Chloroplasten sind die Organellen, die Pflanzen definieren1. Neben vielen anderen metabolischen, entwicklungs- und Signalfunktionen sind Chloroplasten für die Photosynthese verantwortlich – den Prozess, bei dem Sonnenenergie genutzt wird, um die zellulären Aktivitäten des Lebens anzutreiben. Daher sind Chloroplasten nicht nur für Pflanzen, sondern auch für die Vielzahl von Ökosystemen, die von Pflanzen abhängen, und für die Landwirtschaft unerlässlich. Chloroplasten bestehen aus Tausenden verschiedener Proteine, von denen die meisten im Zellkern codiert und aus dem Zytosol importiert werden, bevor sie intern zu einem von mehreren klar unterschiedlichen intraorganellen Kompartimentengeleitet werden. Um ein umfassenderes Verständnis der Entwicklung und Funktionen von Chloroplasten zu erreichen und biotechnologische Strategien zur Manipulation von Chloroplasten zu ermöglichen, die globale Herausforderungen im Zusammenhang mit Ernährungssicherheit oder Bioenergie adressieren, wird es unerlässlich sein, die Zielsetzung, Lokalisierung und Wechselwirkungen wichtiger Chloroplastenproteine zu bestimmen. Diese Methodensammlung beschreibt eine Reihe von kritisch wichtigen und komplementären Techniken, die zur Erreichung dieser Ziele eingesetzt werden können. Die Sammlung konzentriert sich hauptsächlich auf die weit verbreitete Modellpflanze Arabidopsis thaliana (Thale-Kresse), aber die Methoden können auch angepasst und auf andere Organismen angewendet werden.
Die Sammlung enthält Beschreibungen von zwei verschiedenen Techniken zur Analyse des Imports von kerncodierten Proteinen in Chloroplasten über die Doppelmembranhülle. Der Artikel von Ling und Jarvis2 beschreibt eine in-vitro-Methode, bei der isolierte Chloroplasten mit einem radioaktiv markierten Vorläuferprotein inkubiert werden. Das Ausmaß, in dem die Chloroplasten das Vorläuferprotein aufnehmen, wird durch Überwachung der Proteingrößenänderung bestimmt, die infolge der Spaltung des Transitpeptides (Zielgruppen-Leader-Sequenz) erfolgt, mittels SDS-PAGE und Phosphorbildgebung. Die vorgestellte Methode ist eine Weiterentwicklung eines Ansatzes, der seit mehreren Jahrzehnten zur Untersuchung des Chloroplastenproteinimports in vitro verwendet wird, 3,4, und beinhaltet zusätzliche Schritte, die die Bewertung der Reaktionsfähigkeit der importierten Maschinerie auf Stressbedingungender Anlage ermöglichen. Andererseits beschreibt der Artikel von Lee et al.6 eine in-vivo-Methode, die auf der vorübergehenden Expression eines chimerischen Vorläuferproteins basiert, das eine fluoreszierende Proteindomäne trägt, in intakten Zellen (Protoplasten). In diesem Test kann das Ausmaß des Chloroplastenproteinimports auf zwei verschiedene Arten nachgefolgt werden: durch Überwachung der Lokalisierung und Intensität des Fluoreszenzsignals mittels Fluoreszenzmikroskopie; und durch die Analyse der Proteingrößenänderung, die infolge der Transitpeptidspaltung mittels Immunblotting auftritt. Diese beiden Methoden ergänzen sich sehr stark und können überzeugende Ergebnisse liefern, wenn sie gemeinsam parallelverwendet werden.
Sobald ein Protein über die Hülse in den Chloroplast importiert und sein Transitpeptid entfernt wurde, kann es entweder seine endgültige Konformation im Stroma (dem wichtigsten inneren wässrigen Kompartiment der Organelle) annehmen oder einen der verschiedenen internen Sortierwegeaktivieren 1. Als Standort der sehr häufig vorhandenen photosynthetischen Komplexe sind die Thylakoidmembranen ein wichtiger Ort für solche internen Sortierungen; Tatsächlich umfasst die Targeting von Thylakoid-Proteinen mehrere, mechanistisch unterschiedliche Wege. Der Artikel von Asher et al.7 beschreibt eine Reihe von in-vitro-Methoden, die die Untersuchung verschiedener Thylakoid-Protein-Translokationswege ermöglichen. Diese Methoden beinhalten die Inkubation isolierter Thylakoide mit radioaktiv markiertem Vorläuferprotein und in einigen Fällen einem konzentrierten stromalen Extrakt. Das Ausmaß, in dem das Protein von den Thylakoiden aufgenommen wird, wird überwacht, indem die Spaltung des Zielsignals und der Schutz des Proteins vor exogen aufgetragener Thermolysinprotease mittels SDS-PAGE und Phosphorbildgebung bewertet werden. Natürlich sind die Thylakoide nicht das einzige Subkompartiment des Chloroplasten, und es ist oft wünschenswert, auch andere Kompartimente einschätzen zu können. In diesem Zusammenhang ist der Artikel von Bouchnak et al.8 besonders wichtig, da er Methoden zur Subfraktionierung von Chloroplasten beschreibt, um hochreine Proben zu erzeugen, die den Hüllmembranen, dem Stroma und den Thylakoiden entsprechen. Nach der Herstellung können diese Fraktionen mittels Immunblotting und/oder Massenspektrometrie analysiert werden, um eine Fülle von Informationen über die suborganelle Lokalisierung von Chloroplastenproteinen9 zu liefern.
Im Hinblick auf die Analyse von Protein-Protein-Interaktionen und Multiprotein-Komplex-Assemblierungen werden in der Sammlung zwei verschiedene Methodologien beschrieben. Der Artikel von Shanmugabalaji et al.10 stellt eine Methode zur Affinitätsreinigung von Chloroplast-Multiprotein-Komplexen vor. Diese Technik beinhaltet die Analyse transgener Pflanzen, die eine Komponente des interessanten Komplexes ausdrücken, die so entwickelt wurde, dass sie ein Affinitäts-Tag (das sogenannte Tandem-Affinitäts-Reinigungs-Tag oder TAP-Tag) tragen. Die Fähigkeit dieses Tags, stark an eine ansonsten inerte Matrix zu binden, wird im Rahmen der Reinigungsstrategie genutzt. Die vorgestellte Methode konzentriert sich speziell auf die Reinigung der Chloroplastenprotein-Importmaschinerie (diese umfasst Multiproteinkomplexe namens TOC und TIC, eingebettet in die Hüllmembranen1), kann aber prinzipiell angepasst werden, um jede der anderen Multiprotein-Assemblierungen in Chloroplasten11 zu untersuchen. Der Artikel von Rantala et al.12 beschreibt einen komplementären Ansatz zur komplexen Charakterisierung, der auf Elektrophorese unter nativen Bedingungen basiert. Die hier dargestellte Technik beinhaltet die Befreiung von photosynthetischen Komplexen aus gereinigten Thylakoiden mittels mildem, nicht-ionischem Waschmittel, gefolgt von deren Trennung mit Blue Native (BN)-PAGE. Auf die primäre Auflösung der Komplexe kann unter Denaturierungsbedingungen eine zweite Dimension der Elektrophorese folgen, was die Visualisierung der einzelnen Komponenten jedes in der ersten Dimension identifizierten Komplexes ermöglicht. Wie bei der TAP-Methode kann auch dieser native PAGE-Ansatz erfolgreich angepasst werden, um andere Proteinkomplexe innerhalb der Organelle 13,14 zu untersuchen. Mit beiden Ansätzen können die gereinigten Komplexe auf verschiedene Weise analysiert werden, unter anderem durch Immunoblotting und Massenspektrometrie.
Zusammen präsentieren die in dieser Methodensammlung enthaltenen Artikel eine leistungsstarke Sammlung ergänzender Techniken, die zusammen mit bestehenden Ressourcen 15,16 eingesetzt werden können, um unser Verständnis verschiedener Aspekte der Chloroplastenbiogenese und -funktion, insbesondere jener, die eng mit dem organellaren Proteom verbunden sind, erheblich zu verbessern. Da Chloroplasten für den Großteil der Primärproduktion der terrestrischen Photosynthetik verantwortlich sind und zudem eine entscheidende Rolle in der Reaktion von Pflanzen auf die Umwelt spielen (einschließlich biotischer und abiotischer Belastungen), werden diese bemerkenswerten Organellen unweigerlich noch jahrelang ein Hauptfokus der Grundlagen- und angewandten Forschung weltweit bleiben.