Beschrieben werden Protokolle für die hocheffiziente Genombearbeitung von murinen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) durch das CRISPR/Cas9-System zur schnellen Entwicklung von Mausmodellsystemen mit hämatopoetischen systemspezifischen Genmodifikationen.
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Methodenartikel
Lentiviral CRISPR/Cas9-Vermittelte Genombearbeitung zur Untersuchung hämatopoetischer Zellen in Krankheitsmodellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Manipulation von Genen in hämatopoetischen Stammzellen mit konventionellen Transgeneseansätzen kann zeitaufwändig, teuer und herausfordernd sein. Durch fortschritte In der Genom-Editing-Technologie und lentivirusvermittelten Transgen-Bereitstellungssystemen wird hier eine effiziente und wirtschaftliche Methode beschrieben, die Mäuse etabliert, bei denen Gene speziell in hämatopoetischen Stammzellen manipuliert werden. Lentiviren werden verwendet, um Cas9-extierende Linien-negative Knochenmarkzellen mit einer Guide-RNA (gRNA) zu transduzieren, die auf bestimmte Gene und ein rotes Fluoreszenz-Reporter-Gen (RFP) abzielt, dann werden diese Zellen in tödlich bestrahlte C57BL/6-Mäuse transplantiert. Mäuse, die mit Lentivirus transplantiert werden, die nicht zielgerichtete gRNA exdrücken, werden als Kontrollen verwendet. Die Transplantation von transduzierten hämatopoetischen Stammzellen wird durch zytometrische Durchflussanalyse von RFP-positiven Leukozyten peripheren Blutes bewertet. Mit dieser Methode können 90 % Transduktion von myeloischen Zellen und 70 % der Lymphzellen nach 4 Wochen nach der Transplantation erreicht werden. Genomische DNA wird aus RFP-positiven Blutzellen isoliert, und Teile der Ziel-Site-DNA werden durch PCR verstärkt, um die Genombearbeitung zu validieren. Dieses Protokoll bietet eine hochdurchsatzhohe Auswertung von hämatopoese-regulatorischen Genen und kann auf eine Vielzahl von Mauskrankheitsmodellen mit hämatopoetischer Zellbeteiligung erweitert werden.
Einleitung
Viele Studien in Hämatologie und Immunologie basieren auf der Verfügbarkeit von genetisch veränderten Mäusen, einschließlich konventioneller und bedingter transgener/knock-out-Mäuse, die hämatopoetische systemspezifische Cre-Treiber wie Mx1-Cre, Vav-Cre und andere verwenden. 1,2,3,4,5. Diese Strategien erfordern die Etablierung neuer Mausstämme, die zeitaufwändig und finanziell belastend sein können. Während revolutionäre Fortschritte in der Genom-Editing-Technologie die Erzeugung neuer Mausstämme in nur 3-....
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Protokoll
Alle Verfahren, die tierische Themen betreffen, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Virginia genehmigt.
1. Erzeugung und Reinigung von Lentiviruspartikeln
HINWEIS: Lentivirus-Partikel, die die optimierte Guide-RNA enthalten, können durch die detaillierten Protokolle von Addgene erzeugt werden: . Optimierte Methoden für High-Titer Lentivirus Vorbereitung und Lagerung werden an anderer Stelle diskutiert17,18. Kurz gesagt, Lentiviren we....
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Ergebnisse
Mit dem oben beschriebenen Protokoll wurden ca. 0,8-1,0 x 108 Knochenmarkzellen pro Maus erhalten. Die Anzahl der Linien-negativen Zellen, die wir erhalten, beträgt ungefähr 3 x 106 Zellen pro Maus. Typischerweise beträgt die Ausbeute von Knochenmark-Linien-negativen Zellen 4%-5% der Gesamtknochenmark-Kernzellen.
Der Chimäre der transduzierten Zellen (RFP-positiv) wird durch die Durchflusszytometrie des per.......
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Diskussion
Der Vorteil dieses Protokolls ist die Schaffung von Tiermodellen, die spezifische Mutationen in hämatopoetischen Zellen in einer schnellen und äußerst kostengünstigen Weise im Vergleich zu herkömmlichen transgenen Ansätzen der Maus beherbergen. Es wurde festgestellt, dass diese Methode die Erzeugung von Mäusen mit hämatopoetischen Zellgenmanipulationen innerhalb eines Monats ermöglicht. Es gibt mehrere wichtige Schritte in diesem Protokoll, die einer weiteren Prüfung bedürfen.
Screenin.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
S. S. wurde von einem Postdoktorandenstipendium der American Heart Association 17POST33670076 unterstützt. K. W. wurde durch die NIH-Zuschüsse R01 HL138014, R01 HL141256 und R01 HL139819 unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | Medium |
| Sulfamethoxazol und Trimethoprim Injektion | TEVA | 0703-9526-01 | |
| 1/2 cc LO-DOSE INSULINSPRITZE | EXELINT | 26028 | allgemeine Versorgung |
| 293T Zellen | ATCC | CRL-3216-- | Zelllinie |
| APC-Anti-Maus Ly6C (Klon AL-21) | BD Biosciences | 560599 | Antikörper |
| APC-Cy7-Anti-Maus CD45R (RA3-6B2) | BD Biosciences | 552094 | Antikörper |
| BD Luer-Lok Einwegspritzen, 10 ml | BD | 309604 | allgemeiner Vorrat |
| BD Microtainer Blutentnahmeröhrchen, K2EDTA hinzugefügt | BD Bioscience | 365974 | allgemeiner Vorrat |
| BD Precisionglide Nadel, 18 G | BD | 305195 | allgemeiner Vorrat |
| BD Precisionglide Nadel, 22 G | BD | 305155 | allgemeiner Vorrat |
| BV510-Anti-Maus CD8a (Klon 53-6.7) | Biolegend | 100752 | Antikörper |
| BV711-Anti-Maus CD3e (Klon 145-2C11) | Biolegend | 100349 | Antikörper |
| Kollagen aus Kalbsleder | Sigma-Aldrich | 9007-34-5 | allgemeiner Nachschub |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 Well | Millipore Sigma | CLS3471 | allgemeine Versorgung |
| CRISPR/Cas9 knock-in Mäuse | The Jackson Laboratory | 028555 | Maus |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | allgemeine Versorgung |
| Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium (DMEM) - hoher Glukosegehalt | Sigma Aldrich | D6429 | Medium |
| eBioscience 1X RBC Lysepuffer | Thermo fisher Scientific | 00-4333-57 | Lösung |
| Falcon 100 mm TC-behandelte Zellkulturschale | Life Sciences | 353003 | allgemeiner |
| Nachschub Falcon 5 mL Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden | Life Sciences | 352054 | allgemeiner Vorrat |
| Falcon 50 mL konisch Zentrifugenröhrchen | Fisher Scientific | 352098 | allgemeine |
| Versorgung Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-behandelte Multiwell-Zellkulturplatte | Life Science | 353046 | Allgemeinbedarf |
| Fisherbrand Mikrohämatokrit-Kapillarröhrchen | Thermo Fisher Scientific | 22-362566 | Allgemeinbedarf |
| Fisherbrand sterile Zellsiebe, 70 μ m | Fisher Scientific | 22363548 | allgemeine Versorgung |
| FITC-Anti-Maus CD4 (Klon RM4-5) | Invitrogen | 11-0042-85 | |
| BD Bioscience | 554655 | Solution | |
| Guide-it Compete sgRNA Screening Systems | Clontech | 632636 | Kit |
| Isothesie (Isofluran) Lösung | Henry Schein | 29404 | Lösung |
| Lenti-X qRT-PCR Titrationskit | Takara | 631235 | Kit |
| Lineage Cell Depletion Kit, Maus | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Kit |
| Millex-HV Spritzenfiltereinheit, 0,45 mm | Millipore Sigma | SLHV004SL | allgemeine Versorgung |
| PBS pH7,4 (1X) | Gibco | 10010023 | Lösung |
| PE-Cy7-Anti-Maus CD115 (Klon AFS98) | eBioscience | 25-1152-82 | Antikörper |
| PEI MAX | Polysciences | 24765-1 | Lösung |
| Penicillin-Streptomycin-Gemisch | Lonza | 17-602F | Lösung |
| PerCP-Cy5.5-Anti-Maus Ly6G (Klon 1A8) | BD Biosciences | 560602 | Antikörper |
| pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP | Addgene | 57823 | Plasmid |
| pMG2D | Addgene | 12259 | Plasmid |
| Polybren Infektions-/Transfektionsreagenz | Sigma Aldrich | TR-1003-G | Lösung |
| Polypropylen Zentrifugenröhrchen | BECKMAN COULTER | 326823 | allgemeine Versorgung |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmid |
| RadDisk – Nagetier-Bestrahlungsscheibe | Braintree Scientific | IRD-P M | allgemeine Versorgung |
| Rekombinante Maus SCF | Peprotech | 250-03 | Lösung |
| Rekombinante Maus TPO | Peprotech | 315-14 | Solution |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 09600 | Solution |
| TOPO TA Klonierungskit für die Sequenzierung mit One Shot TOP10 Chemisch kompetente E.coli | Thermo fisher Scientific | K457501 | Kit |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend | 423102 | Lösung |
Referenzen
- Sasaki, Y., et al. Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells. EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).
- Ogilvy, S., et al. Transcriptional regulation of vav, a gene expressed thro....
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Nachdrucke und Genehmigungen
