Methodenartikel

Mikrobiota-Analyse mit zweistufiger PCR- und 16S-rRNA-Gensequenzierung der nächsten Generation

DOI:

10.3791/59980

⸱

15. Oktober 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Iowa, 2Medical Scientist Training Program, University of Iowa, 3Graduate Program in Immunology, University of Iowa, 4Graduate Program in Molecular Medicine, University of Iowa

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier wird ein vereinfachtes Standard-Betriebsverfahren für die Mikrobiom-Profilierung mit 16S rRNA metagenomischer Sequenzierung und Analyse mit frei verfügbaren Werkzeugen beschrieben. Dieses Protokoll wird Forschern helfen, die neu im Mikrobiom-Bereich sind, sowie solchen, die Aktualisierungen von Methoden benötigen, um bakterielleS Profiling mit einer höheren Auflösung zu erreichen.

Zusammenfassung

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Der menschliche Darm wird von Billionen von Bakterien besiedelt, die physiologische Funktionen wie Lebensmittelstoffwechsel, Energiegewinnung und Regulierung des Immunsystems unterstützen. Die Störung des gesunden Darmmikrobioms wurde vorgeschlagen, eine Rolle bei der Entwicklung von entzündlichen Erkrankungen, einschließlich Multipler Sklerose (MS), zu spielen. Umwelt- und genetische Faktoren können die Zusammensetzung des Mikrobioms beeinflussen; Daher ist die Identifizierung mikrobieller Gemeinschaften, die mit einem Perphänotyp der Krankheit verbunden sind, der erste Schritt zur Definition der Rolle des Mikrobioms bei Gesundheit und Krankheit. Die Verwendung von 16S rRNA metagenomischer Sequenzierung zur Profilierung bakterieller Gemeinschaft hat dazu beigetragen, die Mikrobiomforschung voranzubringen. Trotz seiner breiten Verwendung gibt es kein einheitliches Protokoll für die 16S rRNA-basierte taxonomische Profiling-Analyse. Eine weitere Einschränkung ist die geringe Auflösung der taxonomischen Zuweisung aufgrund technischer Schwierigkeiten wie kleinere Sequenzierungslesevorgänge sowie die Verwendung von nur Vorwärts-Lesevorgängen (R1) in der Endanalyse aufgrund geringer Qualität von Reverse-Lesevorgängen (R2). Es bedarf einer vereinfachten Methode mit hoher Auflösung, um die bakterielle Vielfalt in einem bestimmten Bioprobe zu charakterisieren. Fortschritte in der Sequenzierungstechnologie mit der Fähigkeit, längere Lesevorgänge mit hoher Auflösung zu sequenzieren, haben dazu beigetragen, einige dieser Herausforderungen zu meistern. Die gegenwärtige Sequenzierungstechnologie in Kombination mit einer öffentlich verfügbaren metagenomischen Analysepipeline wie R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) hat dazu beigetragen, die mikrobielle Profilierung bei hoher Auflösung voranzutreiben, da DADA2 Sequenzen an der Gattung zuweisen kann. und Artenniveaus. Hier wird eine Anleitung zur Durchführung der bakteriellen Profilierung mit zweistufiger Amplifikation der V3-V4-Region des 16S rRNA-Gens beschrieben, gefolgt von einer Analyse mit frei verfügbaren Analysewerkzeugen (d. h. DADA2, Phyloseq und METAGENassist). Es wird angenommen, dass dieser einfache und vollständige Workflow als ausgezeichnetes Werkzeug für Forscher dienen wird, die an der Durchführung von Mikrobiom-Profiling-Studien interessiert sind.

Einleitung

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Mikrobiota bezieht sich auf eine Sammlung von Mikroorganismen (Bakterien, Viren, Archaeen, Bakteriophagen und Pilze), die in einer bestimmten Umgebung leben, und das Mikrobiom bezieht sich auf das kollektive Genom von ansässigen Mikroorganismen. Da Bakterien eine der häufigsten Mikroben bei Menschen und Mäusen sind, konzentriert sich diese Studie nur auf bakterielle Profilierung. Der menschliche Darm wird von Billionen von Bakterien und Hunderten von Bakterienstämmen1besiedelt. Die normale Darmmikrobiota spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung eines gesunden Zustands im Wirt durch die Regulierung von Funktionen (d. h. die Aufrechterhaltung einer intakten Darmbarriere, Nahrungsstoffwechsel, Energiehomöostase, Hemmung der Besiedlung durch pathogene Organismen, und Regulierung der Immunantworten)2,3,4,5. Kompositole Störungen der Darmmikrobiota (Darmdysbiose) wurden mit einer Reihe von menschlichen Erkrankungen in Verbindung gebracht, einschließlich Magen-Darm-Erkrankungen6, Adipositas7,8, Schlaganfall9, Krebs10, Diabetes8,11, rheumatoide Arthritis12, Allergien13, und Erkrankungen des Zentralnervensystems wie Multiple Sklerose (MS)14,15 und Alzheimer Krankheit (AD)8,16. Daher ist in den letzten Jahren das Interesse an Werkzeugen zur Identifizierung der bakterienzusammensetzung an verschiedenen Körperstandorten gestiegen. Eine zuverlässige Methode sollte Eigenschaften wie hohe Durchsatz und einfach zu bedienen, mit der Fähigkeit, bakterielle Mikrobiota mit hoher Auflösung zu klassifizieren, und kostengünstig haben.

Kulturbasierte mikrobiologische Techniken sind nicht empfindlich genug, um das komplexe Darmmikrobiom zu identifizieren und zu charakterisieren, da mehrere Darmbakterien in der Kultur nicht wachsen. Das Aufkommen der Sequenzierungs-basierten Technologie, insbesondere der 16S rRNA-basierten metagenomischen Sequenzierung, hat einige dieser Herausforderungen überwunden und die Mikrobiomforschung transformiert17. Die fortschrittliche 16S rRNA-basierte Sequenzierungstechnologie hat dazu beigetragen, eine entscheidende Rolle für das Darmmikrobiom in der menschlichen Gesundheit zu etablieren. Das Human Microbiome Project, eine Initiative 18 der Nationalen Institute für Gesundheit18, und das MetaHIT-Projekt (eine europäische Initiative)19 haben beide dazu beigetragen, einen grundlegenden Rahmen für die Mikrobiomanalyse zu schaffen. Diese Initiativen halfen, mehrere Studien in Gang zu leiten, um die Rolle des Darmmikrobioms bei der menschlichen Gesundheit und Krankheit zu bestimmen.

Eine Reihe von Gruppen haben Darmdysbiose bei Patienten mit entzündlichen Erkrankungen gezeigt12,14,15,20,21,22. Obwohl es aufgrund der Fähigkeit zu Multiplex und niedrigen Kosten weit verbreitet für taxonomisches Profiling verwendet wird, gibt es keine einheitlichen Protokolle für 16S rRNA-basierte silyische Profilerstellung. Eine weitere Einschränkung ist die geringe Auflösung der taxonomischen Zuweisung aufgrund kleinerer Sequenzierungslesevorgänge (150 bp oder 250 bp) und die Verwendung von nur Vorwärtssequenzierungslese (R1) aufgrund von Reverse-Sequenzierungslesevorgängen (R2) geringer Qualität. Fortschritte in der Sequenzierungstechnologie haben jedoch dazu beigetragen, einige dieser Herausforderungen zu überwinden, wie z. B. die Möglichkeit, längere Lesevorgänge mit Paired-End-Lesevorgängen zu sequenzieren (z. B. Illumina MiSeq 2x300bp).

Die derzeitige Sequenzierungstechnologie kann 600 bp gute Lesequalität sequenzieren, was das Zusammenführen von R1- und R2-Lesevorgängen ermöglicht. Diese zusammengeführten längeren R1- und R2-Lesevorgänge ermöglichen bessere taxonomische Zuweisungen, insbesondere mit offener R-basierter Stritten-Amplicon-Denoising-Algorithmus-2-Plattform (DADA2). DADA2 verwendet Amplicon-Sequenzvarianten (ASV)-basierte Zuweisungen anstelle von Operativen taxonomischen Einheiten (OTU)-Zuweisungen basierend auf 97% Ähnlichkeit, die von QIIME23verwendet wird. ASV-Matches ergeben eine exakte Sequenzübereinstimmung in der Datenbank innerhalb von 1:2-Nukleotiden, was zu einer Zuordnung auf Gattungs- und Artenebene führt. Daher haben die Kombination aus längeren, qualitativ hochwertigen Paired-End-Lesevorgängen und besseren taxonomischen Zuweisungswerkzeugen (wie DADA2) Mikrobiomstudien transformiert.

Hier ist eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Durchführung von bakteriellen Profilierung mit zweistufiger Verstärkung der V3-V4-Region von 16S rRNA und Datenanalyse mit DADA2, Phyloseq und METAGENassist Pipelines. Für diese Studie werden transgene Mäuse des humanen Leukozytenantigens (HLA) der Klasse II verwendet, da bestimmte ÖsA-Klasse-II-Allele mit einer Veranlagung für Autoimmunerkrankungen wie MS20,24,25verbunden sind. Die Bedeutung von HLA-Genen der Klasse II bei der Regulierung der Zusammensetzung von Darmmikrobiota ist jedoch unbekannt. Es wird vermutet, dass das Molekül der HLA-Klasse II die mikrobielle Darmgemeinschaft beeinflussen wird, indem es für bestimmte Bakterien ausgewählt wird. Major Histocompatibility Complex (MHC) Class II Knockout Mäuse (AE.KO) oder Mäuse, die menschliche HLA-DQ8 Moleküle (HLA-DQ8)24,25,26 verwendeten, um die Bedeutung von HLA-Klasse-II-Molekülen in die Mikrobengemeinschaft des Darms zu formen. Es wird angenommen, dass dieser vollständige und vereinfachte Workflow mit R-basierter Datenanalyse als ausgezeichnetes Werkzeug für Forscher dienen wird, die an der Durchführung von Mikrobiom-Profiling-Studien interessiert sind.

Die Generation von Mäusen ohne endogene murine MHC-Genen der Klasse II (AE.KO) und AE-/-. HLA-DQA1*0103, DQB1*0302 (HLA-DQ8) transgene Mäuse mit einem C57BL/6J Hintergrund wurden zuvor26beschrieben. Fäkalproben werden von Mäusen beiderlei Geschlechts (8-12 Wochen alt) entnommen. Mäuse wurden zuvor in der Tieranlage der University of Iowa gemäß den NIH- und institutionellen Richtlinien gezüchtet und gepflegt. Kontaminationskontrollstrategien wie das Entwöhnen der Mäuse in einem laminaren Strömungsschrank, der Wechsel von Handschuhen zwischen verschiedenen Mäusestämmen und die ordnungsgemäße Pflege von Mäusen sind entscheidende Schritte für die Profilierung von Darmmikrobiom.

Die richtige persönliche Schutzausrüstung (PSA) wird während des gesamten Eingriffs dringend empfohlen. Bei der Durchführung von DNA-Isolation, PCR1- und PCR2-Verstärkung und Sequenzierungsschritten sollten geeignete negative Kontrollen einbezogen werden. Die Verwendung von sterilen, DNase-freien, RNase-freien und pyrogenfreien Vorräten wird empfohlen. Ausgewiesener Pipettiertor für Mikrobiomarbeit und gefilterte Pipettenspitzen sollten im gesamten Protokoll verwendet werden. Die Mikrobiota-Analyse besteht aus sieben Schritten: 1) Sammlung und Verarbeitung von Fäkalienproben; 2) Extraktion von DNA; 3) 16S rRNA Genverstärkung; 4) DNA-Bibliotheksbau mit indizierter PCR; 5) Bereinigung und Quantifizierung der indizierten PCR (Bibliothek); 6) MiSeq-Sequenzierung; und 7) Datenverarbeitung und Sequenzanalyse. Ein schematisches Diagramm aller Protokollschritte ist in Abbildung 1dargestellt.

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Protokoll

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Das Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Iowa genehmigt.

1. Fäkale Probensammlung und -handhabung

  1. Sterilisieren Sie die Trennkästen (siehe Materialtabelle, Zusatzabbildung 1) mit 70% Ethanol.
  2. Voretikette Mikrozentrifugenröhrchen (eine pro Maus) mit der Proben-ID und der Behandlungsgruppe (falls zutreffend).
  3. Legen Sie die Mäuse in sterilisierte Trennkästen und lassen Sie sie normal für bis zu 1 h defecate.
  4. Sammeln Sie die Fäkalienpellets in einem leeren, vorbeschrifteten 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit sterilen Zangen und schließen Sie das Rohr sicher. Sterilisieren Sie die Zange nach dem Sammeln von jeder Maus.
  5. Legen Sie das Mikrozentrifugenrohr mit Fäkalienpellets bis zur Weiterverarbeitung in einen -80 °C-Gefrierschrank.
    HINWEIS: Die Trennkästen sind von Vorteil, da sie die gleichzeitige Entnahme von Fäkalienproben von mehreren Mäusen (bis zu 12) gleichzeitig ermöglichen.

2. Dna-Extraktion

  1. Entfernen Sie die Fäkalienproben (Maus oder Mensch) aus dem Gefrierschrank und tauen Sie bei Raumtemperatur (RT).
    HINWEIS: Es ist ratsam, menschliche Stuhlproben über Nacht bei 4 °C aufzutauen, wenn dies erforderlich ist, um 200 mg oder die erforderliche Menge aus Lagerproben zu sammeln.
  2. Verwenden Sie 200 mg Ausgangsstoffe und elute DNA zu einem Endvolumen von 50 l.
  3. Fügen Sie ein DNA-Isolationskit leer ein, in dem keine Fäkalienprobe hinzugefügt wird, sondern durch alle DNA-Extraktionsschritte verarbeitet wird.
    HINWEIS: Es wurde ein spezielles DNA-Isolationskit (siehe Materialtabelle)verwendet, da es spezifische Reagenzien enthält, um hemmende Materialien wie Biofeststoffe, unverdautes Pflanzenmaterial und Hämverbindungen aus lysierten roten Blutkörperchen im menschlichen und Mausstuhl zu entfernen. Proben.
  4. Legen Sie das Perlenrohr in einen Homogenisator (siehe Materialtabelle) und homogenisieren Sie die Proben für 45 s bei RT und einer Geschwindigkeit von 4,5 m/s.
    HINWEIS: Es können Perlenschlagenhomogenisator von jedem Hersteller verwendet werden. Es wird jedoch empfohlen, die Methode, insbesondere die Geschwindigkeit und Dauer der Homogenisierung, zu standardisieren, wenn Sie den Adad-beating Homogenisator eines anderen Anbieters verwenden.
  5. Isolieren Sie DNA aus einzelnen Mausfäkalienproben mit einem bakteriellen DNA-Isolationskit nach dem Herstellerprotokoll (siehe Tabelle der Materialien) mit geringfügigen Modifikationen. Quantifizieren Sie die isolierte DNA, indem Sie 1 l der DNA auf ein Fluorimeter oder auf den hochempfindlichen Elektrophoresechip laden (siehe Tabelle der Materialien).
    HINWEIS: Die erwartete Ausbeute an DNA kann zwischen 500 und 2.500 ng liegen, wenn sie mit 200 mg der Fäkalienprobe beginnt.
  6. Stellen Sie die DNA-Konzentration mithilfe des Elutionspuffers auf 4–20 ng/L ein. Requantifizieren Sie die DNA (wie in Schritt 2.5) vor dem Fortfahren zur 16S rRNA Genverstärkung (PCR1), wenn PCR1 nicht am selben Tag durchgeführt wird.

3. 16S rRNA Genverstärkung (PCR1)

  1. Richten Sie die 16S rRNA Genverstärkung (PCR1) in einer 96-Well-PCR-Platte mit einem Reaktionsvolumen von 25 l ein.
  2. Fügen Sie mit einer Mehrkanalpipette zusätzlich zu den dNTPs (siehe Tabelle der Materialien) 12,5 l des 2x High-Fidelity-Polymerase-Enzymmixes inklusive Puffer hinzu (siehe Tabelle der Materialien):40 ng DNA in bis zu 10,5 l Gesamtvolumen (anpassen sie das Gesamtvolumen mit PCR-Wasser): 1 l (jeweils) vorwärts und Reverse Primer bei einer Konzentration von 1 M.
    HINWEIS: Die Sequenzen der Primer sind wie folgt:
    Vorwärtsgrundierung = 5'-TCGTCGGCAGCGTCA GATGTGTATAAGAGA CAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3' Reverse Primer = 5'-GTCTTGGGCTCGGAGATGTGTA TAAGAGACAGGACTACHVGGGTCTCTAATC C-3'. Fügen Sie einen Kit-Rohling aus Schritt 2.3 (Kit-Reagenz-Steuerung) in die PCR-Platte ein.
  3. PCR-Platte und Zentrifuge bei 1.000 x g bei 20 °C für 1 min in einer Tischplattenzentrifuge versiegeln (siehe Materialtabelle) und PCR in einem thermocycler durchführen, der für: 95 °C für 3 min programmiert ist; 25 Zyklen von 1) 95 °C für 30 s, 2) 55 °C für 30 s, 3) 72 °C für 30 s; Endverlängerung bei 72 °C für 5 min; und halten Sie bei 4 °C.
    HINWEIS: Obwohl diese 16S rRNA Genverstärkungsmethode mit verschiedenen Arten von Biospecimenn funktionieren sollte, wird empfohlen, die Anzahl der Amplifikationszyklen zu standardisieren, wenn ein neues Projekt gestartet wird.
  4. Bestätigen Sie die Größe des PCR1-Produkts, indem Sie 1 l der DNA auf einen hochempfindlichen Elektrophorese-Chip laden. Alternativ können Sie 5 l 16S rRNA-verstärktes Produkt auf einem 1,5%igen Agaro-Gel ausführen, um 550 bp des PCR1-Produkts zu bestätigen.
    HINWEIS: Die Reinigung des 16S rRNA-verstärkten Produkts ist optional und hängt vom verwendeten DNA-Isolationskit/-Verfahren ab. Bei Verwendung einer internen DNA-Isolationsmethode kann das PCR1-Produkt mit einem Mikrobiom-DNA-Reinigungskit gemäß dem Herstellerprotokoll gereinigt werden (siehe Tabelle der Materialien). Das hier verwendete DNA-Isolationskit liefert eine ultrareine DNA und erfordert keine Reinigung des PCR1-Produkts.

4. DNA-Bibliotheksbau mit indizierter PCR (PCR2)

  1. Platzieren Sie die Barcode-Primer Index 1 und Index 2 in einem speziellen Rack (siehe Materialtabelle) für 96 Bibliotheken.
    1. Ordnen Sie Index 1 Primer in den Spalten 1–12 und Index 2 in den Zeilen A–H des speziellen Racks an.
    2. Fügen Sie in den Spalten 1–12 2,5 l Index 1 und Index 2 in den Zeilen A–H mithilfe von Mehrkanalpipetten hinzu. Platzieren Sie die neue Kappe (siehe Materialtabelle) auf Index 1 und Index 2 Adopter Primer und lagern Sie sie in einem Gefrierschrank von -20 °C.
  2. Fügen Sie mit einer Mehrkanalpipette zusätzlich zu den dNTPs 12,5 l 2x Hochtreue-Polymerase-Enzym-Mix hinzu, der einen Puffer enthält(siehe Tabelle der Materialien); 5 l PCR-Wasser und 2,5 l 16S rRNA-verstärktes Produkt.
    HINWEIS: Fügen Sie jedem Beispiel eindeutige Indizes für das Multiplexing von mehr als 96 Bibliotheken in einem einzigen Durchlauf hinzu, wie in Kiernan et al.27beschrieben. Das vorliegende Protokoll verwendet Adapter aus einem kommerziellen Kit (z. B. Nextera XT Index Kit) gemäß der Anweisung des Herstellers in der 16S-Metagenomics-Sequenzierungsmethode (z. B. Illumina).
  3. Versiegeln und zentrifugieren Sie die indizierte PCR-Platte bei 1.000 x g bei 20 °C für 1 min und führen Sie PCR in einem thermo cycler aus, der für: 95 °C für 3 min programmiert ist; 8 Zyklen von 1) 95 °C für 30 s, 2) 55 °C für 30 s, 3) 72 °C für 30 s; und Endverlängerung bei 72 °C für 5 min.
  4. Bestätigen Sie die 630-Basisgröße des indizierten PCR-Produkts, indem Sie 1 L DNA auf einen hochempfindlichen Elektrophorese-Chip laden. Alternativ können Sie 5 l indiziertes PCR-Produkt auf einem 1,5%-Agaro-Gel ausführen, um die Größe und Intensität des Produkts zu bestätigen.

5. Bereinigung der indizierten PCR (PCR2) und Quantifizierung

  1. Pool 5 l PCR2-Amplicon mit Mehrkanalpipetten aus jedem Bohrplatz in ein Mehrkanal-Reservoir-Tray frei von nachweisbaren DNase, RNase, menschlicher DNA und pyrogenen Bakterien (siehe Tabelle der Materialien).
  2. Übertragen Sie das gepoolte Produkt aus dem Mehrkanal-Reservoir-Tray in ein leeres, vorbeschriftetes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und Wirbel zum Mischen.
  3. Reinigen Sie PCR2-Produkt mit Standard-Magnetperlen-Kit(siehe Tabelle der Materialien) nach der Anweisung des Herstellers. Versiegeln und lagern Sie die restlichen 20 l PCR2 bei Bedarf bei -80 °C in derselben Platte.
  4. Bereiten Sie frisches 80% Ethanol vor, indem Sie 4 ml 100% Ethanol zu 1 ml PCR-Wasser hinzufügen.
  5. Equilibrate die magnetische Perle zu RT und Wirbel für 30 s, um die Perlen gleichmäßig zu dispergieren.
  6. Kurz wirbeln und drehen Sie die gepoolten PCR2-Ampliconproben herunter.
  7. Fügen Sie 80 l magnetische Perlen in ein vorbeschriftetes, steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit 80 l gepoolten PCR-Produkten, dann Wirbel und drehen Sie sich kurz, um die magnetischen Perlen gleichmäßig wieder aufzuhängen.
  8. Inkubieren Sie den Inhalt bei RT, ohne die Rohre 15 min zu stören.
  9. Legen Sie die Röhre mit der DNA und magnetischen Perlen auf einem magnetischen Ständer(siehe Tabelle der Materialien) für 5 min.
  10. Entfernen und entsorgen Sie 150 L des Überstandes vorsichtig.
  11. Fügen Sie 200 l frisch zubereitetes 80% Ethanol hinzu, ohne die Perlen zu stören und 30 s zu brüten.
  12. Entfernen Sie vorsichtig, und entsorgen Sie alle Überstand.
  13. Wiederholen Sie die Schritte 5.11–5.12. Entfernen Sie das restliche Volumen mit einer P10 Pipette. Lassen Sie die Perlen 15 min lufttrocknen, wobei das Index-PCR-Rohr auf dem magnetischen Ständer verbleibt.
  14. Aus dem magnetischen Ständer entfernen. Fügen Sie 33 l Elutionspuffer hinzu (Elutionspuffer des DNA-Kits ist akzeptabel). Vortex gut, und führen Sie eine schnelle Drehung, um alle verbleibenden Flüssigkeit auf der Seite zu entfernen. 2 min inkubieren und 5 min auf den Magnetischen Ständer stellen.
  15. Übertragen Sie 30 l des Überstandes (saubere PCR-Produkte) auf ein vorbeschriftetes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
  16. Quantifizieren Sie den gereinigten Pool, indem Sie 1 l des gereinigten Beckens auf einen Fluorimeter- oder hochempfindlichen Elektrophoresechip laden, da dies bei der Sequenzierung erforderlich ist. Führen Sie MiSeq wie unten beschrieben aus.

6. MiSeq-Sequenzierung

  1. Erstellen Sie ein Beispielblatt mit beispielspezifischen Barcodeinformationen für den Metagenomik-Workflow und die Entmultiplexing auf dem MiSeq-Instrument(siehe Tabelle der Materialien). Laden Sie dieses Beispielblatt in die Software hoch (z. B. Illumina Experiment Manager).
  2. Verdünnen Sie die gepoolten Bibliotheken von Schritt 5.15 auf 4 nM.
  3. Denaturierte Bibliotheken, indem 5 l des 4 nM Bibliothekspools mit 5 l frisch zubereiteten 0,2 M NaOH in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr kombiniert werden. Wirbel kurz mischen, kurz zentrifugieren und 5 min bei Ambient RT inkubieren.
  4. Fügen Sie 990 L eiskalten Hybridisierungspuffer (HB-Puffer) und Pipette sanft zu mischen. Dies ergibt eine 20 pM-Bibliothek.
  5. Kombinieren Sie 2 l der 10 nM-Steuerbibliothek mit 3 l EBT-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH = 8,5, mit 0,1% Tween 20), um eine 4 nM-Steuerbibliothek zu erhalten. Fügen Sie 5 l frisch zubereitete 0,2 N NaOH und Wirbel kurz zu mischen. 5 min bei RT inkubieren.
  6. Fügen Sie 990 L Eiskalt-Hybridisierungspuffer (HB-Puffer) und Pipette sanft zu mischen. Dadurch ergeben sich 20 pM-Steuerelementbibliotheken.
    HINWEIS: Denaturierte 20 pM-Steuerbibliotheken können bei -20 °C bis zu 4 Wochen gespeichert werden. Nach 4 Wochen nehmen die Clusterzahlen tendenziell ab.
    1. Kombinieren Sie 210 l der 20 pM-Bibliothek mit 40 l der 20 pM-Steuerbibliothek (Endkonzentration = 18 %), und fügen Sie 350 L HB-Puffer hinzu. Laden Sie die Bibliothek bei einer endletzten Konzentration von 7 pM.
      HINWEIS: Eingabedetails sollten je Laufleistung angepasst werden.
  7. Proben für 2 min bei 96 °C inkubieren. 5 min auf Eis legen. Laden Sie 600 l des Endbeckens in den entsprechenden Brunnen der MiSeq-Patronen.
    HINWEIS: Abschnitt 6 oben kann in einer genomischen/DNA-Kernanlage durchgeführt werden.

7. Datenverarbeitung und Sequenzanalyse

  1. Verwenden Sie die R-Software (Version 3.5) für die DADA2-Datenverarbeitung und -Analyse. Verwenden Sie für die Schritte 7.1–7.4 die Open-Access-Software, wie sie im zuvor entwickelten DADA2-Online-Tutorial unter beschrieben ist.
    HINWEIS: Ein leicht verwendbares R-Skript wurde als Zusatzdatei 2angehängt, und Benutzer müssen den Namen und die Quelle von Sequenzierungsdateien ändern (z. B. SAMPLENAME_R1_001.fastq und SAMPLENAME_R2_001.fastq).
  2. Visualisieren Sie die Qualitätsprofile der Vorwärts- und Rückwärtslesevorgänge mit dem Befehl plotQualityProfile.
  3. Nukleotide von vorwärts und rückwärts lesen basierend auf der Qualitätsdiagramm. Diese Parameter werden durch den Parameter truncLen in DADA2 angegeben.
    HINWEIS: Hier wird 280 als Längenschwellenwert verwendet, für den die Vorwärtslesevorgänge verworfen werden, und 260 wird als Längenschwellenwert verwendet, für den die umgekehrten Lesevorgänge verworfen würden.
  4. Verarbeiten Sie die 16S-Rohdaten als Fastq-Dateien der DADA2-Pipeline, wie im Online-Tutorial beschrieben (gefunden unter ), um R1- und R2-Lese- und Formular-Amplicon-Sequenzvarianten (ASVs) zusammenzuführen, die dann zum Zuweisen von Amplicon-Sequenzvarianten (ASVs) verwendet werden. taxa mit der Silva-Referenzdatenbank23.
    HINWEIS: Eine aus der DADA2-Pipeline generierte Beispiel-Amplicon-Sequenz-Variantentabelle ist als Zusatzdatei 3enthalten. Es kann entweder eine Greengene- oder Silva-Referenzdatenbank verwendet werden, da mit einer dieser Datenbanken keine Unterschiede in der bakteriellen Klassifizierung gefunden wurden.
  5. Generieren Sie eine benutzerdefinierte Zuordnungsdatei, die die Metadaten (d. h. Genotyp, Geschlecht, Behandlung usw.) für jedes Beispiel enthält. Eine Beispielmetadatendatei wurde als Ergänzungsdatei 4enthalten.
  6. Berechnen Sie alpha diversity (Shannon index) und beta diversity using principal coordinates analysis (PCA) based on the rarefied OTU counts using Phyloseq28 as outlined in the online tutorial, found at .
  7. Führen Sie die folgende Analyse in METAGENassist29durch.
    HINWEIS:     Führen Sie die Differential-Überflussanalyse mit dem Wilcoxon-Rangsummentest auf Gattungsebene durch. Heatmaps und differenziell reichlich Taxa werden mit METAGENassist29, einer öffentlich zugänglichen und webbasierten Analysepipeline, hervorgehoben.
    1. Laden Sie die taxonomische Häufigkeitstabelle (CSV-Format) hoch, und wählen Sie Samples in der Spalteaus.
    2. Laden Sie die Zuordnungsdatei (CSV-Format) hoch, und wählen Sie Samples in einer Zeileaus.
    3. Wählen Sie Optionen aus, um Variablen mit mehr als 50 % Nullen zu entfernen und nicht zugewiesene und nicht zugeordnete Lesevorgänge auszuschließen.
    4. Wählen Sie Optionen zum Normalisieren von Zeilen nach Summe und Protokollieren von Normalisierungsspalten aus.
    5. Erstellen Sie ein Volcano-, PCA- oder PLSDA-Diagramm, indem Sie in der linken Spalte auf dasselbe klicken und auf Samplesname entfernen klicken, um das Diagramm zu erstellen.
    6. Führen Sie einen t-Test(wenn nur zwei Gruppen) oder ANOVA (wenn größer als zwei Gruppen) durch, um die Features (Bakterien) zu visualisieren, die sich zwischen Den Gruppen unterscheiden. Klicken Sie auf Ausgewählte Features, um bestimmte Bakterien zu visualisieren, die sich von Gruppen zu Gruppen unterscheiden.
    7. Klicken Sie auf Dendrogram oder Heat Map, um entsprechende Diagramme zu erstellen. Zusätzliche Analysen, z. B. Beispielvisualisierung nach Gruppen oder t-test/ANOVA-basierte Top 25-Features, können durchgeführt werden.
    8. Klicken Sie auf RandomForest, um Diagramme mit Features zu erstellen, die für die Klassifizierung verwendet werden können. Klicken Sie oben auf die Registerkarte Varianz, um Diagramme für die obersten Features zu erstellen, die sich zwischen/zwischen Gruppen unterscheiden. Klicken Sie auf Feature-Details, um eine Liste der Bakterien anzuzeigen, die sich zwischen Den Gruppen unterscheiden, und klicken Sie auf jedes Bakterium, um eine grafische Zusammenfassung desselben zu erstellen.
    9. Klicken Sie oben auf die Registerkarte Ausreißer, um Beispiele zu visualisieren, die Ausreißer sind.
    10. Klicken Sie schließlich auf Herunterladen und wählen Sie entweder 1) eine ZIP-Datei mit allen durchgeführten Analysen oder 2) die gewünschten Funktionen zum Herunterladen aus. Diese Datei sollte als eindeutiger Name gespeichert werden und muss vor der Verwendung entpackt werden.

HINWEIS: Detaillierte statistische Tests, die während der Mikrobiomanalyse durchgeführt wurden, finden Sie in den Werken von Chen et al. und Hugerth et al.14,30.

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Ergebnisse

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Da MHC-Klasse-II-Moleküle (HLA beim Menschen) zentrale Akteure in der adaptiven Immunantwort sind und starke Assoziationen mit einer Veranlagung zu MS24,25,26aufweisen, wurde vermutet, dass das Molekül der HLA-Klasse II würde die mikrobielle Zusammensetzung des Darms beeinflussen. Daher wurden Mäuse, denen das Gen der MHC-Klasse II (AE.KO) oder das exmittierte menschliche HLA-DQ8-Gen (HLA-DQ8) fehlten, verwendet, um die Bedeutun...

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Diskussion

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Das beschriebene Protokoll ist einfach, mit einfach zu befolgenden Schritten, um Mikrobiom-Profiling mit 16S rRNA metagenomische Sequenzierung aus einer großen Anzahl von Biospecimenn von Interesse durchzuführen. Die Sequenzierung der nächsten Generation hat mikrobielle Ökologiestudien transformiert, insbesondere in den Modellen für menschliche und präklinische Krankheiten31,32. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Fähigkeit, komplexe mikrobielle Zusammensetz...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A. M. erhielt Lizenzgebühren von der Mayo Clinic (bezahlt von Evelo Biosciences) als einer der Erfinder einer Technologie, die die Verwendung von Prevotella histicola zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen beansprucht.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren würdigen die Finanzierung durch das NIAID/NIH (1R01AI137075-01), den Carver Trust Medical Research Initiative Grant und das University of Iowa Environmental Health Sciences Research Center, NIEHS/NIH (P30 ES005605).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 mL Natürliches MikrozentrifugenröhrchenUSA, Scientific1615-5500Stuhlsammlung
3M Handapplikator Rakel PA1-G3M, MN, USRakel für die korrekte Versiegelung der PCR-Platte
Agencourt AMPure XPBeckman Coulter, IN, USAA63880PCR-Reinigung, NGS-Reinigung, PCR-Reinigung
Agilent DNA 1000 REAGENTAgilent Technologies, CA, USA5067-1504DNA-Quantifizierung und Qualitätskontrolle
Bioanalysator DNA 1000Chip Agilent Technologies, CA, USA5067-1504DNA-Quantifizierung und Qualitätskontrolle
Index Adopter ErsatzkappenIllumina, Inc., CA, USA15026762Neue Kappe für Index 1 und 2 Adopter Primer
DNeasy PowerLyzer PowerSoil KitMoBio jetzt Teil von QIAGEN, Valencia, CA, USA12855-100DNA Isolierung
KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2x)Kapa Biosystem, MA, USAKK2602PCR-Fertigmischung für Amplicon PCR1 und indizierte PCR2
Lewis DividerBoxen Lewis Bins, WI, USND03080Stuhlsammlung
Magnetischer StänderNew England BioLabs, MA, USAS1509SFür die PCR-Reinigung
MicroAmp Schnelle optische 96-Well-ReaktionsplatteApplied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA4346906PCR Plate
MicroAmp Optischer KlebefilmApplied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA4311971PCR Plate Sealer
Microfuge 20 CentrifugeBeckman Coulter, IN, USAB30154Zentrifuge für die DNA-Isolierung
MiSeq Reagenzienkit (600 Zyklen)v.3Illumina, Inc., CA, USAMS-102-3003Für die MiSeq-Sequenzierung
Nextera XT DNA-BibliotheksvorbereitungskitIllumina, Inc., CA, USAFC-131-100116S rRNA-DNA-Bibliotheksvorbereitung
Reagenzienreservoire Mehrkanal-TraysASI, FL, USARS71-1Zum Pooling von PCR2-Produktplatten
CetrifugeThermo Fisher Scientific, CA, USA75004393Zum Mischen von PCR-Reagenzien und Entfernen von Luftblasen von der Platte
PhiX ControlIllumina, Inc., CA, USAFC-110-3001Für die MiSeq-Sequenzierungskontrolle
Mikrobiom-DNA-AufreinigungskitThermo Fisher Scientific, CA, USAA29789Für die Aufreinigung von PCR1-Produkten
PowerLyzer 24 HomogenisatorOmni International, GA, USA19-001Bead Beater für die DNA-Isolierung
Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay-KitThermo Fisher Scientific, CA, USAQ32854DNA-Quantifizierung
TruSeq Index Plate FixtureIllumina, Inc., CA, USAFC-130-1005Zum Anordnen der Index-Primer
Vertikale Teiler (groß)Lewis Bins, WI, USDV-2280Kotsammlung
Vertikale Teiler (klein)Lewis Bins, WI, USDV-1780Stuhlsammlung
7100038651

Referenzen

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