Methodenartikel

Modulation der subzellulären Lokalisierung von Tau als Werkzeug zur Untersuchung der Expression krankheitsbedingter Gene

DOI:

10.3791/59988

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20. Dezember 2019

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1Laboratory of Biology, BIO@SNS, Scuola Normale Superiore

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Tau ist ein neuronales Protein, das sowohl im Zytoplasma, wo es Mikrotubuli bindet, als auch im Kern, wo es unkonventionelle Funktionen wie die Modulation von Alzheimer-Gene ausübt. Hier beschreiben wir eine Methode zur Untersuchung der Funktion von nuklearem Tau unter Ausschluss von Interferenzen, die von zytoplasmatischem Tau kommen.

Zusammenfassung

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Tau ist ein Mikrotubuli-bindendes Protein, das in Neuronen exprimiert wird und seine wichtigste bekannte Funktion mit der Aufrechterhaltung der Zytoskelettstabilität zusammenhängt. Jüngste Erkenntnisse deuten jedoch darauf hin, dass Tau auch in anderen subzellulären Kompartimenten vorhanden ist, einschließlich des Kerns, in dem er in den DNA-Schutz, in die rRNA-Transkription, in die Mobilität von Retrotransposons und in die strukturelle Organisation der Nukleolus. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass nukleare Tau an der Expression des VGluT1-Gens beteiligt ist, was auf einen molekularen Mechanismus hindeutet, der die pathologische Zunahme der Glutamatfreisetzung in den frühen Stadien der Alzheimer-Krankheit erklären könnte. Bis vor kurzem war die Beteiligung von Nuclear Tau an der Modulation der Expression von Zielgenen aufgrund technischer Einschränkungen, die den Ausschluss des Beitrags von zytoplasmatischem Tau oder die Wirkung anderer nachgeschaltete Faktoren, die nicht mit dem nuklearen Tau zusammenhängen. Um diese Ungewissheit zu überwinden, entwickelten wir eine Methode, um die Expression von Zielgenen zu untersuchen, die speziell durch das nukleare Tau-Protein moduliert werden. Wir verwendeten ein Protokoll, das die Verwendung von Lokalisationssignalen und der subzellulären Fraktionierung koppelt, was den Ausschluss der Interferenz von den zytoplasmatischen Tau-Molekülen ermöglicht. Vor allem ist das Protokoll einfach und besteht aus klassischen und zuverlässigen Methoden, die allgemein anwendbar sind, um die kernnukleare Funktion von Tau in anderen Zelltypen und zellulären Bedingungen zu untersuchen.

Einleitung

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Die Funktionen des Tau-Proteins im Zellkern haben in den letzten Jahren großes Interesse geweckt, da es nachweislich eng mit Nukleinsäuren1,2,3,4,5,6verbunden ist. Tatsächlich hat eine kürzlich durchgeführte genomweite Studie gezeigt, dass Tau in vivo7genic- und intergene DNA-Sequenzen bindet. Eine Rolle in der nukleolaren Organisation wurde vorgeschlagen8,9,10,11. Darüber hinaus wurde vorgeschlagen, Tau in den DNA-Schutz vor oxidativem und hyperthermischem Stress5,10,12,13, zu beteiligen, während mutierte Tau mit Chromosomeninstabilität und Aneuploidie14,15,16verbunden wurde.

Bisher blieben die Herausforderungen bei der Untersuchung der Funktionen von Tau im Nuklearbereich aufgrund der Schwierigkeiten, den spezifischen Beitrag der nuklearen Tau aus dem Beitrag der zytoplasmatischen Tau zu sezieren, nahezu ungelöst. Darüber hinaus sind die Funktionen, die Tau-Molekülen im Kernraum zugeschrieben werden, bisher nur korrelativ, weil sie keine eindeutige Demonstration der direkten Beteiligung nuklearer Tau-Proteine haben. Die Beteiligung von Tau an der Mobilität von Retrotransposons oder an der rRNA-Transkription oder am DNA-Schutz11,12,17,18,19 könnte auch durch den Beitrag von zytoplasmatischem Tau oder durch die Wirkung anderer nachgelagerter Faktoren, die nicht mit nuklearem Tau zusammenhängen, erklärt werden.

Hier bieten wir eine Methode, die dieses Problem lösen kann, indem wir ein klassisches Verfahren nutzen, um das Kernfach in Kombination mit der Verwendung von Tau-Konstrukten 0N4R mit der T-Flagge für nukleare Lokalisierung (NLS) oder nukleare Exportsignale (NES) zu isolieren. Dieser Ansatz beseitigt die komplexen Probleme im Zusammenhang mit möglichen Artefakten aufgrund des Spillovers von Tau-Molekülen aus dem zytoplasmatischen Fach. Darüber hinaus induzieren Tau-NLS- und Tau-NES-Konstrukte die Anreicherung bzw. den Ausschluss von Tau-Molekülen aus dem Kernraum und bieten positive und negative Kontrollen für die Beteiligung nuklearer Tau-Moleküle an einer bestimmten Funktion. Das Protokoll ist technisch einfach und besteht aus klassischen und zuverlässigen Methoden, die allgemein anwendbar sind, um die kernnukleare Funktion von Tau in anderen Zelltypen zu untersuchen, differenziert oder nicht, wie Krebszellen, die den Tau-Ausdruck20,21reaktivieren. Darüber hinaus könnte es auch auf andere Proteine angewendet werden, die sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern vorhanden sind, um biologische Funktionen im Zusammenhang mit verschiedenen Kompartimenten zu sezieren.

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Protokoll

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1. Zellkultur

  1. Kultur SH-SY5Y-Zellen (menschliche Neuroblastom-Zelllinie, CRL-2266) in vollständigem Medium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium:Nährstoff-Mischung F12 [DMEM/F-12] ergänzt durch 10% fetales Rinderserum [FBS], 2 mM L-Glutamin, 100 U/mL Penicillin und 100 g/ml Streptomycin). Bewahren Sie die Zellen in einem Inkubator bei 37 °C und 5%CO2auf. Zellen in 10 cm Platten wachsen und beim Zusammenfluss aufteilen.

2. Zelldifferenzierung

  1. Um SH-SY5Y-Zellen zu unterscheiden, fügen Sie am Tag nach der Beschichtung 10 M Retinsäure (RA) hinzu, um das Medium für 5 Tage zu vervollständigen.
  2. Der sechste Tag ersetzen Medium durch Differenzierungsmedium: DMEM/F-12 ergänzt durch 50 ng/mL BDNF, 2 mM L-Glutamin. Fügen Sie keine FBS oder Antibiotika hinzu.
  3. Wachsen Sie die Zellen in Differenzierungsmedium für 3 Tage.

3. Chimeric Konstrukte Klonen

  1. Generieren Sie Tau-NLS-Konstrukt durch Klonen durch Restriktionsenzymverdauung im Rahmen am 3' Ende der Tau-Sequenz 0N4R (383aa) die 3xNLS(SV40NLS):5'-CCAAAAAAAAGGTAGATCCAAAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAGAGAAGAGAAAGAGAAAAGAAGAAGAAGAAGAAGA
    HINWEIS: Das 3xNLS am 3' Ende von Tau wird in das pCMV-Tau Plasmid für die Säugetierexpression geklont, indem die XhoI- und BamHI-Beschränkungsstandorte in die Multikloning Site (MCS) ausgenutzt werden.
  2. Generieren Sie Tau-NES-Konstrukt durch Klonen durch Restriktionsenzymverdauung im Rahmen am 3' Ende der Tau-Sequenz 0N4R (383aa) die NES-Sequenz: 5'-AGTGAGCTGCAGAACAAGCTGGAAGAGTTGGCTCTCTCTCGTACAAA-3'.
    HINWEIS: Das NES am 3' Ende von Tau wird in das pCMV-Tau Plasmid geklont, um die EcoRI- und BamHI-Beschränkungsstandorte in das MCS auszunutzen.
  3. Transformieren Sie den DH5alpha E.coli-Stamm mit 100 ng DNA aus Schritt 3.1 oder 3.2 und Plattenzellen auf LB-Agar-Platten mit 100 mg/ml Ampicillin. Lassen Sie über Nacht bei 37 °C wachsen.
  4. Wählen Sie eine einzelne Kolonie und spike die Zellen in 5 ml LB mit Ampicillin. Lassen Sie die Zellen bei 37 °C in Agitation über Nacht wachsen.
  5. Extrahieren Sie Plasmid mit einem DNA-Miniprep (Materialtabelle) und Sequenz, um die Konstrukte zu überprüfen.
  6. Transformieren Sie den DH5alpha E. coli-Stamm mit den sequenzverifizierten Konstrukten und Plattenzellen auf LB-Agar-Platten mit Ampicillin. Lassen Sie über Nacht bei 37 °C wachsen.
  7. Wählen Sie eine einzelne Kolonie und spike die Zellen in 5 ml LB mit Ampicillin. Lassen Sie die Zellen bei 37 °C in Agitation für 2 h wachsen.
  8. Setzen Sie die Zellen aus Schritt 3,7 in 200 ml LB mit Ampicillin. Lassen Sie über Nacht bei 37 °C wachsen.
  9. Pellet die Zellen bei 3.500 x g für 10 min bei 4 °C.
  10. Extrakt-Plasmid mit einem DNA-Maxiprep (Materialtabelle).

4. Zelltransfektion

  1. Samen 400.000 Zellen aus Schritt 1.1 in 6-Well-Platten oder 20.000 Zellen in 8-Well-Kammer-Dias. Platte vier Proben: Kontrollzellen, die mit einem leeren Vektor transfiziert werden sollen, Zellen, die mit nicht markiertem Tau transfiziert werden sollen, Zellen, die mit Tau-NLS transfiziert werden sollen, und Zellen, die mit Tau-NES transfiziert werden sollen.
  2. Am Tag nach der Aussaat transfekieren 400 ng DNA für jeden Brunnen mit den kationischen Lipiden (Tabelle der Materialien) in 6-Well-Platten oder 200 ng DNA für jeden Brunnen für 8-Well-Kammer-Dias, nach den Anweisungen des Herstellers.
    1. Inkubieren Sie die DNA und die kationischen Lipide getrennt in 250 l (für 6-Well-Platten) oder 25 l (für 8-Well-Kammer-Dias) des reduzierten Serummediums für 5 min bei RT. Dann kombinieren Sie sie, um den DNA-Lipid-Komplex zu erzeugen und für 20 min zu brüten.
    2. Ersetzen Sie das Kulturmedium durch 2 ml (für 6-Well-Platten) oder 250 l (für 8-Well-Kammerrutschen) eines frischen Kompletten Kulturmediums. Fügen Sie den DNA-Lipid-Komplex zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C über Nacht.
  3. Alternativ kann die DNA mit dem kationischen Reagenz Polyethylenimin (PEI) transfekt werden.
    1. Mischen Sie 2 g DNA und 6 l PEI mit 200 l vollständigem Kulturmedium (für jeden Brunnen in 6-Well-Platten) oder 1 g DNA und 3 l PEI mit 100 l komplettem Kulturmedium (für jeden Brunnen in 8-Well-Kammer-Dias) , Wirbel und inkubieren für 10 min bei RT.
    2. Fügen Sie die Mischung zu den Zellen hinzu und fügen Sie 1,8 ml komplettes Kulturmedium pro Brunnen in 6-Well-Platten oder 150 l komplettes Kulturmedium pro Brunnen in 8-Well-Kammerrutschen hinzu, um das Beschichtungsvolumen zu erreichen.
  4. Ändern Sie das Medium am Tag nach der Transfektion und fügen Sie die Differenzierungsmedien hinzu, wie in Schritt 2.2 beschrieben.

5. Immunfluoreszenz

  1. Entfernen Sie das Kulturmedium und spülen Sie Zellen mit 1x PBS. Fix Zellen mit 100% eiskaltem Methanol für 3 min ohne schütteln. Entfernen Sie die Befestigungslösung und waschen Sie sie kurz mit 1x PBS.
  2. Permeabilisieren Sie mit 0,1% nichtionischem Tensid in 1x PBS für 5 min bei Raumtemperatur (RT). Kurz mit 1x PBS waschen, 3 mal.
  3. Inkubieren Sie Zellen mit Sperrpuffer (0,1% Tween 20 und 1% BSA in PBS) für 30 min bei RT auf einem Orbitalshaker.
  4. Inkubieren Sie mit geeigneten primärantikörpern (z. B. Mausmonoklonaler Anti-Tau13-Antikörper) verdünnt 1:500 im Sperrpuffer über Nacht bei 4 °C auf einem Orbitalshaker. Entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie kurz mit 1x PBS.
  5. Inkubieren Sie mit sekundären Antikörpern, die mit Fluorophor konjugiert sind (z. B. Ziegenanti-Maus-Antikörper konjugiert mit Alexa Fluor 633) verdünnt 1:500 im Sperrpuffer für 1 h bei RT. Entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie sie kurz mit 1x PBS 3 mal.
  6. Um Kerne zu färben, mit DAPI verdünnt 1:20,000 in Sperrpuffer für 10 min bei RT. Waschen Sie mit 1x PBS 3 mal. Montieren Sie Abdeckungen auf einem Dia mit Antifade-Montagemedium.

6. Western Blot

  1. Um das Zellpellet aus Schritt 4.4 zu sammeln, entfernen Sie das Medium und waschen Sie Zellen mit PBS. Inkubieren Sie mit 500 l 0,1% Trypsin für 4 min bei 37 °C. Fügen Sie ein gleiches Volumen vollständiger Medien hinzu, und setzen Sie Zellen erneut aus.
  2. Sammeln Sie Zellen in einem Rohr und Zentrifuge bei 500 x g für 5 min. Am Ende der Zentrifugation vorsichtig entfernen Sie den Überstand. 1 ml PBS, Zentrifuge bei 500 x g für 5 min hinzufügen und den Überstand vorsichtig entfernen. Zellpellets zur sofortigen Verwendung auf Eis lagern oder bei -80 °C einfrieren, um sie langfristig zu lagern.
  3. Für Proteinextrakte insgesamt das Zellpellet für 30 min auf Eis im Lysepuffer (20 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM NaCl, 10% Glycerin, 1% Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, verzweigt (Materialtabelle),10 mM EDTA) ergänzt mit Protease- und Phosphataseinhibitoren. Verwenden Sie entsprechend der Häufigkeit des Pellets einen Lysepuffer von 50 bis 100 l.
    1. Zentrifugieren Sie den Extrakt bei 16.000 x g für 15 min. Sammeln Sie den Überstand und quantifizieren Sie die Proteinkonzentration durch einen Standard-Quantifizierungstest. Bereiten Sie die Proteinproben für die SDS-PAGE vor, indem Sie 20 g Proteine mit 5 l 4x Laemmli Puffer in einem Gesamtvolumen von 20 'L mischen und bei 100 °C für 5 min kochen.
      HINWEIS: Die Probe kann bei -20 °C gelagert werden.
  4. Für subzelluläre Fraktionen, setzen Sie Zellen aus Schritt 6.2 in vollständigem Medium, und sammeln 1 x 106 Zellen pro Probe. Zentrifuge bei 500 x g für 10 min, um Zellpellets für die folgenden Schritte zu erhalten.
    1. Um subzelluläre Fächer zu isolieren, fraktionieren Sie nach Denkit-Spezifikationen. Um jede Fraktion zu isolieren, inkubieren Sie das Zellpellet aus Schritt 6.4 mit dem entsprechenden Puffer, Zentrifuge, sammeln Sie den Überstand und fügen Sie den nächsten Puffer zum Pellet hinzu, wie in 6.4.1.1-6.4.1.5 beschrieben. Fügen Sie in der Reihenfolge zytoplasmatische Extraktionspuffer, Membranextraktionspuffer, Kernextraktionspuffer, Kernextraktionspuffer ergänzt mit 5 mM CaCl2 und 3 U/ L Mikrokokken-Nuklease und Zytoskelettextraktionspuffer hinzu.
      HINWEIS: Alle Puffer müssen mit Proteasehemmern ergänzt werden. Skalieren Sie Puffervolumes entsprechend dem Volumen des Zellpellets.
      1. Um die zytosolische Fraktion zu isolieren, inkubieren Sie Zellpellets in 100 l eiskalten zytoplasmatischen Extraktionspuffer, ergänzt mit Proteasehemmern bei 4 °C mit sanfter Mischung für 10 min. Zentrifugieren bei 500 x g bei 4 °C für 5 min und übertragen Sie den Überstand in vorgekühlte Röhrchen.
      2. 100 l eiskalten Membranextraktionspuffer mit Proteaseinhibitoren ergänzt in das Pellet ab Schritt 6.4.1.1 geben und bei 4 °C mit sanfter Mischung für 10 min inkubieren. Zentrifuge bei 3.000 x g bei 4 °C für 5 min und das Überstand sammeln.
      3. Für die lösliche Kernfraktion 50 L Kernextraktionspuffer, ergänzt mit Proteasehemmern, zum Pellet ab Schritt 6.4.1.2 und Wirbel hinzufügen. Bei 4 °C 30 min zentrieren, bei 5.000 x g bei 4 °C für 5 min zentrieren und den Überstand einsammeln.
      4. Für die unlösliche Kernfraktion 50 L kernionischen Extraktionspuffer s, ergänzt mit Proteasehemmern, CaCl2 und Mikrokokken-Nuklease, zum Pellet ab Schritt 6.4.1.3 und Wirbel hinzufügen. Bei 37 °C 5 min inkubieren und dann wieder wirbeln. Zentrifuge bei 16.000 x g bei RT für 5 min und den Überstand sammeln.
      5. Für die Zytoskelettfraktion 50 L Zytoskelettextraktionspuffer, ergänzt mit Proteasehemmern, zum Pellet ab Schritt 6.4.1.4 und Wirbel hinzufügen. 10 min bei RT inkubieren. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 16.000 x g für 5 min, sammeln Sie den Überstand und entsorgen Sie das Pellet.
        HINWEIS: Skalieren Sie Puffervolumes entsprechend dem Zellenvolumen, wie im Kit-Protokoll angegeben. Weitere Informationen zur Inkubations- und Zentrifugationszeit und Temperatur22,23,24,25,26,27,28,29finden Sie im Kit-Protokoll. Alternativ können Sie auch alle Standardmethoden30 anwenden, die durch die Verwendung von Reinigungsmitteln und durch Erhöhung der Ionenstärke und Zentrifugationsgeschwindigkeit die zytosolischen, membrangebundenen, zytoskelettalen und nuklearen Fraktionen trennen. Trennen Sie die lösliche Kernfraktion und die unlösliche Kernfraktion, indem Sie Standardpuffer für die nukleare Extraktion nutzen. Die Probe kann bei -20 °C gelagert werden.
    2. Fügen Sie für den SDS-PAGE 7 l 4x Laemmli-Puffer zu 20 L subzellulären Fraktionen hinzu, die aus den Schritten 6.4.1.1-6.4.1.5 gewonnen werden, bei 100 °C für 5 min kochen.
  5. Proben auf ein Acrylamid-Gel laden und Elektrophorese bei einer konstanten Spannung von 120 V durchführen. Übertragen Sie Proteine bei 250 mA für 90 min.
  6. Überprüfen Sie die richtige Protein-Gel-Elektrophorese und erfolgreiche Slotting durch Inkubation der Membran für 5 min in Ponceau Färbung Lösung. Spülen Sie die Membran in destilliertem Wasser, bis der Hintergrund sauber ist. Entfernen Sie den Fleck durch fortgesetztes Waschen mit Tris gepufferter Salinmitin mit Tween 20 (TBST) für 10 min auf einem Shaker.
  7. Inkubieren Sie die Membran mit Blockierlösung (5% Milch in TBST) für 1 h bei RT auf Shaker. Waschen Sie 3 mal mit TBST für 5 min.
  8. Hybridisieren Sie die Membran mit dem Primärantikörper in Blockierlösung (1% Milch in TBST) über Nacht bei 4 °C. Waschen Sie 3 mal mit TBST für 5 min.
  9. Hybridisieren Sie die Membran mit dem HRP-konjugierten Sekundärantikörper in Blockierlösung für 1 h bei RT. 3 mal mit TBST für 5 min waschen.
  10. Erkennen Sie das Proteinband mit Chemilumineszenz. Quantifizieren Sie die Intensität von Western Blot Bands von ImageJ. Normalisieren Sie die Proteinexpression auf das Produkt eines Haushaltsgens: Histon H2B für die kernlösliche und unlösliche Fraktion, GAPDH für die zytoplasmatische Fraktion und für Gesamtextrakte.

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Ergebnisse

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Die Strategie zur Sezieren der Auswirkungen von nuklearem Tau in der Genexpression unter Vermeidung des Beitrags von zytoplasmatischen Tau-Proteinen wurde in Abbildung 1dargestellt. Kurz gesagt, Werden Tau-Proteine, die mit NLS oder NES markiert sind, im nuklearen Fach angesammelt bzw. aus dem Nuklearfach ausgeschlossen. Die funktionelle Wirkung dieses Ungleichgewichts ist die Veränderung der Genexpression, gemessen als Produkt des VGluT1-Gens.

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Diskussion

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Wir beschreiben eine Methode, um die Auswirkungen des nuklearen Tau-Proteins auf die Genexpression zu messen. Mit diesem Protokoll ist der Beitrag der zytoplasmatischen Tau stark begrenzt. Kritische Schritte dieses Protokolls sind die folgenden: die Differenzierung der menschlichen Neuroblastom-SH-SY5Y-Zellen, die subzelluläre Fraktionierung und die Lokalisierung von Tau-Protein im Kernraum.

Erstens, wie im repräsentativen Ergebnisabschnitt gezeigt, ist die Differenzierung von SH-SY5Y-Zellen d...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Scuola Normale Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Alexa Fluor 633 Anti-Maus-IgGLife TechnologiesA21050IF 1:500
Anti-Aktin-AntikörperBETHYL LABORATORIEA300-485AAnti-Kaninchen-WB 1:10.000
Anti-GAPDH-AntikörperFitzgerald Industries International10R-G109aAnti-Maus-WB 1:10.000
Anti-H2B-AntikörperAbcamab1790Anti-Kaninchen-WB 1:15.000
Anti-Tau-13-AntikörperSanta Cruz Biotechnologysc-21796Anti-Maus-WB 1:1.000; IF 1:500
Anti-Tubulin alpha AntikörperThermo Fisher ScientificPA5-16891Anti-Maus WB 1:5.000
Anti VGluT1 AntikörperSigma-AldrichAMAb91041Anti-Maus WB 1:500
BCA Protein Assay KitEurocloneEMPO14500
BDNFAlomone LabsB-250
Blotting-Grade BlockerBiorad1706404Fettfreie Trockenmilch
BOVIN SERUM ALBUMINSigma-AldrichA4503-50g
cOmplete MiniRoche11836170001Proteasehemmer
Kriterium TGX 4-20% Fleckenfrei, 10 wellBiorad5678093
DAPIThermo Fisher Scientific62247
DMEM/F-12GIBCO21331-020
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low GlucoseEurocloneECM0060L
EDTASigma-Aldrich0390-100mlpH = 8, 0,5 M
Fötales RinderserumEurocloneEC50182L
GlycerolSigma-AldrichG5516-500ml
Ziege Anti-Maus IgG-HPRSanta Cruz Biotechnologiesc-2005WB 1:1.000
Ziege Anti-Kaninchen IgG-HPRSanta Cruz Biotechnologysc-2004WB 1:1.000
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896-50mlOctylphenoxypoly(ethyleneoxy)ethanol
Immobilon WesternMERCKWBKLS0500
Lab-Tech Chamber Slide 8 Well Glasobjektträgernunc177402
L-GlutaminEurocloneECB3000D100X
Lipofectamine 2000 TransfektionsreagenzThermo FisherScientific 12566014kationisches Lipid
MethanolSigma-Aldrich322415-6X1L
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100G
NaClSigma-AldrichS3014-1kg
Opti-MEM reduziertes SerummediumGibco31985070
PEISigma-Aldrich40,872-7
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific1514012210.000 U/ml, 100 mL
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (Dulbecco A)OXOIDBR0014G
PhosStopRoche4906837001Phosphatase-Inhibitor
QIAGEN Plasmid Maxi KitQiagen12163Schritt 3.10
RetinsäureSigma-AldrichR2625-100mg
Proteinfraktionierungskit für kultivierte ZellenThermo Fisher Scientific78840
Unterstützte NitrozellulosemembranBiorad1620097
TC-Plate 6wellSARSTEDT833,920
TCS SP2 konfokales Laserscanning-MikroskopLeicaN/A
Triton x-100Sigma-AldrichX100-500mlNichtionisches Tensid
Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific154000540,50%
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100ml
VECTASHIELD Antifading-EindeckmediumVector LaboratoriesH-1000
Wizard Plus SV Minipreps DNA-AufreinigungssystemePromegaA1330Stufe 3.5
Subzelluläres

Referenzen

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