Modulation der subzellulären Lokalisierung von Tau als Werkzeug zur Untersuchung der Expression krankheitsbedingter Gene

Giacomo Siano; Maria Claudia Caiazza; Martina Varisco; Mariantonietta Calvello; Valentina Quercioli; Antonino Cattaneo; Cristina Di Primio

doi:10.3791/59988

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Methodenartikel

Modulation der subzellulären Lokalisierung von Tau als Werkzeug zur Untersuchung der Expression krankheitsbedingter Gene

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DOI:

10.3791/59988

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20. Dezember 2019

Giacomo Siano¹ , Maria Claudia Caiazza¹ , Martina Varisco¹ , Mariantonietta Calvello¹ , Valentina Quercioli¹ , Antonino Cattaneo¹ , Cristina Di Primio¹

¹Laboratory of Biology, BIO@SNS, Scuola Normale Superiore

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Tau ist ein neuronales Protein, das sowohl im Zytoplasma, wo es Mikrotubuli bindet, als auch im Kern, wo es unkonventionelle Funktionen wie die Modulation von Alzheimer-Gene ausübt. Hier beschreiben wir eine Methode zur Untersuchung der Funktion von nuklearem Tau unter Ausschluss von Interferenzen, die von zytoplasmatischem Tau kommen.

Zusammenfassung

Tau ist ein Mikrotubuli-bindendes Protein, das in Neuronen exprimiert wird und seine wichtigste bekannte Funktion mit der Aufrechterhaltung der Zytoskelettstabilität zusammenhängt. Jüngste Erkenntnisse deuten jedoch darauf hin, dass Tau auch in anderen subzellulären Kompartimenten vorhanden ist, einschließlich des Kerns, in dem er in den DNA-Schutz, in die rRNA-Transkription, in die Mobilität von Retrotransposons und in die strukturelle Organisation der Nukleolus. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass nukleare Tau an der Expression des VGluT1-Gens beteiligt ist, was auf einen molekularen Mechanismus hindeutet, der die pathologische Zunahme der Glutamatfreisetzung in den frühen Stadien der Alzheimer-Krankheit erklären könnte. Bis vor kurzem war die Beteiligung von Nuclear Tau an der Modulation der Expression von Zielgenen aufgrund technischer Einschränkungen, die den Ausschluss des Beitrags von zytoplasmatischem Tau oder die Wirkung anderer nachgeschaltete Faktoren, die nicht mit dem nuklearen Tau zusammenhängen. Um diese Ungewissheit zu überwinden, entwickelten wir eine Methode, um die Expression von Zielgenen zu untersuchen, die speziell durch das nukleare Tau-Protein moduliert werden. Wir verwendeten ein Protokoll, das die Verwendung von Lokalisationssignalen und der subzellulären Fraktionierung koppelt, was den Ausschluss der Interferenz von den zytoplasmatischen Tau-Molekülen ermöglicht. Vor allem ist das Protokoll einfach und besteht aus klassischen und zuverlässigen Methoden, die allgemein anwendbar sind, um die kernnukleare Funktion von Tau in anderen Zelltypen und zellulären Bedingungen zu untersuchen.

Einleitung

Die Funktionen des Tau-Proteins im Zellkern haben in den letzten Jahren großes Interesse geweckt, da es nachweislich eng mit Nukleinsäuren¹^,²^,³,⁴^,⁵^,⁶verbunden ist. Tatsächlich hat eine kürzlich durchgeführte genomweite Studie gezeigt, dass Tau in vivo⁷genic- und intergene DNA-Sequenzen bindet. Eine Rolle in der nukleolaren Organisation wurde vorgeschlagen⁸^,⁹^,¹⁰