Aldrich11140-250G
NucBlue Fixzell-Färbungs-BereitschaftssondenInvitrogenR37606DAPI Nuklearfärbung
Odyssey BlockierungspufferLi-Cor927-40000Blockierungspuffer
Paraformaldehyd-ElektronenmikroskopieDienstleistungen 15710
PBSFisher ScientificSH3002802
NatriumchloridSigma Life ScienceS3014-5kg
Streptavidin Meerrettichperoxidase KonjugatLife TechnologiesS911
Supersignal-ELISA FemtoThermo ScientificPI137075ELISA-Substrat
Synergy Plate ReaderBiotek
THPTAClick Chemistry Tools1010-100
Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl)Fisher ScientificBP153-500
Triton X 100Bio-Rad1610407
Tween 20Fisher ScientificBP337-100

Referenzen

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Schlagwörter

EdU ProliferationsassayClick Chemistry DetektionFluoreszenz AuslesungLumineszenz AuslesungPlatelet Derived Growth FactorParaformaldehyd FixierungTX 100 PermeabilisierungImaging Plate Readermanuelles Zellz hlen

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