Summary
이 문서는 조미료 수용 체를 연구 하는 방법을 제시 (GluR) 해리 된 기본 해 마 문화에서 인신 매매. 약리학적 접근법과 함께 내인성 또는 과발현 수용체를 라벨링하는 항체 공급 접근법을 사용하여, 이 방법은 조절하여 GluR 표면 발현을 조절하는 분자 메커니즘의 식별을 허용합니다. 내재화 또는 재활용 프로세스.
Abstract
외부 자극에 대한 세포 반응은 주어진 순간에 세포 표면에서 발현되는 수용체 세트에 크게 의존합니다. 따라서, 표면 발현 수용체의 집단은 지속적으로 적응하고 엄격한 조절 메커니즘에 따라 달라질 수 있다. 생물학에서 가장 많이 연구된 인신매매 사건 중 하나인 패러다임의 예는 글루타메이트 수용체(GluRs)의 시냅스 발현을 조절하는 것이다. GluRs는 중추 신경계에서 흥분성의 신경 전달의 대부분을 중재하고 시냅스 및 뉴런 수준 (예를 들어, 시냅스 가소성)에서 생리 적 활성 의존적 인 기능 및 구조적 변화를 제어합니다. 표면 표현 GluRs의 수, 위치 및 소단위 조성에 있는 수정은 신경 기능에 깊이 영향을 미치고, 사실, 이 요인에 있는 변경은 다른 신경병증과 연관됩니다. 여기에 제시된 것은 해리된 해마 1차 뉴런에서 GluR 인신매매를 연구하는 방법이다. "항체 공급" 접근법은 표면 및 내부 막에서 발현된 GluR 집단을 차별화하기 위해 사용됩니다. 살아있는 세포에 표면 수용체를 표지하고 수용체 내균증 및 / 또는 재활용을 허용하기 위해 다른 시간에 고정함으로써, 이러한 인신 매매 과정을 평가하고 선택적으로 연구 할 수 있습니다. 이것은 GluR 인신 매매에 영향을 미치는 자극 및 분자 메커니즘에 대 한 귀중 한 정보를 얻기 위해 약리학 접근 또는 변경 된 수용 체의 과발현과 함께에서 사용할 수 있는 다양 한 프로토콜. 유사하게, 다른 수용체 또는 표면 발현 단백질을 연구하기 위해 용이하게 적응될 수 있다.
Introduction
세포는 특정 세포 국소화에 단백질을 동원하고 그들의 기능에 엄격한 spatiotemporal 규정을발휘하기 위하여 인신 매매의 적극적인 프로세스를 이용합니다 1. 이 과정은 다른 환경 자극에 세포 응답 수용 체 활성화에 의해 트리거 된 세포 내 캐스케이드에 의존 으로, 막 전 수용 체에 대 한 특히 중요 하다. 세포는 수용체 세포 인신 매매 조절을 통해 세포 표면에서 발현되는 수용체의 밀도, 국소화 및소단위 조성을 변경함으로써 이러한 반응을 수정할 수 있다 2. 플라즈마 막에 새로 합성 된 수용체의 삽입, 내분비증 및 기존 수용체의 재활용은 표면 발현 수용체의 순 풀을 결정하는 인신 매매 과정의 예2. 많은 분자 기계장치는 단백질 인산화, 유비퀴틴화, 또는 palmitoylation 2와 같은 단백질 단백질 상호 작용 및번역 후 수정을 포함하여 단백질 인신 매매를 통제하기 위하여 협력합니다.
수용체 인신 매매의 조절은 고도로 전문화된 구조물을 가진 강하게 편광된 세포에서 특히 요구됩니다. 패러다임의 예는 글루타메이트 수용체(GluRs)의 규제된 인신매매에 의한 뉴런 기능의 조절이다3,4. 조미료, 주요 흥분 성의 신경 전달 물질, 바인딩 및 시 냅 스 신경 전달 및 시 냅 스 가소성 등 기본적인 생리 신경 기능을 제어 하는 표면 표현 된 GluRs를 활성화. 변경된 GluR 인신 매매가 신경 발달 장애에서 신경 퇴행성 질환에 이르기까지 광범위한 신경 병증에서 관찰되었다는 사실은이 과정의 중요성을강조5. 따라서, GluR 인신 매매를 제어하는 분자 사건을 이해하는 것은 연구의 많은 분야에서 관심입니다.
이 프로토콜에서, 항체 공급 기반 방법은 1 차적인 해마 뉴런에서 표면 발현 글루스의 수준을 정량화하고 관찰된 순 표면 발현에서 내재화 및 재활용의 변화가 어떻게 초래되는지 평가하기 위해 사용된다. 특정 돌연변이를 품고 있는 외인성 수용체의 약리학 및/또는 과발현의 사용은 이 프로토콜이 다른 환경 자극에 근본적인 신경 적응을 기초로 하는 분자 기계장치를 공부하기 위한 특히 강력한 접근을 만듭니다. 이 프로토콜의 유용성의 마지막 예는 환경의 다단계 변화(예: 질병 모델)가 이러한 모델의 표면 발현 검사를 통해 GluR 인신 매매에 미치는 영향을 연구하는 것입니다.
특정 한 예를 사용 하 여, 그것은 처음에 생리 적 시 냅 스 자극을 모방 하는 약리학 조작 을 입증 [화학 LTP (cLTP)] 내 인 성 GluA1 소부의 표면 발현을 증가 하는 글러스 (AMPARs)의 6. NMDA 형 글루어 (NMDARs)의 GluN2B 하위 단위의 과발광 인광 모방 형태의 인신 매매는 또한이 프로토콜이 특정 번역 후 인신 매매의 규제를 연구하는 데 사용할 수있는 방법을 예시하기 위해 분석됩니다. 수정. 이러한 특정 예가 사용되지만, 이 프로토콜은 항원 세포 외 도메인을 소유한 다른 GluRs 및 기타 수용체 및 단백질에 쉽게 적용될 수 있다. 세포외 도메인에 사용할 수 있는 항체가 없는 경우, 세포외 에피토프 태그(예를 들어, 플래그-, Myc-, GFP 태그 등)의 과발현단백질은 단백질 라벨링을 지원할 수 있다.
현재 프로토콜은 특정 GluR 아류형 밀도를 정량화하고 특정 항체를 사용하여 트래피킹을 위한 지침을 제공합니다. 이 프로토콜은 1) 총 GluR 표면 발현, 2) GluR 내재화 및 3) GluR 재활용을 연구하는 데 이용될 수 있다. 각 과정을 개별적으로 연구하려면 섹션 1과 2로 시작하여 섹션 3, 4 또는 5를 계속하는 것이 좋습니다. 모든 경우에 6과 8절(그림1)으로 마칩니다.
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Protocol
해마 1 차 적인 문화 준비에 관련 된 작업 검토 하 고 노스 웨스턴 대학 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 (프로토콜 #IS00001151).
1. 라벨링 전 준비
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준비 및 기본 해 마 문화의 유지 보수
- 폴리-D-리신 코팅(0.1 mg/mL) 18mm 커버 안경에 도금된 150,000개의 세포 밀도로 1차 해마 배양을 준비합니다. 해리 된 신경 배양 준비를위한 우수한 가이드는7,8.
참고: 필요한 경우, 배양체는 제제에서 신경교 증식을 피하기 위해 시토신 아라비노사이드(Ara-C, DIV1로부터 10 mM)로 처리될 수 있다.
참고: 피브로넥틴(1 mg/mL) 또는 라미닌(5 mg/mL)과 같은 대체 코팅 시약은 폴리-D-리신 대신에 사용될 수 있다. - B27 및 2 mM L-글루타민으로 보충된 신경기저 배지의 2 mL/웰에서 37°C 및 5% CO2에서 세포 인큐베이터에서 배양체를 유지한다.
참고: 원하는 경우 L-글루타민(예를 들어, 글루타맥스)을 대체할 수 있습니다. - 매주, 미디어의 절반 볼륨을 제거 하 고 보충 된 신경 기 저 기 미디어의 동일한 볼륨으로 대체.
- 폴리-D-리신 코팅(0.1 mg/mL) 18mm 커버 안경에 도금된 150,000개의 세포 밀도로 1차 해마 배양을 준비합니다. 해리 된 신경 배양 준비를위한 우수한 가이드는7,8.
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선택 사항: 돌연변이 및/또는 에피토프 태그 수용체의 형질전환
참고: 뉴런은 수용체 발현을 허용하기 위해 분석 시점 보다 적어도 3-4일 전에 형질 감염되어야 한다. 젊은 뉴런의 사용 [시험관내 일 6-9 (DIV6-9)] 이전 (DIV15-20) 뉴런 보다 더 나은 형혈 효율 결과, 하지만 형질 감염 된 세포의 충분 한 수 (>20) 고용 된 DIV에 관계 없이 달성 될 수 있다.- 12웰 플레이트의 각 웰에 대해, B27 없이 신선한 신경기저 물자 100 μL에 대한 관심의 구성을 포함하는 플라스미드의 1.5 μg를 희석하거나 미세원심지 튜브에 글루타민 보충제를 함유하고 빠르게 소용돌이치면서 혼합한다.
참고: 성공적인 형질 감염의 경우, 사용되는 신경 기저 매체가 병 개봉 후 1 주일 이내에 가능한 한 신선하다는 것이 중요합니다. - 두 번째 미세 원심 분리튜브에서, 1 μL의 적절한 지질 시약1 μL을 신선한 신경기저 물자 100 μL에 섞고 부드럽게 섞습니다.
참고: 지방 흡입 시약 혼합물을 소용돌이하지 마십시오. 신선한 지방 흡입 시약을 사용하면 형질 감염 효율을 향상시킬 수 있습니다. - 실온 (RT)에서 5 분 동안 튜브를 배양하십시오.
- 지방 흡입 시약 혼합물을 DNA 혼합물에 드롭 와이즈로 넣고 부드럽게 섞고 RT에서 20 분 동안 배양하십시오.
- 각 웰의 미디어 볼륨을 컨디셔닝된 미디어의 1mL로 조정합니다.
- 지질 시약 -DNA 혼합물을 웰에 떨어 뜨립니다.
- 세포를 인큐베이터로 되돌리고 단백질 발현을 위해 적어도 3-4일을 허용한다.
참고: 아래에 설명된 내재화 및 재활용 프로토콜의 목적을 위해, 해마 뉴런은 DIV11-12에서 세포 외 도메인(GFP-GluN2B)에서 GFP로 태그가 지정된 GluN2B를 발현하고 DIV15-16에서 이미지화한 구문으로 형질 감염되었습니다.
- 12웰 플레이트의 각 웰에 대해, B27 없이 신선한 신경기저 물자 100 μL에 대한 관심의 구성을 포함하는 플라스미드의 1.5 μg를 희석하거나 미세원심지 튜브에 글루타민 보충제를 함유하고 빠르게 소용돌이치면서 혼합한다.
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선택 사항: 고정 될 때까지 조절 된 매체에서 약물 (만성 또는 급성)으로 세포를 배양하십시오.
참고 : 급성 치료를 위해 라벨링하기 전에 세포 치료를 시작하십시오. 사용되는 약물 치료 프로토콜에 따라, 세포는 섹션 2 동안 약물 함유 매체에서 유지될 수 있다. 이 예에서, DIV21 셀은 표면 발현 AMPAR 9을증가시키기 위해 cLTP 프로토콜의 적용을 받았다.- 세포외 용액(ECS)을 위해 컨디셔닝된 미디어를 교환합니다.
- 300 μM 글리신으로 세포를 ECS로 RT에서 3 분 동안 치료하십시오. 대조군으로서, 자매 커버슬립을 ECS(글리신 제외)로 치료하십시오.
- 37°C ECS로 세포를 3x 세척하고 섹션 2를 계속하기 전에 20 분 동안 세포 인큐베이터에 ECS (글리신 없이)로 세포를 반환합니다.
참고: ECS (mM) : 150NaCl, 2 CaCl 2, 5 KCl, 10 HEPES, 30 포도당, 0.001 TTX, 0.01 스트리크닌, 및 0.03 피크로톡신 을 pH 7.4에서.
2. 표면 발현 수용체의 라이브 라벨링
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라벨링을 위한 커버슬립 준비
- 시약을 절약하고 조작을 용이하게하기 위해, 파라핀 필름 덮인 트레이까지 커버립셀 측면을 전송합니다.
참고: 시료를 건조시키지 않는 것이 중요합니다. - 인큐베이션 및 세척 단계를 위해 37°C에서 컨디셔닝된 매체를 저장하고 유지합니다.
참고: 18mm 커버슬립의 경우, 항체 라벨링을 위한 75-100 μL의 배양과 내재화/재활용을 위한 120-150 μL의 인큐베이션을 권장합니다.
- 시약을 절약하고 조작을 용이하게하기 위해, 파라핀 필름 덮인 트레이까지 커버립셀 측면을 전송합니다.
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1 차적인 항체를 가진 표면 수용체의 표지
- RT에서 15 분 동안 컨디셔닝 된 매체로 희석 된 원발성 항체로 세포를 배양합니다.
참고: GFP 태그가 있는 수용체의 경우, 1:1000의 희석에서 토끼 항 GFP 항체를 사용하였습니다. 내인성 GluA1의 경우, 1:200 희석에서 마우스 항-GluA1을 사용하였습니다. - 진공 파이펫을 사용하여 항체 함유 매체를 조심스럽게 흡인하고 컨디셔닝 된 매체로 세포를 세 번 세척하십시오.
참고: 컨디셔닝된 매체를 사용할 수 없는 경우, 모든 세척 단계는 1 mM MgCl2 및 0.1 mM CaCl2를포함하는 PBS+[인산완식염수(PBS)]을 사용하여 수행될 수 있다. 부드러운 진공 흡인을 사용할 수 없는 경우 마이크로파이펫을 이용한 수동 흡인이 수행될 수 있습니다.
- RT에서 15 분 동안 컨디셔닝 된 매체로 희석 된 원발성 항체로 세포를 배양합니다.
3. 표면표현 (그림 2)
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표면 발현 수용체의 이차 항체 라벨링
- PBS+로 한 번 씻으십시오.
- PBS에서 4% 파라포름알데히드(PFA) 및 4% 자당을 7-8분 동안 배양하여 세포를 고정시.
참고: 메탄올 배양과 같은 다른 고정 방법과 달리 PFA는 혈장 막을 투과하지 않으므로 표면 발현 분석에 적합합니다. 최적의 결과를 얻으려면 갓 준비한 PFA를 사용하십시오. -20°C에서 4°C 또는 장기(최대 30일) 저장에서 PFA를 단기 보관하는 것은 적절한 고정을 위해 허용된다.
주의 사항: PFA는 알려진 발암 물질이다. 취급 시 적절한 개인 보호 장비와 안전 후드를 사용하십시오. - 일반 PBS로 세포를 세 번 씻으하십시오.
참고: 또는, 0.1 M 글리신은 PBS 대신 PFA세척에 사용될 수 있으며, 글리신은 제제에서 배경을 증가시킬 수 있는 잔류 고정제를 담금질한다. - RT에서 30분 동안 PBS에서 10% 정상 염소 혈청(NGS)으로 배양하여 비특이적 결합 부위를 차단합니다.
참고: 차단 시간은 라벨링에 악영향을 주지 않고 연장할 수 있습니다. - 형광 태그이차 항체를 1시간 동안 PBS에서 3% NGS로 희석하여 1차 항체 표지 수용체(즉, 표면 발현)를 라벨로 바쳤다.
참고: 이들 예에서, 1:500 의 알렉사 555-컨쥬게이트 이차 항체:GFP 표지 수용체및 GluA1용 염소 항마우스에 대한 염소 항토끼를 사용하였다. - PBS 3x로 셀을 세척하십시오.
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세포 내 수용체의 라벨링
- RT에서 5-10 분 동안 PBS에서 0.25 % 트리톤 X-100으로 세포를 투과시.
참고: 항체 표지의 초기 라운드가 모든 표면 에피토프를 차지하는지 확인하기 위해, 이 투과 단계는 자매 배양에서 건너뛸 수 있다. 이 경우 세포 내 수용체에 대한 신호를 얻지 않아야합니다. 또한, 이전 섹션 2(즉, 배양에서 혈장 막의 무결성을 보여주는) 내부 수용체가 표지되지 않은지 확인하기 위해, 투과 단계는 자매 배양물에서 건너뛰고, 1차 항체에 대하여 세포내 단백질(예를 들어, PSD-95 또는 MAP2)은 2.2.1단계에서 이용될 수 있다. 이러한 조건하에서 이 기본 신호에서 신호를 얻지 않아야 합니다. 이 때, 토끼 항 PSD-95 항체(1:500)를 사용하였다. - RT에서 30 분 동안 PBS에서 10 % NGS로 블록.
- 섹션 2.2에서 사용되는 동일한 1 차 항체로 투과 세포를 배양하여 세포 내 수용체를 라벨링하여 RT에서 1 시간 동안 PBS에서 3% NGS로 희석하였다.
참고: 세포내 수용체 표지화를 위한 항체 희석은 표면 발현 수용체 를 표지하는 데 필요한 것과 다를 수 있다. GluA1의 예에서, 동일한 항체 희석(1:200)을 사용하였다. - PBS로 세포를 3배 세척합니다.
- 두 번째 형광 태그이 붙은 이차 항체를 PBS에서 3% NGS로 희석하여 RT에서 1시간 동안 라벨.
참고: 이들 예에서, 염소 항마우스 알렉사 647-컨쥬게이트 이차 항체(GluA1용)의 1:500 희석을 사용하였다. - PBS로 세포를 3배 세척합니다.
- RT에서 5-10 분 동안 PBS에서 0.25 % 트리톤 X-100으로 세포를 투과시.
4. 내적화 (그림3)
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항체 표지 표면 수용체의 내재화
- 표면 발현 수용체 및 항체 세척(섹션 2.2)의 라벨링 후, 항체 없이 컨디셔닝된 매체에 세포를 유지하고 이를 인큐베이터(37°C)로 돌려 보내 내재화를 허용한다.
참고: NMDA 수용체의 경우, 내면화를 위해 30 분이 권장됩니다. 대조군으로서, 자매 배양은 내재화 과정 동안 4°C에서 컨디셔닝된 배지로 유지될 수 있다. 최소한의 수용체 내변은 이러한 조건하에서 발생해야합니다.
- 표면 발현 수용체 및 항체 세척(섹션 2.2)의 라벨링 후, 항체 없이 컨디셔닝된 매체에 세포를 유지하고 이를 인큐베이터(37°C)로 돌려 보내 내재화를 허용한다.
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표면 수용체의 라벨링
- PBS+로 세포를 한 번 씻으십시오.
- 7-8 분 동안 PBS에서 4 % PFA 및 4 % 자당으로 세포를 수정하십시오.
주의 사항: PFA를 취급할 때는 적절한 개인 보호 장비와 안전 후드를 사용하십시오. - 일반 PBS로 세포를 3배 씻으소서.
- 비특이적 결합을 방지하기 위해 RT에서 30 분 동안 PBS에서 10 % NGS로 차단하십시오.
- 형광 태그이 붙은 이차 항체를 가진 배양 샘플은 1차 항체 표지 수용체(즉, 내면화되지 않은 표면 발현 수용체)에 라벨을 붙이기 위해 RT에서 1시간 동안 PBS에서 3% NGS로 희석하였다.
참고: 이 예에서, 알렉사 555-컨쥬게이트 염소 항토끼 이차 항체(1:500)를 라벨링에 사용하였다. - PBS로 세포를 3배 세척합니다.
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내중화 된 수용체의 라벨링
- 5-10 분 동안 PBS에서 0.25 % 트리톤 X-100으로 세포를 투과시.
- RT에서 30분 동안 PBS에서 10% NGS로 배양하여 비특이적 결합을 차단합니다.
- 형광 태그이 차항체와 배양 이차 항체는 내부화 항체 표지 수용체를 라벨RT에서 1 시간 동안 PBS에서 3 % NGS에서 희석.
참고: 이 예에서, 알렉사 647-공액 염소 항-토끼 이차 항체(1:500)는 라벨링에 사용된다. - PBS로 세포를 3배 세척합니다.
5. 재활용(그림 4)
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항체 표지 표면 수용체의 내재화
- 표면 발현 수용체 및 항체 세척(섹션 2.2)의 라벨링 후, 항체 없이 컨디셔닝된 매체에 세포를 유지하고 이를 인큐베이터(37°C)로 돌려 보내 내재화를 허용한다.
참고: NMDA 수용체의 경우, 내면화를 위해 30 분이 권장됩니다.
- 표면 발현 수용체 및 항체 세척(섹션 2.2)의 라벨링 후, 항체 없이 컨디셔닝된 매체에 세포를 유지하고 이를 인큐베이터(37°C)로 돌려 보내 내재화를 허용한다.
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안정된 표면 발현 수용체 차단
- 내면화되지 않은 표면 발현 수용체에 부착된 1차 항체에 대한 에피토프를 차단하기 위해, 공채되지 않은 Fab anti-IgG(H+L) 항체 단편을 가진 세포를 배양(섹션 2.2에서 사용되는 1차 에 대하여) 컨디셔닝 된 매체에서 희석( RT에서 20 분 동안 20 μg / mL) 이 처리는 이차 항체와의 미래 상호 작용을 방지합니다.
참고: 이 예에서는 염소 토끼 방지 팹 조각이 사용되었습니다.
참고: 대조군 실험: 표면 발현 수용체의 완전한 차단이 발생했는지 확인하기 위해, 자매 커버슬립은 Fab유무에 관계없이 배양될 수 있다. 배양은 Fab 처리 직후에 고정되어야 하며, 두 배양체는 Alexa 555-컨쥬게이트 이차 항체로 배양된다. Fab 배양 된 세포에서 알렉사 555 신호는 적절한 항체 차단을 나타냅니다. - 컨디셔닝 된 매체로 셀을 3 x 씻으하십시오.
- 80 μM 다이나조를 함유하는 컨디셔닝 된 매체를 가진 세포를 배양하여 추가 내재화를 방지하고 세포를 인큐베이터 (37 °C)로 돌려 보내 내재된 수용체의 재활용을 허용합니다. 다이나소레는 다이너닌을 억제하여 내재화를 방지하는 GTPase 억제제입니다.
참고: NMDAR 재활용시 45분 이내 권장됩니다. Dynasore는 다이너닌 의존적 내재화 프로세스(예: NMdARs 내재화)를 독점적으로 차단합니다. 그러나, 다른 시 냅 스 단백질의 내재화 (다이너 민-독립) 여전히 Dynasore의 존재에서 발생할 수 있습니다.
- 내면화되지 않은 표면 발현 수용체에 부착된 1차 항체에 대한 에피토프를 차단하기 위해, 공채되지 않은 Fab anti-IgG(H+L) 항체 단편을 가진 세포를 배양(섹션 2.2에서 사용되는 1차 에 대하여) 컨디셔닝 된 매체에서 희석( RT에서 20 분 동안 20 μg / mL) 이 처리는 이차 항체와의 미래 상호 작용을 방지합니다.
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재활용 수용체 의 라벨링
- PBS+로 세포를 한 번 씻으십시오.
- 7-8 분 동안 PBS에서 4 % PFA 및 4 % 자당으로 세포를 수정하십시오.
주의 사항: PFA를 취급할 때는 적절한 개인 보호 장비와 안전 후드를 사용하십시오. - PBS로 세포를 3배 세척합니다.
- 비특이적 결합을 방지하기 위해 RT에서 30 분 동안 PBS에서 10 % NGS로 차단하십시오.
- 첫 번째 형광 태그이 붙은 이차 항체를 가진 라벨 세포는 RT에서 1 시간 동안 PBS에서 3 % NGS로 희석되었습니다.
참고: 이 예에서, 알렉사 555-컨쥬게이트 염소 항토끼 항체(1:500)를 라벨링에 사용하였다. - PBS로 세포를 3배 세척합니다.
참고: PBS (5-10 분)로 더 오래 세차하면 준비의 배경을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.
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내중화 된 수용체의 라벨링
- 5-10 분 동안 PBS에서 0.25 % 트리톤 X-100으로 세포를 투과시.
- RT에서 30 분 동안 PBS에서 10 % NGS로 블록.
- 두 번째 형광 태그이 붙은 이차 항체를 PBS에서 3% NGS로 희석하여 RT에서 1시간 동안 라벨.
참고: 이 예에서, 알렉사 647-컨쥬게이트 염소 항토끼 항체(1:500)를 라벨링에 사용하였다. - PBS로 세포를 3배 세척합니다.
6. 샘플 장착 및 이미징
- 커버립셀 측을 적절한 장착 매체의 12-15 mL 에 부드럽게 놓아 셀을 장착한다.
참고: 과도한 장착 매체를 포부하면 이미지 품질이 향상됩니다. - 적절한 공초점 현미경상에서 세포.
참고: 뉴런의 전체 두께를 포괄하는 0.35 μm 단계로 60배 배율로 z 스택을 이미지화하는 것이 좋습니다.
7. 시간 고려 사항
- 이것은 여러 지점에서 중지할 수 있는 긴 프로토콜입니다. 원하는 경우, 습한 챔버에서 4°C에서 하룻밤 동안 차단 및 1차 항체 배양 단계를 수행한다.
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또는 원하는 경우 전자레인지 티슈 프로세서를 사용하여 고정 후 배양 시간을 크게 단축하십시오. 모든 단계에서 "켜기" 설정의 경우 30°C에서 150W를 사용합니다.
- 차단하려면 2분 "켜기", 1분 "끄기", 2분 "켜기"에서 프로세서를 실행합니다.
- 1차 및 2차 항체 인큐베이션 단계의 경우 프로세서를 3분 "켜기", 2분 "끄기" 및 3분 "켜기"로 실행합니다.
참고: 우리는 프로토콜에 위의 변경을함으로써 품질의 차이를 관찰하지 않습니다.
8. 이미지 분석
- 그것은 여러 파일 형식과 호환되기 때문에, 이미지 분석을 수행하기 위해 FIJI
- FIJI에서 미리 선택한 다양한 매개 변수를 쉽게 일괄 처리할 수 있는 매크로 스크립트가 제공됩니다. 다음 단계는 매크로에 포함됩니다.
참고: 이들 예에서는, "통합 강도"를 측정했다. - 피지에서 이미지 파일을 열고 별도의 채널.
- Z-투영 각 채널 스택최대 강도 투영으로.
- 각 채널에 대해 낮은 임계값을 설정합니다.
참고: 임계값은 각 실험 데이터 집합에 대해 경험적으로 결정해야 합니다. 각 채널은 별도의 낮은 임계값을 가질 수 있지만 동일한 데이터 집합의 모든 이미지에 대해 채널 임계값을 일관되게 유지하는 것이 중요합니다. - 3~5개의 보조 또는 삼차 모수석을 선택하고 관심 영역(ROI)으로 저장합니다.
- 표면 및 세포내 채널에서 각 ROI의 통합 밀도를 측정합니다.
- 표면 채널의 통합 밀도 값을 세포내 채널로 나누어 각 ROI에 대한 신호를 정규화합니다.
- 모든 제어 및 실험 이미지에 대한 측정을 반복하고 실험 값을 정규화하여 제어 값(예: GluN2B WT 또는 글리신 조건 없음)을 제어합니다.
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Representative Results
글루타메이트 수용체 인신 매매를 연구하는 이 프로토콜은 세포 표면에서 발현되는 수용체와 내부 막에서 발현되는 수용체의 차동 라벨링에 기초한다. 분리는 막 투과 전후에 수용체를 표지하고, 동일한 원발성 항체를 사용하지만, 이차 항체를 다른 형광부로 공액화함으로써 달성된다. 프로토콜을 포함하는 선택적 단계에 의해 설명된 바와 같이, 이것은 내재화 및 재활용과 같은 다른 수용체 인신 매매 프로세스를 심문하는 매우다양한 방법이며, 조사관의 요구에 쉽게 적응할 수 있다 (그림 1) .
먼저, 뉴런 표면에서 발현되는 수용체의 정량화를 위한 방법이 제공된다. 이 프로토콜은 기저 표면 발현의 정량화뿐만 아니라 다른 약물이나 돌연변이가 표면 발현 수용체의 기저 수준을 변경하는 분자 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 표면 발현 수용체는 먼저 투과되기 전에 1 차 및 이차 항체 둘 다로 배양하여 표지되었다. 0.25% Triton X-100으로 투과 후, 수용체의 세포내 풀은 항체 라벨링에 접근할 수 있다. 이 프로토콜을 설명하기 위해, 제어 배양 및 cLTP의 유도 후에 AMPA 수용체(AMPARs)의 표면 대 세포내 염색이 수행되었다. 구체적으로, 살아있는 세포는 AMPAR의 GluA1 소단위에서 세포외 에피토프에 대하여 항체를 사용하여 표지되었고, 세포는 알렉사 555-컨쥬게이스 이차로 표지된 후 고정되었다. 세포를 이어서 동일한 항AMPAR 항체로 투과하고 표지하고 알렉사 647에 접합된 이차 항체로 배양하였다. 이 이중 레이블을 사용하면 두 GluA1 채우기를 명확하게 시각화할 수 있습니다.
공초점 이미지를 획득한 후, 형광 신호는 cLTP(도2A,B)에 이어 세포내 집단에 비해 표면 발현의 증가를 나타내기 위해 용이하게 정량화될 수 있다. 대조군으로서, 투과 단계는 자매 커버슬립에서 (0.25% 트리톤 X-100을 이용한 인큐베이션) 건너뛰고, 1차 항체는 흥분성 시냅스를 위한 표준 세포내 마커인 PSD-95에 대해 사용되었다. 도 2C에도시된 바와 같이, PSD-95에 대한 신호는 비투과화된 세포에서 수득될 수 없고, 혈장 막의 무결성을 입증한다. 이는 "표면 GluA1"에 대해 얻어진 신호가 실제로 표면 발현 수용체에 해당한다는 것을 나타낸다(즉, 표면 발현 GluA1에 대한 신호는 세포내 수용체를 포함하지 않는다). 중요한 것은, "내재화된 GluA1"에 대한 최소 신호는 비 투과 조건 하에서 관찰될 수 있으며, 모든 표면 에피토프가 항체 라벨링의 초기 라운드에 의해 점유되고 있음을 보여준다(즉, 세포내 GluA1에 대한 신호는 포함되지 않는다) 표면 발현 수용체).
이 프로토콜을 활용하여 검사할 수 있는 두 번째 과정은 표면 발현 수용체의 내재화이다. 구체적으로, 표면 수용체는 살아있는 세포에 표지되고, 뉴런은 클라트린 매개 내분비증에 의해 수용체 내재화를 겪기 위해 주어진 시간 동안 인큐베이터로 반환된다. 이 단계에 따라, 세포는 1 차적인 항체 표지된 수용체 (즉, 표면 발현 및 내재화된 수용체)의 공간 발현을 보존하기 위하여 고정된다. 이어서, 표면 수용체(즉, 관심 기간 내에 내재화되지 않은 수용체)는 투과전에 이차 항체로 표지된다. 투과 다음, 내면화 된 수용체는 다른 형광단을 가진 이차 항체에 의해 표지됩니다.
이 프로토콜에서, NMDARs(S1480에서)의 GluN2B 소단위의 PDZ 리간드 내의 특정 인산화가 NMDAR 내화를 유도하는 방법을 조사하였다. 이렇게 하기 위하여, 1 차적인 배양체는 세린 (S1480)가 글루타메이트 (E)에 의해 대체된 인광 모방 수용체로 형질감염되었습니다. 결과 돌연변이, GluN2B S1480E, GluN2B의 "구성-인광화" 형태로 작용한다. GluN2B의 라벨링을 용이하게 하고 인광 모방 돌연변이를 확인하기 위해, GFP는 GluN2B(GFP-GluN2B S1480E)의 세포외 측에 에피토프 태그로 사용하였다. 살아있는 세포 상에서 표면 수용체는 RT에서 15분 동안 항 GFP 항체로 표지되었다. 다음으로, 과잉 항체를 컨디셔닝된 매체로 세척하고 세포를 37°C로 30분 동안 돌려보내 내분비증을 허용하였다. 이어서, 세포를 수용체 이동을 동결하도록 고정시켰다. 표면에 남아 있는 수용체는 그 후 투과되기 전에 Alexa 555-컨쥬게이트 이차 항체로 표지되었다.
30 분 잠복기 동안 내재 된 수용체를 확인하기 위해, 세포는 투과되었고, 내부화 된 수용체 (이미 1 차 항체로 표지)를 알렉사 647-컨쥬게이트 항체로 표지하였다. 다시 말하지만, 이 이중 라벨링 전략은 내면화된 수용체의 비율을 정량화할 수 있게 한다. 이 예는 S1480에서 GluN2B 인산화가 수용체 내재화를 촉진한다는 것을 강조하고, 인광 모방 돌연변이체 S1480E는 WT 수용체에 비해 훨씬 더 높은 내재화 비율을 나타냈다(도3A,B). 대조군으로서, 4°C에서의 자매 배양체는 내재화 동안 컨디셔닝된 배지에서 유지되어 공정을 강하게 느리게 하였다. 예상대로, 이러한 조건 하에서 "내중화된" 수용체에 대한신호가 수득되지 않았다(도 3C).
마지막으로, 이 프로토콜은 이전에 내재화된 수용체의 재활용을 검사하는데 이용될 수 있다. 이러한 프로토콜 변이는 이러한 수용체를 세포 표면으로 다시 따로 따로 따로 따로 내재화 프로토콜의 연속이다. 이 변형에는 두 가지 중요한 구성 요소가 있습니다. 첫째, 전체 프로토콜 동안 표면에서 안정적으로 발현된 수용체(즉, 내재화또는 재활용되지 않은 수용체)는 재활용 수용체로 오인되지 않도록 "차단"되어야 합니다. 이렇게하려면, 재활용 단계를 수행하기 전에, 살아있는 뉴런은 표면에서 발현되는 1 차 항체 표지 수용체와 상호 작용하는 Fab의 고농도로 배양되어 플루오로포폴레-이차 결합의 추가 결합을 방지한다. 항 체. 둘째, 재활용 단계에서 내재화를 방지하여 재활용 수용체가 반복되지 않도록 해야 합니다. 이것은 이 약이 NMDAR 내재화와 같은 클라트린 중재한 내분비증과 같은 다이너닌에 의존하는 프로세스로 재활용 도중 매체에 dynasore를 추가해서 행해졌다. 이 프로토콜에서, 인광 모방 돌연변이체 GluN2B S1480E의 인신매매를 연구하는 것은 이전에 설명한 바와 같이 30분 동안 내재화를 허용한 살아있는 세포에 GFP-GluN2B의 표면 라벨링뿐만 아니라 수행되었다.
이에 따라, 이 기간 동안 내재화되지 않은 표면 수용체는 RT에서 20분 동안 팹으로 세포를 배양함으로써 차단되었다. 다음으로, 세포는 37°C에서 45분 동안 다시 배양하여 이전에 내재화된 GluN2B가 세포 표면으로 다시 재활용될 수 있도록 하였다. 다이나소레는 재활용 단계 동안 미디어에 존재했다. 이 단계에 따르는 세포의 고정은 재활용 된 수용체 (즉, 세포 표면에서 차단되지 않고 발현되는 수용체) 및 내재화된 수용체 (즉, 1 차항체 표지 및 세포 내)의 식별을 허용합니다. 1) 알렉사 555-컨쥬게이트 이차 항체를 내재화하기 전에 알렉사 555-컨쥬게이트 이차 항체로 라벨링함으로써, 2) 라벨링 내재화, 그러나 재활용되지 않음, Alexa 647-컨쥬게이트 이차 항체를 가진 수용체, 재활용 비율이 생성된 것을 보여주기 위해 GluN2B S1480E는 NMDAR 재활용에 아무영향도 미치지 않는다(그림4A,B). 대조군으로서, 표면 발현 수용체의 완전한 차단은 FAB의 존재 또는 부재에서 자매 커버슬립을 인큐베이팅함으로써 발생하였고, PFA 고정이 뒤따랐다. 도 4C에도시된 바와 같이, 팹 차단이 없는 상태에서 표면 발현 GluN2B에 대해 강한 신호를 관찰할 수 있다. 이 신호는 Fab 처리 된 문화에서 사라지며 차단 프로토콜이 표면 발광 에피토프를 완전히 차단하기에 충분하며 재활용 후 관찰 된 표면 신호가 실제로 다시 인신 매매 된 수용체에 해당한다는 것을 보여줍니다. 플라즈마 멤브레인.
그림 1: 수용체 표면 발현, 수용체 내재화(endocytosis), 및 수용체 재활용을 연구하기 위한 프로토콜 변이의 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: cLTP는 GluA1의 표면 발현을 증가시킵니다. DIV21에서의 1차 해마 뉴런은 글리신 함유 ECS로 배양함으로써 화학적 LTP(cLTP)를 실시하였다. 표면 표현 (빨간색) 대 세포 내 (파란색) GluA1 인구의 뚜렷한 라벨은 AMPAR의 표면 발현의 예상 증가를 보여줍니다. (A) 단일 평면 및(B) Z 적층 (최대 강도 프로젝션) 공초점 사진. 스케일 바 = 50 μm (전체 셀) 또는 5 μm (수상 돌기). 그래프는 cLTP 프로토콜 후 GluA1의 증가된 표면 발현을 나타낸다. 표면 발현 지수: 표면/세포 내 수용체(n=3; 세포 수: con = 7; cLTP = 7; 값은 평균 ±SEM; ****p< Mann-Whitney U 검정을 사용하여 0.0001)을 나타낸다. (C) 투과 단계를 건너뛰는 제어 실험. 표면 및 내부 GluA1 이외에, 세포내 흥분성 시냅스 마커 PSD-95를 평가하였다. 스케일 바 = 50 μm (전체 셀) 또는 5 μm (수상 돌기). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: S1480에서 GluN2B의 인산화는 NMDAR 내화를 촉진합니다. 1차 해마 뉴런은 DIV11-12에서 GFP-GluN2B WT 또는 인광 모방 돌연변이GFP-GluN2B S1480E로 형질감염되었다. 단백질 발현 3-4일 후, 표면 GFP는 토끼 항-GFP 항체를 가진 살아있는 세포에 표지된 후 세포가 37°C로 복귀하여 내분비증에 의한 수용체 내재화를 허용하였다. 표면 발현 외인성 수용체는 Alexa 555-컨쥬게이트 이차 항체로 시각화되었고, 알렉사 647-컨쥬게이트 항체를 사용하여 투과후를 확인한 내재화된 집단을 가시화시켰다. 명확성을 위해, 표면 GFP-GluN2B는 녹색으로 가명색되고 내부화된 GFP-GluN2B는 흰색으로 가명색된다. (A) 단일 평면 및(B) Z 적층 (최대 강도 프로젝션) 공초점 사진. 스케일 바 = 50 μm (전체 셀) 또는 5 μm (수상 돌기). 그래프는 인광 모방 돌연변이 GluN2B S1480E에 의해 표시되는 높은 내재화를 나타낸다. 내재화 지수: 내재화된 수용체/표면 발현 수용체 (n = 6; 세포 수: WT = 34; S1480E = 28; 값은 평균 ± SEM을 나타냅니다. P < 0.001 만 휘트니 U 테스트를 사용하여). (c) 4°C에서 내분화 단계(Intenaliz.)를 수행한 제어 실험. 스케일 바 = 50 μm (전체 셀) 또는 5 μm (수상 돌기). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: S1480에서 GluN2B의 인산화는 NMDAR 재활용을 수정하지 않습니다. 일차 해마 뉴런은 도3에 도시된 바와 같이 GFP-GluN2B WT 또는 인광 모방 돌연변이GFP-GluN2B S1480E에 의해 DIV11-12에 형질감염되었다. 단백질 발현 3-4일 후, 표면 GFP는 토끼 항-GFP 항체를 가진 살아있는 세포에 표지된 후 세포가 37°C로 복귀하여 내분비증에 의한 수용체 내재화를 허용하였다. 잔류 표면 발현 수용체는 팹 인큐베이션에 의해 차단되었고 재활용은 45분 동안 허용되었다. 사용 가능한 표면 발현 외인성 수용체(recycled)는 Alexa 555-컨쥬게이트 이차 항체로 가시화되었고, 내재화되었다. 알렉사 647-컨쥬게이트 항체를 사용하여 투과 후 확인된 인구. 명확성을 위해, 표면 GFP-GluN2B는 흰색으로 가명색되고 내부화된 GFP-GluN2B는 녹색으로 가명색된다. (A) 단일 평면 및 (B) Z 적층 (최대 강도 프로젝션) 공초점 사진. 스케일 바 = 50 μm (전체 셀) 또는 5 μm (수상 돌기). 그래프는 GluN2B S1480 인산화가 재활용에 미치는 영향의 부족을 보여줍니다. 재활용 지수: 재활용 수용체/내재화된 수용체(n = 5; 셀 수: WT = 27; S1480E = 24; 값은 평균 ± SEM을 나타냅니다. n.s. = Mann-Whitney U 테스트를 사용하여 유의하지 않은 경우). (C) 표면 발현 에피토프를 차단하는 팹 배양 단계를 건너뛰는 대조군 실험. 스케일 바 = 50 μm (전체 셀) 또는 5 μm (수상 돌기). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
세포와 그 환경 사이의 상호 작용 (예를 들어, 다른 세포와의 통신, 다른 자극에 대한 반응 등),은 세포 표면에서 수용체의 올바른 발현에 크게 의존합니다. 표면 발현 수용체 함량의 신속하고 미세 조정된 조절은 끊임없이 변화하는 환경에 대한 적절한 세포 반응을 가능하게 합니다. 뉴런의 경우, 합성적으로 발현된 수용체의 수, 국소화 및 소단위 조성의 변화는 시냅스 통신, 시냅스 가소성, 시냅스 생성 및 시냅스 가지치기3, 5,10. 따라서, 수용체 표면 발현의 정확한 분석 및 그 조절의 기초가 되는 메커니즘은 연구의 중요한 주제이다.
수용체 표면 발현을 연구할 수 있는 여러 가지 양식이 존재합니다. 일반적으로, 이들은 3개의 주요 범주에 속합니다: (i) 표면 발현된 수용체 인구의 생화확적인 격리, (ii) 표면에 있는 수용체를 구상하는 화상 진찰 기술, 및 (iii) 수용체의 결과를 감시하는 기능적인 기술 활성화. 이 접근은 상보적이고 수용체의 표면 표현에 관하여 특정 질문에 대답하기 위하여 함께 이용될 수 있습니다.
표면 발현 수용체의 생화학적 절연의 예로는 배양된 세포 또는 뇌 슬라이스에서의 생체측분열 프로토콜및 배양된 세포 또는 조직의 세포 분획(11)이 포함한다. 표면 생물학적 인생물은 에스테르 활성화 비오틴으로 배양을 배양함으로써 비오틴과 표면 발현 수용체의 라벨링에 기초한다. 에스테르 그룹은 1 차적인 아미노군 (-NH 2)와 반응하여 안정된 아마이드 결합을 형성합니다. 이 시약은 세포 불투과성이기 때문에 표면 발현 단백질만 비오틴으로 표지됩니다. 세제를 사용하여 세포 용해 후, 표지 된 수용체는 아비딘 또는 비오틴에 대한 강한 친화력을 가진 변이체에 공액 된 아가로즈 구슬로 세포 용해액을 인큐베이팅하여 회복 할 수 있으며 면역 블로팅에 의해 평가됩니다. 세포분획은 그들의 상이한 밀도12에기초하여 상이한 세포 membranous 구획을 격리하기 위하여 몇몇 원심분리 단계를 이용하는 생화확적인 프로토콜입니다. 두 기술은 내인성 단백질의 표면 발현변화를 정량화하는 데 유용하며, 분자 조작이 표면 발현에 미치는 영향을 결정하기 위해 약리학적 접근법(생체 내 및 배양)과 함께 사용할 수 있습니다. 수용체의. 그(것)들은 표준에 상대적인 다중 내인성 수용체에 있는 변경이, 동시에 정량화될 수 있기 때문에 특히 유용합니다. 그러나, 이 프로토콜에 기술된 것과 같은 화상 진찰 양식과는 달리, 공간 해결책은 견본의 생화확적인 처리를 통해 손실됩니다.
여기에 설명된 프로토콜은 이미징 기술 범주에 속합니다. 이 접근법 그룹(예: 형광태그과 발현된 단백질의 표면 표지 및 살아있는 세포 화상 진찰)은 수용체의 표면 발현에 주공간적 분해능을 부여하는 데 유용하다. 예를 들어, 이전에 예시한 바와 같이 AMPAR의 표면 대 세포내 발현을 조사함으로써, 발현의 변화가 수상돌기(이 특정 적용에 대한 관심있는 생물학적 구획)에서 어떻게 발음되는지 를 조사할 수 있다. 생화학적 분획과 마찬가지로 약물은 이미징 기술과 함께 사용하여 약물이 표면 발현에 미치는 영향을 확인할 수 있습니다. 추가, 수정 (돌연변이 또는 꼬리표)를 포함하는 수용체를 가진 뉴런의 형질감염은 화상 진찰을 위한 possiblities를 더 정교하게 합니다. 돌연변이 수용체를 가진 형질감염은 표면 발현에 특정 돌연변이의 효력을 묘사할 수 있습니다.
수용체 인신매매를 시각화하는 또 다른 유용한 접근법은 수퍼클립틱 pHluorin(SEP)-또는 다른 플루오로포어 태그구조13과 같은 형광태그된 컨스트럭트와함께 1차 배양물의 트랜스펙션 후 의 실시간 영상 현미경 검사법이다. SEP 태그된 수용체는 표면 발현 수용체를 연구하는 데 특히 유용할 수 있으며, 이는 이 형광공은 세포외 배지에 노출되었을 때만 형광될 수 있기 때문이다. 이전 예와 마찬가지로, 약리학적 접근법은 수용체상에서 이루어지는 돌연변이, 수용체의 표면 발현 특성을 변화시키는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 약물의 경우, 살아있는 세포 이미징은 실시간으로 표면 발현의 수정을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 살아있는 화상 진찰에 대한 한계는 표면 표현의 변화에 대한 기계적 통찰력의 부족입니다. 예를 들어, 감소 된 표면 발현 증가 수용 체 내재화의 결과 일 수 있습니다., 감소 된 수용 체 재활용, 또는 둘 다.
이 질문에 대답하기 위해, 위에서 설명한 프로토콜이 사용될 수 있다. 살아있는 화상 진찰 접근을 사용하여 감시될 수 있는 또 다른 중요한 인신 매매 사건은 혈장 막에 있는 다른 구획 사이 수용체의 측면 확산입니다 (예를 들면, 시냅스와 extrasynaptic 사이트 사이). 이 경우, 선택의 기술은 형광 반도체 나노결정 [즉, 퀀텀닷(QD)]이 관심 있는 단백질에 대한 세포외 에피토프에 대해 항체에 부착되는 단일 입자 추적 접근법의 사용이다. QD는 놀라운 안정성(기존 형광 단백질보다 훨씬 적은 광표백 허용), 강한 밝기 및 온/오프 상태("깜박임") 사이의 교대가 특징입니다. 적절한 현미경 설정을 이용하여, 세포혈장막(14)을 통해 단일 QD(그리고, 따라서, 관심 있는단일 단백질)의 움직임을 추적할 수 있다.
현재 프로토콜은 표면 인구, 내재화된 인구 및 재활용 인구의 수용체를 검사하여 이러한 프로세스가 전체 표면 발현을 제어하는 방법을 결정하는 비율을 계산할 수 있도록 합니다. 또한 서로 다른 시점에서 내재화 또는 재활용 프로세스를 중지하면 시간적 해결이 추가됩니다. 따라서 이 방법은 시시간 표면 발현 연구를 허용합니다. 다른 이미징 기술과는 달리, 내인성 표면 발현의 수준은 또한 연구될 수 있다(예를 들어, AMPAR), 수용체의 세포외 부분에 대한 항체가 존재할 경우. 그러나 이 방법은 셀 고정이 필요하기 때문에 라이브 셀 이미징과 호환되지 않으므로 실시간 정보를 제공할 수 없습니다.
마지막으로, 전기 생리학15 또는 칼슘 화상 진찰16 같이 기능적인 접근은 수용체의 표면 표현을 공부하는 수시로 간접적이더라도, 매너, 강력합니다. 이들 방법은 수용체 활성화 후 세포의 기능적 변화의 정량화(예를 들어, 막 전위 또는 칼슘 농도의 변화)에 기초한다. 약리학을 사용하여 주어진 수용체의 반응을 분리하는, 이러한 방법은 정확한, 주경학적 방식으로 세포 표면에서 발현된 수용체의 추정을 허용한다. 이들 방법은 다재다능하고 배양 및 생체내(예를 들어, 급성 뇌 슬라이스) 및 생체내 에서 의 학적인 세포연구를 허용한다. 그러나, 라이브 이미징 접근의 경우와 같이, 기계적 정보는 종종 기능적 접근을 사용할 때 놓친다.
요약하자면, 수용체 표면 발현을 연구하는 기술의 조합은 표면 발현이 어떻게 조절되는지 완전히 이해하기 위해 사용될 수 있다. 여기에 제시된 프로토콜은 해리된 1차 배양에서 수용체의 시공간적 표면 발현에 대한 기계적 이해를 제공하기 때문에 특히 강력하다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 Nikon A1 공초점 현미경의 사용과 실험 계획 및 분석에 있는 그들의 도움을 위한 고급 현미경 검사법에 대한 노스웨스턴 센터에 감사드립니다. 이 연구는 NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.) 및 NIA (R00AG041225) 및 뇌 행동 연구 재단 (#24133)에서 NARSAD 젊은 조사자 보조금에 의해 지원되었다 (A. S. -C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 mm dia. #1.5 thick coverglasses | Neuvitro | GG181.5 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21424 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21429 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21236 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21245 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 3513 | |
| Dynasore | Tocris | 2897 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| Glycine | Tocris | 0219 | |
| Goat anti-rabbit Fab fragments | Sigma | SAB3700970 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Mouse anti-GluA1 antibody | Millipore | MAB2263 | |
| NaCl | Sigma | S6546 | |
| Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | |
| NGS | Abcam | Ab7481 | |
| Parafilm | Bemis | PM999 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Pelco BioWave | Ted Pella | 36500 | |
| PFA | Alfa Aesar | 43368 | |
| Picrotoxin | Tocris | 1128 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36934 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-PSD-95 antibody | Cell Signaling | 2507 | |
| Strychnine | Tocris | 2785 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| TTX | Tocris | 1078 |
References
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