Murine Cervical Aortic Transplantation Modell mit einer modifizierten Non-Suture Manschettentechnik

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll der heterotopischen Aortentransplantation bei Mäusen mit der Nicht-Naht-Manschettentechnik in einem zervikalen Murin-Modell vor. Dieses Modell kann verwendet werden, um die zugrunde liegende Pathologie der chronischen Allograft-Vaskulopathie (CAV) zu untersuchen und kann helfen, neue therapeutische Wirkstoffe zu bewerten, um ihre Bildung zu verhindern.

Zusammenfassung

Mit der Einführung leistungsfähiger immunsuppressiver Protokolle sind deutliche Fortschritte bei der Prävention und Therapie akuter Abstoßungsepisoden möglich. In den letzten Jahrzehnten konnten jedoch nur geringfügige Verbesserungen der langzeitigen Ergebnisse transplantierter fester Organe beobachtet werden. In diesem Zusammenhang stellt die chronische Allograft-Vaskulopathie (CAV) nach wie vor die Hauptursache für spätes Organversagen bei Herz-, Nieren- und Lungentransplantationen dar.

Bislang bleibt die zugrunde liegende Pathogenese der CAV-Entwicklung unklar, was erklärt, warum derzeit wirksame Behandlungsstrategien fehlen, und betont, dass relevante experimentelle Modelle benötigt werden, um die zugrunde liegende Pathophysiologie zu untersuchen, die zu CAV-Bildung. Das folgende Protokoll beschreibt ein murines heterotopes zervikales Aortentransplantationsmodell mit einer modifizierten Nicht-Naht-Manschettentechnik. Bei dieser Technik wird ein Segment der Thoraxaorta in der rechten gemeinsamen Halsschlagader interpositioniert. Mit der Nicht-Naht-Manschettentechnik kann ein leicht zu erlernendes und reproduzierbares Modell erstellt werden, das die mögliche Heterogenität von nähten vaskulären Mikroanastomosen minimiert.

Einleitung

In den letzten sechs Jahrzehnten hat sich die solide Organtransplantation von einem experimentellen Verfahren zu einem Standard der Behandlung von Organversagen im Endstadium entwickelt¹. Durch die Verbesserung antimikrobieller Wirkstoffe, operationschirurgische rativer Techniken und fortschritten in immunsuppressiven Regimentern hat die frühe Erfolgsrate der soliden Organtransplantation in den letzten Jahrzehnten deutlich zugenommen².

Die langfristigen Transplantatüberlebensraten haben sich jedoch nicht signifikant verbessert³. Die Entwicklung von CAV ist der Hauptfaktor, der das langfristige Überleben begrenzt^4,5,6. Diese Pathologie zeichnet sich durch die Bildung einer konzentrischen neointimalen Schicht aus glatten Muskelzellen aus, die zu einer fortschreitenden Verengung des Gefäßes und einer aufeinanderfolgenden Malperfusion des transplantierten festigen Organs führt. Bei Herztransplantationsempfängern können CAV-Läsionen bei bis zu 75% der Patienten 3 Jahre nach Transplantation⁷diagnostiziert werden.

Die Pathophysiologie der CAV ist noch nicht vollständig verstanden. Es scheint mit zahlreichen immunologischen und nicht-immunologischen Faktoren zusammenzustehen, was zu endotheliale Schäden mit anschließender endotheliale Aktivierung und Dysfunktion⁸führt. Bisher gibt es keine kausale Behandlungsmöglichkeit zur Prävention von CAV, was die Notwendigkeit eines reproduzierbaren Kleintiermodells unterstreicht, um die Bildung und mögliche Therapie von CAV zu untersuchen.

Mit der Verwendung von murinen Aortentransplantationsmodellen können CAV-ähnliche Läsionen 4 Wochen nach der Transplantation beobachtet werden. Diese Läsionen bestehen hauptsächlich aus vaskulären glatten Muskelzellen, die damit der menschlichen Pathologie ähneln. Aufgrund einer Vielzahl von transgenen und ausgeschlagenen Mäusen bietet der Einsatz von Mausmodellen in transplantatassoziierten Pathologien eine einzigartige Gelegenheit, neue therapeutische Optionen zu identifizieren und ihre Entwicklung zu verstehen. Aufgrund des geringen Durchmessers der transplantierten Gefäße ist der Einsatz von Mausmodellen jedoch häufig mit langen Lernkurven und einer anfänglichen hohen Komplikationsrate^{von 9}verbunden. Mit der Einführung der Nicht-Naht-Manschettentechnik kann dieser anspruchsvollste Teil der Operation erleichtert und der Durchmesser der Anastomose konstant gehalten wird^10,11.

Protokoll

Alle Experimente wurden nach den Richtlinien des Tierschutzgesetzes (TierSchG) durchgeführt. (AZ: 55.2-1-54-2532.Vet_02-80-2015).

1. Tierhaltung

1. Für Experimente verwenden Sie männliche C57BL/6- und BALB/c-Mäuse mit einem Gewicht von 20-25 g mit C57BL/6-Mäusen als Empfängertiere und BALB/c-Mäuse als Spendertiere.
2. Kaufen Sie die Tiere und das Haus in einer barrierefreien Anlage, gemäß den FELASA-Richtlinien für die Gesundheitsüberwachung¹².
3. Halten Sie die Mäuse in Standard Makrolon Käfige mit Anreicherung Nistmaterial. Bieten Sie ad libitum Zugang zu Wasser und Pellet-Lebensmittel bei einem Tag /Nacht-Zyklus von 12 h.
4. Halten Sie die Raumtemperatur bei 22 °C bei 2 °C und die relative Luftfeuchtigkeit bei 55 bis 5 %.

2. Empfängervorbereitung

1. Erstens das Empfängertier (C57BL/6) mit einer intraperitonealen Injektion von Midazolam (5 mg/kg; 5 mg/ml), Medetomidin (0,5 mg/kg; 1 mg/ml) und Fentanyl (0,05 mg/kg; 0,05 mg/ml) anzubescheine.
   HINWEIS: Die richtige Tiefe der Anästhesie sollte in 5-10 min erreicht werden.
   1. Kneifen Sie die Hinterfüße mit Zangen, um nach Reflexen zu suchen, um die Tiefe der Anästhesie zu bestätigen.
2. Schneiden Sie alle Haare des zervikalen Seitenbereichs mit einem elektrischen Haarschneider für Kleine Tiere ab und tragen Sie eine ophthalmologische Salbe mit Wattestäbchen auf, um zu verhindern, dass die Augen während des Eingriffs austrocknen.
3. Legen Sie das Tier in einer Supine-Position auf einem Heizkissen unter dem Mikroskop und verkleben Sie seine Beine vorsichtig mit hautempfindlichen Gipsstreifen an den Operationstisch.
4. Neigen Sie den Kopf zurück und schrubben Sie das Operative Feld mehrmals mit Alkohol.
5. Machen Sie einen Hautschnitt vom Jugularschnitt nach rechts unter dem Kiefer mit einer kleinen Schere.
6. Entfernen Sie den rechten unteren Lappen der submandibulären Drüse über bipolare Kautery des Gefäßpedikles und anschließende Exzision mit Mikroschere.
7. Entfernen Sie den rechten Sternocleidomastoidmuskel über bipolare Kautery des oberen und unteren Teils und anschließende Exzision mit Mikroschere, um Zugang zur gemeinsamen Halsschlagader zu erhalten.
8. Mobilisieren Sie die gemeinsame Halsschlagader so weit wie möglich distal und proximal, indem Sie das umgebende Bindegewebe mit feinen Zangen auseinanderziehen.
9. Binden Sie zwei 7-0 Seidenligaturen mit minimalem Abstand zwischen jeder um die Mitte der gemeinsamen Halsschlagader und transsektieren Sie die gemeinsame Halsschlagader mit feiner Mikroschere zwischen den Ligaturen.
10. Passieren Sie das proximale, ligande Ende durch die Manschette und fixieren Sie es mit einer kleinen Arterienklemme.
    HINWEIS: Die Manschetten, die bei diesem Verfahren verwendet wurden, wurden mit Mikroscheren aus Polyimidrohren mit einem Außendurchmesser von 0,610 mm und einer Wandstärke von 0,0254 mm geschnitten. Die fertigen Manschetten hatten eine Länge von 2 mm mit einer Hälfte, die für den Manschettenprozess verwendet wird, da es sich um einen vollen Zylinder und die andere Hälfte, die geklemmt ist, um einen Halbzylinder handelt.
11. Entfernen Sie die Ligatur mit feiner Mikroschere, so nah wie möglich an der Ligatur, und spülen Sie das Lumen mit heparinisierter Saline (50 I.E./ml) mit einer 30 G Nadel, wobei darauf zu achten ist, dass die Gefäßwände nicht beschädigt werden.
12. Entbessern Sie das offene Lumen mit feinen Gefäßdilatatoren und ziehen Sie den Karotisstumpf über die Manschette, indem Sie ihn sanft über das Polyimidrohr ziehen.
13. Beheben Sie das everted Carotis sofort mit einer lose vorgebundenen 7-0 Seidenschlaufe.
    HINWEIS: Lose vor der Bindung 4 7-0 Seidenschlaufen mit einem Durchmesser von etwa 1,5 mm vor der Operation, um die Manschette-Verfahren glatter und einfacher zu machen.
14. Führen Sie das gleiche Verfahren (2.10-2.13) am anderen Ende der Halsschlagader durch.
15. Stellen Sie das Empfängertier beiseite und befeuchten Sie das Operationsfeld mit Einer Linie, bis das Aortensegment explantiert wird.

3. Spenderoperation

1. Anästhetisieren Sie die Spendermaus (BALB/c) auf die gleiche Weise wie das Empfängertier.
   1. Kneifen Sie die Hinterfüße mit Zangen, um nach Reflexen zu suchen, um eine ausreichende Anästhesie zu bestätigen.
2. Schneiden Sie alle Haare der Bauch- und Brustbereich mit einem elektrischen Haarschneider für kleine Tiere und wenden Sie ophthalmologische Salbe mit Wattestäbchen, um zu verhindern, dass die Augen während des Eingriffs austrocknen.
3. Legen Sie das Tier in einer Supine-Position auf einem Heizkissen unter dem Mikroskop und verkleben Sie seine Beine vorsichtig mit hautempfindlichen Gipsstreifen an den Operationstisch.
4. Das Operative Feld mehrmals mit Alkohol zu beschrubben.
5. Führen Sie eine Mittellinien-Bauchlaparotomie mit einer kleinen Schere durch und schieben Sie den Darm leicht nach oben, um die unterlegene Vena cava (IVC) freizulegen.
6. Injizieren Sie die minderwertige Vena cava (IVC) mit 1 ml heparinisierter Saline mit einer 30 G Nadel.
7. Schneiden Sie die Bauchaorta und IVC unterhalb der Nierenarterien mit einer kleinen Schere, um das Spendertier zu exsanguinate. Legen Sie eine Kompresse locker in den Bauch, um das Blut zu absorbieren.
8. Führen Sie eine Thorakotomie bei der bilateralen Ablenkung der Rippen mit der Schere durch und kippen Sie die vordere Brustwand kranially mit einer chirurgischen Klemme, um das Mediastinum freizulegen.
9. IVC und Speiseröhre direkt über der Membran mit Mikroschere schneiden.
10. Entfernen Sie das Herz und die Lunge, indem Sie sie mit Zangen nach oben kippen, die den Schnitt IVC/Ösophagus halten, und sie dann mit Mikroscheren von ihrer Basis ausziehen, um Zugang zur Thoraxaorta im dorsalen Mediastinum zu erhalten.
11. Mobilisieren Sie die thorakale Aorta aus ihrem umgebenden Gewebe, indem Sie das umgebende Bindegewebe und Fett mit feiner Zange auseinanderziehen und dabei darauf achten, keine interkostalen Arterien zu beschädigen.
12. Kauterisieren Sie alle Zweige aus der thorakalen Aorta mit bipolaren Kauzangenzangen und verbrauchen Sie das Aortensegment zwischen dem Zwerchfell und dem Aortenbogen mit Mikroschere.
13. Spülen Sie das ausgeschnittene Aortensegment mit einer 30 G-Nadel, während Sie darauf achten, die Gefäßwände nicht zu beschädigen, restliches Blut oder Gerinnsel zu entfernen und das Transplantat an das Empfängertier zu übertragen.
    HINWEIS: Stellen Sie das Aortentransplantat während der Übertragung direkt in die ungefähr richtige Position des Empfängers. Wenn es Probleme gibt, die verschiedenen Enden des Transplantats im Empfängertier zu verwirren, könnte eine lose Ligatur um das distale Ende helfen.

4. Implantation

1. Ziehen Sie das proximale Ende des Spenderaortensegments über die proximale Manschette auf der immerwieder verzierten Halsschlagader mit feiner Zange und fixieren Sie es sofort mit einer lose vorgebundenen 7-0 Seidenschlaufe.
2. Schneiden Sie das distale, freie Ende des Aortentransplantats mit Mikroschere, so dass die Transplantatlänge den Abstand zwischen den beiden Manschetten anpasst.
3. Wiederholen Sie Schritt 4.1 am anderen Ende der Aorta mit der anderen Manschette, um die Anastomose abzuschließen.
4. Entfernen Sie die distale Klemme, um eine retrograde Perfusion zu ermöglichen.
5. Nach Erreichen der Hämostase entfernen Sie die proximale Klemme, um die Anastomose zu vervollständigen.
6. Schließen Sie schließlich die Wunde mit 6-0 kontinuierliche Naht.

5. Postoperative Pflege

1. Überwachen Sie die Maus in den ersten 6 h nach der Operation und dann mehrmals täglich für die ersten 72 h nach der Transplantation, um Komplikationen sofort zu erkennen.
2. Bei postoperativer Analgesie die transplantierte Maus direkt nach der Transplantation mit Buprenorphin (0,05-0,1 mg/kg) subkutan und dann alle 12 h für 72 h subkutan injizieren, um eine angemessene, langfristige Analgesie zu gewährleisten.

6. Aortentransplantat-Erklärungen

1. Anästhetisieren Sie das transplantierte Tier mit einer intraperitonealen Injektion von Midazolam (5 mg/kg; 5 mg/ml), Medetomidin (0,5 mg/kg; 1 mg/ml) und Fentanyl (0,05 mg/kg; 0,05 mg/ml) 4 Wochen nach der Transplantation.
   1. Kneifen Sie die Hinterfüße mit Zangen, um nach Reflexen zu suchen, um eine ausreichende Anästhesie zu bestätigen.
2. Clip alle Haare der Bauch-, Brust- und Gebärmutterhalsbereich mit einem elektrischen Haarschneider für kleine Tiere.
3. Legen Sie das Tier in einer Supine-Position auf einem Heizkissen unter dem Mikroskop und verkleben Sie seine Beine vorsichtig mit hautempfindlichen Gipsstreifen an den Operationstisch.
4. Das Operative Feld mehrmals mit Alkohol zu beschrubben.
5. Führen Sie eine Mittellinien-Bauchlaparotomie mit einer kleinen Schere durch und schieben Sie den Darm leicht nach oben, um die unterlegene Vena cava (IVC) freizulegen.
6. Injizieren Sie die minderwertige Vena cava (IVC) mit 1 ml heparinisierter Saline mit einer 30 G Nadel.
7. Schneiden Sie die Bauchaorta und IVC unterhalb der Nierenarterien mit einer kleinen Schere, um das Spendertier zu exsanguinate. Legen Sie eine Kompresse locker in den Bauch, um das Blut zu absorbieren.
8. Machen Sie einen Hautschnitt vom Jugularschnitt nach rechts unter dem Unterkiefer mit einer kleinen Schere entsprechend dem Hautschnitt, der während des Transplantationsvorgangs gemacht wird.
9. Identifizieren Sie das transplantierte Aortentransplantat zusammen mit der distalen und proximalen Manschette und entfernen Sie stumpf jedes umgebende Gewebe mit Zangen.
10. Mit Mikroschere, schneiden Sie durch die gemeinsame Carotis Arterie distal und proximal zum Aortentransplantat mit den Manschetten, um das Aortentransplantat zusammen mit den beiden Manschettenenenden zu explantieren.
11. Schneiden Sie das Aortensegment halbieren und bewahren Sie die Proben für weitere Analysen (gefrorene Abschnitte, paraffineingebettete Abschnitte, Schnapptiefmaterial)^13,14.

Ergebnisse

Im vollständig MHC-Mismatch-Transplantationsmodell ist 4 Wochen nach der Transplantation eine konzentrische neointimale Schicht zu sehen (Abbildung 2). Diese Schicht besteht hauptsächlich aus vaskulären glatten Muskelzellen als immunhistologische Färbung für SM22 (ein selektiver Marker für reife vaskuläre glatte Muskelzellen) offenbart. Wie bereits erwähnt, Diese vaskulären glatten Muskelzellen sind pathognomonisch für Läsionen in chronischer Allograft Vaskulopathie gesehen. Für weitere Anal...

Diskussion

Chronische Allograft Vaskulopathie ist die Hauptursache für späten Transplantatverlust nach solider Organtransplantation des Herzens und wahrscheinlich Nieren- und Lungenallografts⁸. Bisher konnte kein kausales therapeutisches Regime entwickelt werden, um die Bildung von CAV zu verhindern.

Die Pathophysiologie der CAV ist multifaktoriell und beinhaltet immunologische und nicht-immunologische Aspekte¹⁶. Die Verwendung von Nagetiermodellen bei der ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Balb-c Mäuse (H2-d)	Charles River	Stamm# 028	Spendertier
Bipolares Kautersystem	ERBE	ICC 50 / 20195-023	Bipolare Kauter
C57BL/6J (H-2b)	Charles River	Stamm# 027	Empfängertier
Halsey Nadelhalter	FST	12501-12	Nadelhalter
Halsted-Moskito-Zange	AESCULAP	BH111R	Gebogene Klemme
Medizinischer Polyimidschlauch	Nordson MEDICAL	141-0031	Manschettenmaterial
Micro Serrefines	FST	18055-04	Micro Vessel Clip
Micro-Adson-Pinzette (gezahnt)	FST	11018-12	Standard Pinzette
Micro-Serrefine Klemme zum Anwenden von Pinzetten	FST	18057-14	Clipapplicator
S& T Pinzette - SuperGrip Spitzen (abgewinkelt 45°;)	S& T	00649-11	Feine Pinzette
S& T-Gefäß-Dilatationszange - abgewinkelt 10°; (Durchmesser der Spitze 0,2 mm)	S& T	00125-11	Vesseldilatator
Schott VisiLED Set	Schott	MC 1500 / S80-55	Light
Stereoskopisches Mikroskop	ZEISS	SteREO Discovery.V8	Mikroskop
Student Feinschere / OP-Schere - Scharf-Blunt	FST	91460-11 / 14001-12	Standard Schere
Vannas-Tü bingen Federschere (gebogen, 8,5 cm)	FST	15004-08	Mikroskopschere (gebogen)
Vannas-Tü bingen Federschere (gerade, 8,5 cm)	FST	15003-08	Mikroschere (gerade)