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Methodenartikel

Durchführung von Human Skeletal Muscle Xenografts bei immundefizienten Mäusen

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DOI:

10.3791/59966

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16. September 2019

 ,  ,  , 
1Graduate Program in Cellular and Molecular Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Neurology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Kennedy Krieger Institute, 4Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Komplexe menschliche Krankheiten können in traditionellen Labormodellsystemen eine Herausforderung darstellen. Hier beschreiben wir einen chirurgischen Ansatz zur Modellierung menschlicher Muskelerkrankungen durch die Transplantation menschlicher Skelettmuskelbiopsien in immundefizienten Mäusen.

Zusammenfassung

Behandlungseffekte, die in Tierstudien beobachtet werden, lassen sich in klinischen Studien oft nicht rekapitulieren. Obwohl dieses Problem vielschichtigen Probleme hat, ist ein Grund für diesen Ausfall die Verwendung unzureichender Labormodelle. Es ist eine Herausforderung, komplexe menschliche Krankheiten in traditionellen Labororganismen zu modellieren, aber dieses Problem kann durch das Studium menschlicher Xenografts umgangen werden. Die chirurgische Methode, die wir hier beschreiben, ermöglicht die Schaffung von menschlichen Skelettmuskel-Xenografts, die verwendet werden können, um Muskelerkrankungen zu modellieren und präklinische therapeutische Tests durchzuführen. Im Rahmen eines von einem Institutional Review Board (IRB) zugelassenen Protokolls werden Skelettmuskelproben von Patienten erworben und dann in NOD-Rag1nullIL2r-null (NRG) Wirtsmäuse transplantiert. Diese Mäuse sind ideale Wirte für Transplantationsstudien aufgrund ihrer Unfähigkeit, reife Lymphozyten herzustellen und sind daher nicht in der Lage, zellvermittelte und humoral adaptive Immunantworten zu entwickeln. Wirtsmäuse werden mit Isofluran betäuht, und die Maus tibialis anterior und extensor digitorum longus Muskeln werden entfernt. Ein Stück menschlicher Muskeln wird dann in das leere Tibialfach gelegt und an die proximalen und distalen Sehnen des Peroneus longus Muskels vernässt. Der xenotransplantierte Muskel wird vom Mauswirt spontan vaskularisiert und innerviert, was zu robust regenerierten menschlichen Muskeln führt, die als Modell für präklinische Studien dienen können.

Einleitung

Es wurde berichtet, dass nur 13,8% aller Arzneimittelentwicklungsprogramme, die sich in klinischen Studien befinden, erfolgreich sind und zu zugelassenen Therapien führen1. Während diese Erfolgsquote höher ist als die zuvor gemeldeten 10,4%2, gibt es noch erheblichen Raum für Verbesserungen. Ein Ansatz zur Steigerung der Erfolgsrate klinischer Studien besteht darin, Labormodelle zu verbessern, die in der präklinischen Forschung verwendet werden. Die Food and Drug Administration (FDA) verlangt, dass Tierstudien die Wirksamkeit der Behandlung nachweisen und die Toxizität vor klinischen Phase-1-Studien bewerten. Allerdings gibt es oft eine begrenzte Übereinstimmung in den Behandlungsergebnissen zwischen Tierstudien und klinischen Studien3. Darüber hinaus kann die Notwendigkeit präklinischer Tierstudien ein unüberwindbares Hindernis für die therapeutische Entwicklung bei Krankheiten sein, bei denen kein akzeptiertes Tiermodell gilt, was häufig bei seltenen oder sporadischen Krankheiten der Fall ist.

Eine Möglichkeit, menschliche Krankheiten zu modellieren, besteht darin, menschliches Gewebe in immundefizizizizizizizizizizide Mäuse zu transplantieren, um Xenografts zu erzeugen. Xenograft-Modelle haben drei wesentliche Vorteile: Erstens können sie die komplexen genetischen und epigenetischen Anomalien rekapitulieren, die bei menschlichen Krankheiten existieren und in anderen Tiermodellen möglicherweise nie reproduzierbar sind. Zweitens können Xenografts verwendet werden, um seltene oder sporadische Krankheiten zu modellieren, wenn Patientenproben verfügbar sind. Drittens modellieren Xenografts die Krankheit innerhalb eines vollständigen In-vivo-Systems. Aus diesen Gründen gehen wir davon aus, dass die Wirksamkeit der Behandlung zu Xenograft-Modellen führt, die eher zu Studien bei Patienten führen. Humantumor Xenografts wurden bereits erfolgreich verwendet, um Behandlungen für häufige Krebsarten zu entwickeln, einschließlich multiples Myelom, sowie personalisierte Therapien für einzelne Patienten4,5,6, 7.

In letzter Zeit wurden Xenografts verwendet, um ein Modell der menschlichen Muskelerkrankung zu entwickeln8. In diesem Modell werden menschliche Muskelbiopsieproben in die Hinterbeine immundefizien NRG-Mäuse transplantiert, um Xenografts zu bilden. Die transplantierten menschlichen Myofiber sterben, aber menschliche Muskelstammzellen, die im Xenograft vorhanden sind, dehnen sich anschließend aus und differenzieren sich in neue menschliche Myofiber, die die transplantierte menschliche Basallamina wieder bevölkern. Daher sind die regenerierten Myofiber in diesen Xenografts vollständig menschlich und werden spontan revaskularisiert und vom Mauswirt innerviert. Wichtig ist, fascioscapulohumerale Muskeldystrophie (FSHD) Patienten Muskelgewebe in Mäuse transplantiert rekapituliert Schlüsselmerkmale der menschlichen Krankheit, nämlich Expression der DUX4 Transkriptionsfaktor8. FSHD wird durch Überexpression von DUX4 verursacht, das im normalen Muskelgewebe epigenetisch zum Schweigen gebracht wird9,10. Im FSHD Xenograft Modell hat sich gezeigt, dass die Behandlung mit einem DUX4-spezifischen Morpholino die DUX4-Expression und -Funktion erfolgreich reprimieren und eine mögliche therapeutische Option für FSHD-Patienten sein kann11. Diese Ergebnisse zeigen, dass menschliche Muskelxenografts ein neuer Ansatz sind, um menschliche Muskelerkrankungen zu modellieren und potenzielle Therapien bei Mäusen zu testen. Hier beschreiben wir detailliert die chirurgische Methode zur Schaffung menschlicher Skelettmuskel-Xenografts bei immundefizienten Mäusen.

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Protokoll

Alle Verwendung von Forschungsproben von menschlichen Probanden wurde vom Johns Hopkins Institutional Review Board (IRB) genehmigt, um die Rechte und das Wohlergehen der Teilnehmer zu schützen. Alle Tierversuche wurden vom Johns Hopkins University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health (NIH) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals genehmigt. Männliche NOD-Rag1nullIL2r-null (NRG) Wirtsmäuse (8-12 Wochen alt) werden verwendet, um Xenograft-Experimente durchzuführen. Diese Mäuse sind in belüfteten Regalen untergebracht und erhalten HEPA-gefilterte, temperierte und befeuchtete Luft sowie umgedrehtes Osmosegefiltertes hyperchloriertes Wasser. Mäuse werden mit Wasser und einer bestrahlten antibiotischen Diät (Tabelle der Materialien) ad libitum versorgt, und die Anlage bietet 14 h Licht bis 10 h Dunkelheit, wie durch den zentralen Timer gesteuert.

1. Gerätevorbereitung

  1. Erwerben Sie NOD-Rag1nullIL2r-null (NRG) Mäuse, 8-12 Wochen alt.
  2. Autoklavchirurgische Ausrüstung: Schere, Zange, Nadelhalter, chirurgische Hefter (Tisch der Materialien), Wundclips, chirurgische Tücher ( Tisch derMaterialien), und Becher (Abbildung 1A).
  3. Bereiten Sie 50 ml Muskelmedien (20% fetales Rinderserum, 2% Küken-Embryo-Extrakt, 1% Antimykotik um 1% in Hams F10 Medium) vor. Halten Sie alle Chemikalien/Medikamente/Lösungen, die für die Operation verwendet werden, bei Raumtemperatur, es sei denn, dies wird im Protokoll anders angegeben.
  4. Bereiten Sie eine 1 ml Spritze mit einer 26 G Nadel, die 3/8 Zoll lang ist, enthält 2 mg/ml Schmerz (Tabelle der Materialien), und legen Sie auf Eis. Das Schmerzmittel kann mit steriler Phosphatgepufferte Saline (PBS) auf die richtige Konzentration verdünnt werden.

2. Chirurgische Vorbereitung

  1. Erhalten Sie eine menschliche Muskelbiopsie im Rahmen eines IRB-zugelassenen Protokolls von Patienten, deren Muskeln Stärke aufweisen > 4-/5 auf der MRC-Skala (Medical Research Council)Skala 12. Legen Sie die Forschungsprobe in eine 100 mm x 15 mm Petrischale mit Muskelmedien.
    HINWEIS: Die MRC-Skala wird in der klinischen Praxis als Beurteilung der Muskelkraft verwendet, wobei 0 keine Kontraktion zeigt, 5 mit normaler Leistung und 4 (4- bis 4+) Bewegung gegen Widerstand12. Wir haben festgestellt, dass Muskeln mit leichter bis mäßiger Schwäche (MRC > 4-/5) typischerweise Krankheitspathologie zeigen, aber nicht ausgiebig durch Fettgewebe oder Fibrose ersetzt werden, die beide die Xenograft-Regeneration behindern. Im Falle von Autopsiegewebe, bei dem kein aktueller MRC-Score verfügbar ist, kann über grobe Beobachtung auf die Muskelqualität zugegriffen werden. Muskelbiopsien, die blass rosa aussehen oder große Bereiche von Fettgewebe haben, sind wahrscheinlich nicht xenograft erfolgreich.
  2. Entfernen Sie alle verbleibenden Faszien oder Fettgewebe aus der Probe mit chirurgischer Schere mit einem Stereomikroskop und Lichtquelle, um die Visualisierung zu unterstützen.
  3. Sezieren Sie die Muskelbiopsie mit einer chirurgischen Schere mit einer chirurgischen Schere mit einer Lichtquelle in ca. 7 mm x 3 mm x 3 mm Stücke. Stellen Sie sicher, dass die Fasern längs innerhalb der Probe angeordnet sind.
  4. Legen Sie die Petrischale mit seziertem Muskel auf Eis. Im Durchschnitt werden die Xenografts während der Operationen 4 Stunden lang in den Medien aufbewahrt. Biopsien wurden jedoch 24 Stunden lang vor der Xenografting in Medien gelagert, und diese Verzögerung schien sich nicht negativ auf die Transplantation oder Regeneration auszuwirken.
  5. Synthetische, nicht resorbierbare Nähte (Materialtabelle) in eine 100 mm x 15 mm Petrischale mit 70 % Ethanol geben.
  6. Richten Sie einen Dual-Prozedur-Anästhesiekreis ein: Richten Sie den Mapleson E-Atemkreis auf dem Stereomikroskop an und legen Sie die Induktionskammer in einen Biosicherheitsschrank (Abbildung 1A,B).
  7. Erhalten Sie das Gewicht der NRG-Maus, indem Sie in einem autoklavierten Becher auf einer Skala platzieren und in die Induktionskammer übertragen. Induzieren Anästhesie unter 3% Isofluran. Sobald die entsprechende Anästhesietiefe erreicht ist – gemessen anhand der Beobachtung der Atemfrequenz, Muskelentspannung und mangelnder freiwilliger Bewegung – reduzieren Sie die Verdampfereinstellung für den Rest der Operation auf 1,5%.
  8. Übertragen Sie die Maus von der Induktionskammer auf den Mapleson E Atemkreis und tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf die Augen auf.
  9. Entfernen Sie die Haare, die das tibialis anterior (TA) von Knöchel zu Knie mit einem Trimmer überlagern, gefolgt von einer 1 min Behandlung mit Haarentfernungslotion (Tabelle der Materialien) ( Abbildung2A).
  10. Desinfizieren Sie die chirurgische Stelle, indem Sie das Bein mit Povidon-Jod-Lösung abwischen. Dann das restliche Povidon-Jod mit 70% Ethanol wegwaschen.
  11. Injizieren Sie die Maus subkutan mit Analgetika, wie Carprofen, (Tabelle der Materialien) in einer Dosis von 5 mg/kg.

3. Xenograft Chirurgie

  1. Verjüngen Sie das Bein und machen Sie einen geraden Schnitt über den tibilalis anterioren (TA) Muskel mit Schere und Iriszange, die an den distalen Sehnen entsteht und unterhalb des Knies endet (Abbildung 2B).
  2. Trennen Sie die Haut von der Muskulatur mit stumpfer Sezierung mit chirurgischer Schere.
  3. Schneiden Sie das Epimysium des TA-Muskels mit einer Schere ab der Sehne und endend am Knie.
    HINWEIS: Dies ist ein sehr oberflächlicher Schnitt (weniger als 0,5 mm; Abbildung 2B, schwarze gestrichelte Linie) und die zugrunde liegende TA sollten dabei nicht beschädigt werden, da dies die Entfernung schwieriger machen würde. Bei richtiger Leistung entspannen sich die Muskelfasern sichtbar.
  4. Schneiden Sie die distale Sehne der TA mit einer Schere, greifen Sie die Sehne mit Iriszange, und ziehen Sie die TA in Richtung Knie (Abbildung 2C).
  5. Schneiden Sie die distale Sehne des Extensor digitorum longus (EDL) mit einer Schere und ziehen Sie die EDL in Richtung Knie (Abbildung 2D). Sobald die proximale Sehne des Peroneus longus (PL) Muskels sichtbar ist, entfernen Sie die EDL mit der Schere (Abbildung 2D, grün gestrichelte Linie).
  6. Entfernen Sie die TA mit der Schere(Abbildung 2D, blaue gestrichelte Linie) und verwenden Sie ein chirurgisches Tuch mit PBS und leichtem Druck, um Hämostase zu erreichen (Abbildung 2E).
  7. Fädeln Sie eine Naht durch proximalen Peroneus longus (PL) Sehne und Trimmen, so dass etwa 1,5 Zoll Faden auf beiden Seiten der Sehne (Abbildung 2F).
  8. Führen Sie die erste Hälfte eines zweihändigen chirurgischen quadratischen Knotens durch, aber ziehen Sie sich nicht fest: dies wird einen Kreis bilden. Legen Sie einen Xenograft in diesen Kreis und ziehen Sie die Schleife fest, um das Xenograft zu sichern. Vervollständigen Sie die andere Hälfte des quadratischen Knotens (Abbildung 2G,H). Dadurch wird das Xenograft an die proximale Sehne der PL anähnet.
  9. Fadennaht durch distale PL-Sehne und wiederholen Sie die quadratische Knotentechnik von Schritt 3.8, um das Xenograft an die distale Sehne zu binden (Abbildung 2H,I).
    HINWEIS: Die mediale Tarsalarterie und Vene kann in der Nähe oder auf der distalen Sehne der PL liegen. Stellen Sie keine Nähte durch oder um diese Gefäße. Es ist leicht zu erkennen, ob eine Naht unsachgemäß platziert wurde, da Gefäße blanchieren oder bluten. Entfernen Sie in diesem Fall die Naht und platzieren Sie sie an einer anderen Stelle.
  10. Ziehen Sie die Haut über den xenotransplantierten Muskel, versiegeln Sie ihn mit chirurgischem Kleber und legen Sie 2-3 chirurgische Klammern über den Schnitt (Abbildung 2J).
  11. Legen Sie die Maus in einen sauberen Käfig auf einem beheizten Pad, um sich zu erholen. Überwachen Sie die Maus bis zum vollständigen Bewusstsein und periodisch in den nächsten Tagen auf Anzeichen einer lokalen systemischen Infektion und um sicherzustellen, dass die chirurgische Stelle nicht wieder geöffnet wird.
    HINWEIS: Eine Einzeldosis Analgetika, wie in Schritt 2.11 beschrieben, ist in der Regel ausreichend zur Schmerzlinderung. Die Mäuse sollten jedoch auch auf anhaltende Schmerzen (z. B. Lahmheit, Rüschenkittel, geknickte Körperhaltung) überwacht und bei Bedarf postoperativ mit Schmerzmittel n. 24 h redosiert werden.

4. Xenograft Sammlung

HINWEIS: Xenografts werden in der Regel zwischen 4 bis 6 Monate nach der Operation gesammelt. Jedoch, Sammlungen wurden bis zu 12 Monate nach der Operation durchgeführt.

  1. Legen Sie einen überdachten Becher mit 200 ml 2-Methylbutan in eine Box mit Trockeneis für mindestens 30 min vor der Xenograft-Sammlung.
  2. Induzieren Anästhesie unter 3% Isofluran in in der Induktionskammer. Sobald die entsprechende Anästhesietiefe erreicht ist, reduzieren Sie die Verdampfereinstellung für den Rest der Operation auf 1,5%.
  3. Übertragen Sie die Maus aus der Induktionskammer auf den Mapleson E Atemkreis, der auf einem Stereomikroskop angeordnet ist.
  4. Entfernen Sie das Haar, das das tibialis vordere Haar von Knöchel zu Knie mit einem Trimmer und Haarentfernungslotion überlagert. Die Nähte, die das Xenograft an Ort und Stelle halten, können durch die Haut gesehen werden (Abbildung 3A).
  5. Verjüngen Sie das Bein herunter und verwenden Sie Scheren und Iriszangen, um die Haut über dem Xenograft zu öffnen, bis beide Nähte sichtbar sind (Abbildung 3B). Die Überlagerung der Xenograft kann entfernt werden, wie gezeigt, um die Entfernung des Xenograft szuen der Xenograft zu erleichtern.
  6. Verwenden Sie ein Skalpell zwischen dem Xenograft und der Tibia zu schneiden(Abbildung 3B, Pfeil bezeichnet anfangsstelle und Richtung des Einschnitts). Dadurch wird eine Seite des Xenografts frei.
  7. Verwenden Sie ein Skalpell zwischen dem PL-Muskel und dem Magen-Darm-Muskel zu schneiden(Abbildung 3C, incision entlang Epimysium mit Pfeil beschriftet). Die PL wird mit dem Xenograft entfernt.
  8. Unter die distale Naht und durch die distale Sehne der PL schneiden (Abbildung 3D, entlang gepunkteter Linie geschnitten).
  9. Entfernen Sie die Xenograft und PL, indem Sie die Naht mit Iriszange greifen und sie in Richtung Knie ablenken, während Sie eine Schere verwenden, um sie vom darunter liegenden Muskel wegzuschneiden (Abbildung 3E).
  10. Schneiden Sie über die proximale Naht mit der Schere, um die Xenograft und PL zu entfernen (Abbildung 3F, entlang gepunkteter Linie in 3Egeschnitten ).
  11. Legen Sie das Exemplar auf ein kleines Stück Pappe oder Kunststoff und heften Sie so nah wie möglich an den Nähten. Dehnen Sie den Muskel beim Anheften der Probe vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Faserausrichtung während des Schnappgefriervorgangs beibehalten wird. Nachdem die Stifte sicher an Ort und Stelle sind, schieben Sie den Muskel nach oben die Stifte, so dass es nur über dem Karton ruht.
    HINWEIS: Alternativ kann ein Ende des Xenografts in Tragacanth auf einem Kork montiert werden, oder es kann vollständig in optimale Schnitttemperatur (O.C.T.) Verbindung in einem Kryomold untergetaucht werden. Mit Vorsicht kann die Muskelkonformation mit beiden Methoden erhalten bleiben.
  12. Fangen Sie das Xenograft in vorgekühltem 2-Methylbutan ein.
  13. Xenograft bei -80 °C lagern.
  14. Unmittelbar nach der Xenograft-Sammlung, einschläfern Mäuse in Übereinstimmung mit American Veterinary Medical Association Richtlinien:
    1. Platzieren Sie Mäuse in einer versiegelten Kammer mit einem geeigneten Abgas-Aufräumsystem. Verwenden Sie Isofluran in einer Konzentration von 3-4%, um Anästhesie zu induzieren.
    2. Sobald die entsprechende Anästhesietiefe erreicht ist – gemessen anhand der Beobachtung der Atemfrequenz, Muskelentspannung und mangelnder freiwilliger Bewegung – erhöhen Sie die Verdampfereinstellung auf 5%, um den Tod zu induzieren. Lassen Sie die Mäuse in der Kammer für weitere 2 min nach dem Atmen beendet. Der Tod wird durch die Beobachtung bestätigt, dass sich die Mäuse nicht innerhalb von 10 min nach einer Überdosis Isofluran erholen.
    3. Schließlich führen Sie zervikale Dislokation an den Mäusen durch.
      HINWEIS: Bei bilateral xenografierten Mäusen kann das kontralaterale Xenograft für eine spätere Sammlung gespeichert werden. Um eine Überlebenssammlung durchzuführen, öffnen Sie die Haut über dem Xenograft mit einem einzigen geraden Schnitt mit chirurgischer Schere, und entfernen Sie das Xenograft, wie in den Schritten 4.6 bis 4.10 beschrieben. Dann schließen Sie die Haut über dem leeren Tibialfach mit chirurgischem Kleber und Heftklammern. Behandeln Sie die Maus mit Schmerzmittel, wie in Schritt 2.11 beschrieben und legen Sie die Maus in sauberen Käfig auf beheizten Pad zu erholen. Überwachen Sie die Maus bis zum vollständigen Bewusstsein und periodisch in den nächsten Tagen auf Anzeichen einer lokalen systemischen Infektion und um sicherzustellen, dass die chirurgische Stelle nicht wieder geöffnet wird.

5. Xenograft Immunhistochemie

  1. Verwenden Sie einen Kryostat, um 10 bis 12 m Abschnitte aus dem gesammelten Xenograft auf positiv geladene Dias zu schneiden (Tabelle der Materialien).
  2. Färbeglas mit Methanol füllen und bei -20 °C 30 min vorkühlen lassen.
  3. Legen Sie Dias in eiskaltem Methanol für 10 min, um die Xenograft-Abschnitte zu fixieren und zu durchdringen.
  4. Dias in Färbeglasungsglas legen und 3x mit Phosphatgepufferter Saline (PBS) für 5 min waschen.
  5. Block mit Anti-Maus IgG (Materialtabelle) für 2 h bei 4 °C.
  6. Blot mit primären Antikörpern, wie Spektrin, Lamin A/C, und embryonales Myosin (Materialtabelle) in PBS, ergänzt mit 2% Ziegenserum über Nacht bei 4 °C.
  7. Dias in ein Färbeglaschen geben und 3x mit Phosphatgepufferter Saline (PBS) 5 min waschen.
  8. Blot mit fluoreszierenden-dye konjugierten sekundären Antikörpern (Tabelle der Materialien) in PBS ergänzt mit 2% Ziegenserum für 1 h bei Raumtemperatur.
  9. Dias in Färbeglasungsglas legen und 3x mit Phosphatgepufferter Saline (PBS) für 5 min waschen.
  10. Legen Sie Montagemedium (Materialtabelle) über Xenografts Abschnitte, legen Sie Deckelrutsch auf der Oberseite, und verwenden Sie Nagellack, um den Coverslip zu versiegeln.

Muskeldissektionsprozess, Diagramme, die die Identifizierung von EDL-, TA- und PL-Muskeln in einer Forschungsstudie zeigen.
Abbildung 2: Xenograft-Chirurgie. (A) Das Haar wird von der chirurgischen Stelle entfernt. (B) Ein Schnitt erfolgt über das tibialis anterior (TA). Die distalen Sehnen der TA und des Extensor digitorum longus (EDL) sind mit Pfeilen gekennzeichnet. Die schwarze gestrichelte Linie zeigt an, wo das Epimysium in Schritt 3.3 geschnitten wird. (C) Die distale Sehne der TA wird geschnitten und der Muskel bis zum Knie gezogen. (D) Die Sehne der EDL wird geschnitten und die EDL bis zum Knie gezogen. Dadurch wird die proximale Sehne des peroneus longus (PL) mit einem Pfeil markiert. Gestrichelte Linien zeigen an, wo mit einer Schere geschnitten werden soll, um die EDL (grün) und PL (blau) zu entfernen. (E) Die EDL und TA werden entfernt. (F) Eine Naht wird durch die proximale Sehne der PL gelegt. (G) Das Xenograft wird im leeren Tibialfach platziert und mit einem zweihändigen chirurgischen quadratischen Knoten an die proximale PL-Sehne vernäht. (H) Eine Naht wird durch die distale Sehne der PL gelegt, mit einem Pfeil markiert, und ein weiterer zweihändiger chirurgischer quadratischer Knoten wird verwendet, um das Xenograft an die distale Sehne zu vernäht. (I) Das Xenograft ist vollständig transplantiert und an die PL vernäht. (J) Die Haut wird mit chirurgischem Kleber verschlossen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Sequenz des chirurgischen Eingriffs an Rattenhaut, die Inzision und Gewebefreilegung für die medizinische Forschung zeigt.
Abbildung 3: 4 Monate Xenograft-Sammlung. (A) Das Haar wird von der chirurgischen Stelle entfernt. Nähte sind unter der Haut sichtbar. (B) Die Überhaut des Xenografts wird entfernt. Dann wird der Xenograft mit den Iriszangen an der Distalnaht gepackt und sanft nach oben gezogen. Beginnend am Knöchel wird ein Skalpell verwendet, um entlang der Tibia zu schneiden und das Xenograft zu befreien. Der Pfeil zeigt den Beginn des Einschnitts entlang der Tibia. (C) Durch Das Ziehen des Gastrocnemius-Muskels zur Seite wird eine schwache weiße Linie von Epimysium sichtbar, die den Peroneus longus (PL) Muskel und den Gastrocnemius (durch den Pfeil dargestellt) trennt. Verwenden Sie das Skalpell entlang dieser Linie zu schneiden, um die PL von den anderen Beinmuskeln zu trennen. (D) Die rechte Seite des Xenograft, und die PL sind jetzt frei von den anderen Muskeln im Bein und sind bereit für die Entfernung. Die gestrichelte Linie zeigt an, wo mit einer chirurgischen Schere zu schneiden, um das Entfernen der Xenograft und PL. (E) Nach dem Schneiden unter der distalen Naht, lenken Sie die Xenograft in Richtung knie. Die gestrichelte Linie zeigt an, wo mit einer chirurgischen Schere geschnitten werden soll, um das Xenograft und PL aus dem Tibialfach zu entfernen. (F) Das leere Tibialfach mit dem Xenograft und PL wurde erfolgreich entfernt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Ergebnisse

Wie von Yuanfan Zhang et al. gezeigt, ist dieses chirurgische Protokoll eine einfache Methode, um menschliche Skelettmuskel Xenografts zu produzieren8. Regenerierte Xenografts werden spontan innerviert und zeigen funktionale Kontraktilität. Darüber hinaus rekapituliert Muskelxenografted von FSHD-Patienten Veränderungen in der Genexpression, die bei FSHD-Patienten beobachtet wurden8.

Nach unserer Erfahrung zeigen ca. 7 von 8 Xenografts, die aus Ko...

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Diskussion

Patienten-abgeleitete Xenografts sind eine innovative Möglichkeit, Muskelerkrankungen zu modellieren und präklinische Studien durchzuführen. Die hier beschriebene Methode zur Herstellung von Skelettmuskel-Xenografts ist schnell, unkompliziert und reproduzierbar. Einseitige Operationen können in 15 bis 25 Minuten oder bilateral in 30 bis 40 Minuten durchgeführt werden. Bilaterale Xenografts können zusätzliche experimentelle Flexibilität bieten. Zum Beispiel können Forscher eine lokalisierte Behandlung eines Xenografts dur...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Myositis Association und der Peter Buck Foundation unterstützt. Wir danken Dr. Yuanfan Zhang für den Austausch ihrer Expertise und Ausbildung in der Xenograft-Chirurgietechnik.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100 mm x 15 mm PetrischaleFisher ScientificFB0875712
2-MethylbutanFisherO3551-4
20 mm x 30 mm Mikro-DeckglasVWR48393-151
TierwaageKent ScientificSCL-1015
Antibiotisch-Antimykotische LösungCorning, Cellgro30-004-CI
AutoClip SystemF.S.T12020-00
Castroviejo NadelhalterF.S.T12565-14
Extrakt aus KükenembryonenAccurateCE650TL
CM1860 UV-KryostatLeica BiosystemsCM1860UV
Coplin FärbeglasThermo Scientific19-4
SeziernadelnFisher ScientificS13976
Trockeneis - PelletFisher ScientificNC9584462
Embryonaler Myosin-AntikörperDSHBF1.652empfohlene Konzentration 1:10
EthanolFisher Scientific459836
Fötales RinderserumGE Healthcare Life SciencesSH30071.01
Fiber-Lite MI-150Dolan-JennerMi-150
PinzetteF.S.T11295-20
Ziege Anti-Maus IgG1, Alexa Fluor 488InvitrogenA-21121empfohlene Konzentration 1:500
Ziege Anti-Maus IgG2b, AlexaFluor 594InvitrogenA-21145empfohlene Konzentration 1:500
Gummi TraganthSigmaG1128
Schinken F-10 MediumCorning10-070-CV
Histoacryl Blue Topical Skin AdhesiveTissue SealTS1050044FP
Humanspezifischer Lamin A/C AntikörperAbcamab40567Empfohlene Konzentration 1:50-1:100
Humanspezifischer Spektren-AntikörperLeica BiosystemsNCLSPEC1Empfohlene Konzentration 1:20-1:100
InduktionskammerVetEquip941444
Iris ForcepsF.S.T11066-07
Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm)EnvigoTD.06596Antibiotische Nagetierdiät zum Schutz vor Atemwegsinfektionen
IsofluranMWI Veterinary Supply502017
KimwipesKimberly-Clark34155chirurgische Tücher
Mapleson E Breathing CircuitVetEquip921412
MethanolFisher ScientificA412
Mobiles AnästhesiegerätVetEquip901805
Maus auf Maus BasicKit Vector LaboratoriesBMK-2202Maus IgG-blockierendes Reagenz
NagellackElektronenmikroskopie Sciences72180
NAIR Haarentferner Lotion/ÖlFisher ScientificNC0132811
NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) MäuseThe Jackson Laboratory0077992 bis 3 Monate alt
O.C.T. CompoundFisher Scientific23-730-571
SauerstoffAirgasOX USPEA
PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)Puffer Fisher Scientific4870500
Povidon Jod AufbereitungslösungDynarex1415
ProLong™ Goldenes Eindeckmittel mit LichtschutzFisher ScientificP10144 (ohne DAPI); P36935 (mit DAPI)
Puralube Ophthalmic SalbeDechra17033-211-38
Rimadyl (Carprofen) injizierbarPatterson Veterinary10000319chirurgisches Analgetikum, subkutan in einer Dosis von 5 mg/kg verabreicht
Skalpellklingen - #11F.S.T10011-00
Skalpellgriff - #3F.S.T10003-12
Stereo MikroskopAccu-scope3075
Superfrost Plus ObjektträgerFisher Scientific12-550-15
Nahtmaterial, synthetisch, nicht resorbierbar, 30 Zoll lang, CV-11 NadelCovidienVP-706-X
1ml Spritze (26 Gauge, 3/8 Zoll Nadel)BD Biosciences329412
TrimmerKent ScientificCL9990-KIT
Vannas Federschere, 8,0 mm SchneideF.S.T15009-08
VaporGaurd AktivkohlefilterVetEquip931401
gewickelte Clips, 9 mmF.S.T12022-09

Referenzen

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  3. Perel, P., et al. Comparison of treatment effects between animal experiments and clinical trials: systematic review. BMJ. 334, 1-6 (2007).
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