Summary
इस प्रोटोकॉल को भ्रूण से वयस्क तक हर विकासात्मक चरण में ड्रोसोफिला की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। विधि का उपयोग विभिन्न जीनोटाइपों या विकास स्थितियों की व्यवहार्यता को निर्धारित करने और उनकी तुलना करने के लिए किया जा सकता है।
Abstract
Drosophila मेलेनोगैस्टरमें, व्यवहार्यता परख कुछ आनुवंशिक पृष्ठभूमि की फिटनेस निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है. एलीगिक विविधताओं के परिणामस्वरूप विकास के विभिन्न चरणों में व्यवहार्यता की आंशिक या पूर्ण हानि हो सकती है। हमारी प्रयोगशाला भ्रूण से पूरी तरह से परिपक्व वयस्क के लिए Drosophila में व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए एक विधि विकसित की है. विधि विकास के दौरान विभिन्न चरणों में मौजूद संतान की संख्या की मात्रा निर्धारित करने पर निर्भर करता है, रचित भ्रूण के साथ शुरू. भ्रूणों की मात्रा निर्धारित करने के बाद, अतिरिक्त चरणों की गणना की जाती है, जिसमें एल1/एल 2, प्यूपा और परिपक्व वयस्क शामिल हैं। सभी चरणों की जांच करने के बाद, ची-वर्ग परीक्षण जैसे सांख्यिकीय विश्लेषण का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जाता है कि क्या संतान की प्रारंभिक संख्या (हैच्ड भ्रूण) और बाद के चरणों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर है जो वयस्कों की मनाया संख्या में समाप्त होता है, इस प्रकार शून्य परिकल्पना को अस्वीकार या स्वीकार करना (कि बच्चे पैदा हुए भ्रूणों की संख्या विकास के चरणों में दर्ज लार्वा, प्यूपा और वयस्कों की संख्या के बराबर होगी)। इस परख का प्राथमिक लाभ अपनी सादगी और सटीकता है, क्योंकि यह एक भ्रूण कुल्ला की आवश्यकता नहीं है उन्हें भोजन शीशी के लिए हस्तांतरण, तकनीकी त्रुटियों से नुकसान से बचने. यद्यपि यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल सीधे L2/L3 लार्वा की जाँच नहीं करता है, अतिरिक्त चरणों को इन के लिए खाते में जोड़ा जा सकता है। अंडे से निकलने वाले भ्रूणों, एल 1, प्यूपा और वयस्कों की संख्या की तुलना करने से यह निर्धारित करने में मदद मिल सकती है कि आगे के अध्ययनों के लिए एल 2/एल 3 चरणों के दौरान व्यवहार्यता के साथ समझौता किया गया था या नहीं (रंगीन भोजन का उपयोग लार्वा की दृश्य पहचान के साथ मदद करता है)। कुल मिलाकर, इस विधि Drosophila शोधकर्ताओं और शिक्षकों की मदद कर सकते हैं निर्धारित जब व्यवहार्यता मक्खी जीवन चक्र के दौरान समझौता किया है. इस परख का उपयोग कर शेयरों की नियमित आकलन माध्यमिक उत्परिवर्तनों कि मूल रूप से अलग उत्परिवर्ती के phenotype को प्रभावित कर सकते हैं के संचय को रोका जा सकता है, खासकर अगर मूल उत्परिवर्तनों फिटनेस को प्रभावित. इस कारण से, हमारी प्रयोगशाला हमारे डीएम ime4 alleles में से प्रत्येक के कई प्रतियां रखता है और नियमित रूप से अन्य आणविक विश्लेषण के अलावा इस विधि के साथ प्रत्येक शेयर की शुद्धता की जाँच करता है.
Introduction
लाइफस्पैन आनुवंशिक और गैर-आनुवंशिक कारकों से प्रभावित होता है। कमरे के तापमान पर मानक प्रयोगशाला वृद्धि की स्थिति में, हमारी प्रयोगशाला ने समान परिस्थितियों में उगाए गए विभिन्न डीएम आईएम4 एलेल्स के बीच स्वास्थ्य और व्यवहार्यता में महत्वपूर्ण भिन्नता देखी है (चित्र 1 और पूरक आंकड़े)। जनसंख्या आनुवंशिक अध्ययन1,2,3,4में एक निश्चित एलील संयोजन या वृद्धि की स्थिति के प्रभावों की जांच करने के लिए प्राय : व्यवहार्यता अध्ययन किए जाते हैं . तथापि, उत्परिवर्तनों के एक गैर-पूरक समूह के भीतर व्यवहार्यता का विस्तृत विश्लेषण वैज्ञानिक साहित्य में मिलना कठिन है। एक एलेले को आमतौर पर "गैर-जरूरी" कहा जाता है यदि शोधकर्ता को कुछ व्यक्तियों को भोजन की शीशी के भीतर उस एलेके के लिए समयुग्मज लगता है जिसमें संतुलित स्टॉक5,6है। तथापि, सटीक ची-वर्ग विश्लेषण यह आकलन करने के लिए कि क्या ये समयुग्मज अपेक्षित मेंडेलियन अनुपात में उत्पन्न होते हैं,5,6की सूचना नहीं दी जाती है . किसी भी Drosophila स्टॉक के लिए सबसे स्वीकार्य तापमान कमरे का तापमान (22-23 डिग्री सेल्सियस) है और उपयुक्त पोषक तत्वों के साथ, जंगली प्रकार मक्खियों के जीवन चक्र लगभग बारह दिन लगते हैं7,8पूरा करने के लिए. चूंकि जंगली-प्रकार के ड्रोसोफिला के प्रत्येक विकासात्मक चरण की अवधि7,8ज्ञात है, इस रिपोर्ट में वर्णित विधि का उपयोग यह जांचने के लिए किया जा सकता है कि अध्ययन के अंतर्गत ड्रोसोफिला स्ट्रेन प्रत्येक चरण में उपयुक्त है या नहीं। आनुवंशिक पृष्ठभूमि का परीक्षण के लिए उपयुक्त नियंत्रण की तुलना में. विकास9के एक विशिष्ट पहलू पर ध्यान केंद्रित करने वाले अध्ययनों के विपरीत, यह प्रोटोकॉल विभिन्न विकासात्मक चरणों में व्यवहार्यता का आकलन करने का एक व्यावहारिक तरीका प्रदान करता है।
हमारी प्रयोगशाला में, इस प्रोटोकॉल का उपयोग मीयोसिस 4 (डीएम आईम4)के ड्रोसोफिला प्रेरक के लिए कमी वाले स्टॉक की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए किया जाता है। डीएम Ime4 एक आवश्यक जीन10 है कि Drosophila और अन्य बहुकोशिकीय जीवों में आरएनए चयापचय में महत्वपूर्ण भूमिकाओं के साथ एक आरएनए मिथाइलट्रांसफरेस encodes5,6,10, 11 , 12 , 13 , 14 . CRISPR/Cas9 (पूरक चित्र) के माध्यम से उत्पन्न डीएम ime4 के उपन्यास alleles का शीघ्रता से मूल्यांकन करने के लिए, एक अंत बिंदु व्यवहार्यता परख किया गया था कि केवल संतुलित स्टॉक की शीशियों के भीतर उत्पादित वयस्क संतान की गणना (चित्र 1)। इस्तेमाल किए गए कुछ स्टॉक का वर्णन पिछले डीएम आईएम 4 रिपोर्ट5,6में किया गया था . समयुग्मज उत्परिवर्ती उप-मेन्लियन स्तरपर उभरा, जैसा कि ची-वर्ग विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया है (चित्र 1 और पूरक सामग्री)। यह आकलन करने के लिए कि क्या ये कम-से-कम अपेक्षित संख्याएं कम भ्रूण ों के कारण रखी जा रही हैं, या कम पैदा हुए भ्रूण, या L1/L2 या प्यूपा में व्यवहार्यता की हानि के कारण, हमने इन विकासात्मक चरणों में से प्रत्येक में गणना ओंठ शामिल करने के लिए ट्रैकिंग का विस्तार किया (चित्र 2, चित्र 3, चित्र 4, चित्र 5, चित्र 6, चित्र 7, चित्र 8, और चित्र 9) .
यहाँ, हम जंगली प्रकार (OreR) मक्खियों का उपयोग कर विधि का वर्णन. अनुभवजन्य अन्य आनुवंशिक पृष्ठभूमि या Drosophila प्रजातियों के साथ उपयोग के लिए इस विधि का परीक्षण करने के लिए, हम एक संदर्भ के रूप में OreR का उपयोग कर और प्रयोगात्मक जीव के अनुसार timepoints समायोजित करने की सलाह देते हैं। इस प्रोटोकॉल का मूल्यांकन आगे किया गया था ताकि कुंवारी जंगली-प्रकार की महिलाओं को पार करके वंशी की व्यवहार्यता का आकलन किया जा सके जिसमें पुरुषों के साथ एक विषमयुग्मज डीएम आईम4 उत्परिवर्ती स्टॉक5,6 ( चित्र4) था।
Protocol
1. मीडिया तैयारी
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार अंगूर की आगर तैयार करें (सामग्री की तालिकादेखें ) और एक 35 मिमी पेट्री डिश में आधा पूर्ण करने के लिए डालना (चित्र 5) . लगभग 1 ज के लिए ठोस करने की अनुमति दें। अंगूर के बाद agar solidifies, तुरंत उपयोग करें या 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.
- धीरे से एक छोटे से प्लास्टिक चाकू का उपयोग कर आगर प्लेट भर में खरोंच बनाने (मक्खी असमान सतहों पर रखना करने के लिए की तरह) खरोंच के बिना थाली के बीच छोड़ने (चित्र 5) . प्लेट के केंद्र में खमीर पेस्ट की एक छोटी राशि रखें (ताजा बनाया गया; सामग्री की सारणीदेखें ) ( चित्र5)।
2. भ्रूण संग्रह मिनी पिंजरे सेट अप
- दो कुंवारी महिलाओं और एक युवा पुरुष का उपयोग कर एक क्रॉस सेट अंगूर agar प्लेट खमीर पेस्ट के साथ पूरक युक्त भ्रूण संग्रह पिंजरे के अंदर (चित्र 5).
- 24 ज के बाद, agar प्लेट के नीचे देख कर पिंजरे को खोलने के बिना रखी भ्रूण के लिए पिंजरों का निरीक्षण. यदि भ्रूण बिछाए गए हैं तो आगर की प्लेट को कक्ष से निकालकर सूक्ष्म प्रेक्षण के लिए आर्द्र कक्ष के अंदर रख दें (चित्र 6)। यदि बिछाने के कई दिनों रन बनाए हैं (जैसे, प्रजनन / लंबी उम्र परख), प्रजनन माता पिता रखने के लिए और एक ताजा एक के रूप में वर्णित के साथ थाली की जगह. कम से कम 24 एच के प्रारंभिक संग्रह किया जा सकता है, लेकिन, जब कुंवारी महिलाओं का उपयोग कर, ध्यान रखें कि वे 48 एच तक उनके प्यूपा मामले से उभरने के बाद नहीं रखना होगा.
- निर्जलीकरण से बचने के लिए पेट्री डिश ढक्कन से युक्त एगर प्लेट को ढककर रख दें और इसे आर्द्र कक्ष के अंदर तुरंत रखें (चित्र 7) । विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी तथा अभिलेखित भ्रूण तथा एल1 के अंतर्गत प्रेक्षण कीजिए। नम कक्ष में कमरे के तापमान पर ढक्कन को तब तक बदलें जब तक कि सभी भ्रूण एल1 लार्वा में न पैदा हुए और विकसित न हो जाएं (चित्र 6) .
3. गिनती भ्रूण और लार्वा
- 48 ज के बाद, विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी के नीचे प्लेटों का निरीक्षण करें और खाद्य शीशी के लिए आगर डिस्क के स्थानांतरण से पहले एक आखिरी बार संख्या रिकॉर्ड करें। उर्वरित/व्यवहार्य भ्रूण तब तक L1 बन जाना चाहिए। हस्तांतरण से पहले लंबी ऊष्मायन अवधि संभव है लेकिन ध्यान रखें कि प्लेटें नमी खोने लग सकती हैं और आगर खाद्य शीशियों के लिए एक साफ हस्तांतरण समझौता दरार हो सकता है (चित्र 7) . यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्लेटें हाइड्रेटेड रहें और गणना के दौरान भ्रूण व्यवहार्यता के साथ समझौता नहीं किया गया है, आगर सतह पर एक सीधा गूजनेक प्रकाश का उपयोग करने से बचें (चित्र7ई एक उचित दूरी दिखाता है)।
- गिनती के बाद, थाली को कवर और यह नम कक्ष में स्टोर जब तक हस्तांतरण करने के लिए तैयार है. रिकॉर्ड निष्कर्ष.
4. विकास के दौरान व्यवहार्यता की निगरानी के लिए एक खाद्य Vial करने के लिए अंगूर आगर डिस्क स्थानांतरण
- एक बार संख्या दर्ज कर रहे हैं (हैच्ड भ्रूण/L1/L2), ध्यान से एक शीशी के लिए अंगूर agar डिस्क हस्तांतरण करने के लिए एक spatula का उपयोग करें पर्याप्त एक 35 मिमी डिस्क निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार Drosophila खाद्य मीडिया युक्त समायोजित करने के लिए (की सूची को देखें अभिकर्मकों). अंगूर की आगर डिस्क L1-साइड को भोजन पर रखें (चित्र 7)। आगर डिस्क को लार्वा के साथ खाद्य शीशी में स्थानांतरित करने के बाद, सावधानी पूर्वक किसी भी लार्वा के लिए खाली पेट्री डिश का निरीक्षण करें (चित्र 7ई)।
- प्रतिदिन लगभग एक ही समय में, लगभग एक ही समय में, प्रत्येक दिन भोजन की शीशियों का निरीक्षण करने के लिए एक कार्यक्रम निर्धारित करें, यह सुनिश्चित करने के लिए L2/L3 लार्वा शीशी में भोजन के लिए अपना रास्ता बनाते हुए देखे जाते हैं (चित्र 8)।
- प्यूपा और वयस्क ड्रोसोफिला की संख्या को रिकार्ड करें (चित्र 9)। कोई और अधिक वयस्कों मनाया जाता है जब तक गिनती रखें और निम्नलिखित पीढ़ी की गिनती से बचने (पहले वयस्कों को देखने के बाद पिछले 9 दिनों की गिनती नहीं है).।
- निष्कर्षों का निरीक्षण कीजिए और उन्हें अभिलिखित कीजिए। भ्रूण संग्रह, गिनती की समय सीमा को समायोजित करें, और उत्परिवर्ती शेयर करने के लिए तदनुसार रिकॉर्डिंग इस्तेमाल किया जा रहा है.
- एक ची वर्ग विश्लेषण प्रदर्शन करते हैं। शून्य परिकल्पना 100% व्यवहार्यता इस तरह है कि वयस्कों की संख्या से पैदा भ्रूण और L1 मूल रूप से दर्ज की गई और खाद्य शीशियों को स्थानांतरित की संख्या के बराबर हो जाएगा मानता है
Representative Results
इस विधि सही और reproducibly एक भ्रूण से उभरा वयस्कों के लिए व्यवहार्यता गेज करने के लिए अनुमति देता है जब ची वर्ग विश्लेषण करने के लिए युग्मित.
प्रारंभिक अध्ययन में, भ्रूण और लार्वा की गिनती के बाद, अंगूर आगर शीशी के किनारे पर सीधे शीशी के अंदर रखा गया था। दुर्भाग्य से, जब agar शीशी के पक्ष में रखा गया था भ्रूण और लार्वा के कई वयस्कों के लिए परिपक्व नहीं था. यह अंगूर की आगर डिस्क सुखाने के कारण होने की संभावना थी (चित्र 3) . इस स्थान के परिणाम ों को भ्रमित कर सकता है कि एक पर्यावरण चर (आगर डिस्क के निर्जलीकरण) शुरू की. लगभग 39% संतान भ्रूण के बीच वयस्क के लिए खो गया था के रूप में वयस्कों के केवल 61% उभरा. सबसे बड़ा नुकसान L1 लार्वा के बीच हुई (अंगूर की आगर प्लेटों की सतह पर गिना) और प्यूपा (खाद्य शीशियों की दीवारों पर गिना) मायने रखता है. तथापि, जब अंगूर के आगार को खाद्य सतह के साथ सीधे संपर्क में शीशी के अंदर रखा गया था, तो संतान का 6% से कम खो गया था (चित्र 2)। पूरी अंगूरी डिस्क शीशी के अंदर तत्काल भोजन की नमी के संपर्क में रहने के कारण आगर हाइड्रेटेड रही (चित्र 7, चित्र 8) . इन परिणामों से संकेत मिलता है कि शीशी के अंदर agar की स्थिति विश्वसनीय डेटा प्राप्त करने और पर्यावरण चर के योगदान को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है. विधि की प्रभावशीलता का समर्थन करने के लिए आगे डेटा एक संतुलित डीएम ime4 उत्परिवर्ती स्टॉक से पुरुषों के लिए कुंवारी जंगली प्रकार महिलाओं को पार करके उत्पन्न प्रारंभिक विधि सत्यापन और संतान में इस्तेमाल जंगली प्रकार संतान की तुलना द्वारा एकत्र किया गया था ( पूरक चित्र 2, ime4[null/ लगभग 91% संतति वयस्कता के लिए परिपक्व हो गई, जबकि वनिता का 94% वंशानुरूप से होता है (चित्र 4) . यह अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं था।
Homogygous Dm ime4 उत्परिवर्ती पुरुषों5 भी विधि के आगे सत्यापन प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया गया. हालांकि, समयुग्मज उत्परिवर्ती भी प्रजनन करने के लिए बीमार थे और भ्रूण जमा करने से पहले मर गया. इसलिए, प्रयोग की एक सीमा यह है कि पुरुषों को ट्रैक करने के लिए एक प्रारंभिक भ्रूण जनसंख्या उत्पन्न करने के लिए पुन: पेश करने के लिए पर्याप्त स्वस्थ होने की जरूरत है।
चित्र 1 : Dm ime4 उत्परिवर्ती शेयरों उप-Mendelian स्तर पर उभरने. स्टॉक जिसमें उत्प्रेरक डोमेन या Ado-Met बाइंडिंग डोमेन के कुछ हिस्सों को उत्परिवर्तित किया गया है दिखाया गया है (विवरण के लिए पूरक चित्र 1 को देखें)। कुछ शेयरों या तो डोमेन के भाग था Ala (alanine-स्कैनिंग mutagenesis) के साथ बदल दिया है, जबकि अन्य शेयरों या तो या दोनों डोमेन नष्ट कर दिया था. समयुग्मजों की अपेक्षित संख्याओं की प्रेक्षित संख्या का अनुपात प्रतिशत में प्रस्तुत किया जाता है (विषमयुग्मज सहोदर नियंत्रणों की तुलना में, सॉर्टिंग योजना और ची वर्ग विश्लेषण के लिए पूरक चित्र 3 का संदर्भ लेना)। ची वर्ग विश्लेषण यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि क्या मनाया और अपेक्षित के बीच का अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था और अकेले मौका के कारण नहीं (च-मान और 0.01)। त्रुटि पट्टियाँ माध्य (प्रति इंगित प्रति तीन परीक्षणों की न्यूनतम) की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं. सभी डेटा के साथ एक स्प्रेडशीट पूरक सामग्रीमें पाया जा सकता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2 : शीशी के अंदर आगर स्थिति अवांछित पर्यावरण चर लागू कर सकते हैं. विकास के विभिन्न चरणों में व्यक्तियों की संख्या के हिस्टोग्राम अंगूर agar डिस्क भ्रूण की ओर से नीचे भोजन शीशी या खाद्य शीशी के पक्ष में agar में गिना. शीशी में आगर डिस्क भ्रूण-साइड को नीचे रखने के परिणामस्वरूप वयस्कता तक जीवित प्रारंभिक भ्रूणों का 94% (एसडी $ 0.02) हुआ। खाद्य शीशी के किनारे पर agar रखने के परिणामस्वरूप मूल रूप से गिना भ्रूण वयस्कता तक पहुँचने के केवल 61% (एसडी जेड 0.07) में हुई। सभी डेटा के साथ एक स्प्रेडशीट पूरक सामग्रीमें पाया जा सकता है. प्रत्येक चरण में अपेक्षित संख्याओं को खाद्य शीशी में स्थानांतरित करने से पहले अंगूर की आगर डिस्क पर गिने गए भ्रूणों/L1 की प्रारंभिक संख्या के रूप में सेट किया गया है (नल परिकल्पना: 100% से पैदा हुए भ्रूण विकसित)। प्रेक्षित संख्या उन व्यक्तियों की वास्तविक संख्या है जिन्हें दर्शाए गए विकास ात्मक चरण के लिए गिना जाता है। इस प्रकार, प्रत्येक चरण अंगूर की आगर प्लेट पर गिने गए भ्रूणों की प्रारंभिक संख्या की तुलना में है। ची वर्ग विश्लेषण यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि क्या मनाया और अपेक्षित के बीच का अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था और 0.05 की च-मान सीमा का उपयोग करके अकेले मौका के कारण नहीं था। अंतर भोजन शीशी के पक्ष में agar के साथ बड़े भ्रूण के लिए महत्वपूर्ण था, लेकिन नीचे एक डिस्क भ्रूण पक्ष में बड़े हो उन लोगों के लिए नहीं. त्रुटियाँ सलाखों मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं (प्रति पार संकेत तीन परीक्षणों की न्यूनतम). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3 : कार्टून दिखा दो तरीके अंगूर agar डिस्क भ्रूण ले जाने / खाद्य शीशी में आगर की स्थिति के आधार पर भ्रूण ों और वयस्क संतति की कुल संख्या के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर था। अंतर एक पर्यावरण चर से उपजी (hydration) खाद्य शीशी के अंदर डिस्क प्लेसमेंट में अंतर के द्वारा बनाई गई: लार्वा और प्यूपा में उम्मीद और मनाया संख्या के बीच एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर है जब agar डिस्क शीशी के पक्ष में रखा गया था बनाम उम्मीद बनाम मनाया संख्या में कोई महत्वपूर्ण अंतर जब agar डिस्क भोजन के साथ संपर्क में था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4 : हिस्टोग्राम एक Dm ime4 उत्परिवर्ती संतुलित स्टॉक से जंगली प्रकार पुरुषों बनाम पुरुषों से विकास के विभिन्न चरणों में व्यक्तियों की संख्या दिखा. संतुलित पुरुषों कुंवारी जंगली प्रकार महिलाओं को पार के रूप में 2.1 में वर्णित है. आगर को खाद्य शीशियों में भ्रूण के किनारे स्थानांतरित कर दिया गया। जंगली प्रकार एक्स जंगली प्रकार से अंगूर आगर डिस्क में गिना मूल भ्रूण से उभरते वयस्कों के औसत अनुपात 94% था, एसडी $ 0.02, जबकि डीएम ime4 उत्परिवर्ती के लिए उस अनुपात / सांख्यिकीय विश्लेषण चित्र 2के लिए वर्णित के रूप में किया गया था; मतभेद या तो समूह के लिए महत्वपूर्ण नहीं थे. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5 : प्रायोगिक सेटअप. (ए) भ्रूण संग्रह मिनी-पिंजर और अंगूर-आगर मिनी-पेट्री व्यंजन। प्लेट्स निर्जलीकरण को रोकने के लिए एक आर्द्र कक्ष (पानी के साथ संतृप्त शोषक कागज डिस्क के साथ मानक पेट्री डिश) के अंदर रखा जाता है। खमीर पेस्ट की एक छोटी राशि प्रत्येक अंगूर-आगर प्लेट के केंद्र में रखा गया था. (बी) भ्रूण संग्रह प्लेट धारक ढक्कन (लाल) को अलग करें और एक तैयार प्लेट, खमीर की ओर रखें। (ग) क्रॉस को भ्रूण के पिंजरे में स्थानांतरित करें और तुरंत एक पेट्री डिश ढक्कन को अंदर मक्खियों को पकड़ने के लिए रखें। (डी) जल्दी से कवर हटाने और भ्रूण पिंजरे फ्लिप तो संपर्क अंगूर-आगर प्लेट खोलने. 24-48 एच के लिए इनक्यूबेट, दैनिक निरीक्षण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 6 : अंगूर-आगर प्लेटों पर भ्रूण विकास। (ए) अंगूर-आगर मिनी-पेट्री व्यंजन पर जमा किए गए वाइल्डटाइप भ्रूणों की गणना विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी के अंतर्गत की जाती है। आर्द्र कक्ष के अंदर प्लेटें रखें जब visualizing नहीं है और सीधे प्रकाश से बचने के निर्जलीकरण को रोकने के लिए. (ख) अंगूर-आगर प्लेटों को आर्द्र कक्ष में रखा जाता है और अंडे से निकलने वाले जंगली-प्रकार के भ्रूणों को अभिलिखित किया जाता है। इस तस्वीर में तीन wildtype L1 लार्वा है कि ए में दिखाया भ्रूण से विकसित से पता चलता है. (ग) चित्र 5में दर्शाए गए दो प्लेटों के लिए भ्रूणों (दिन 1) और एल1 लार्वा (दिन 2 ) की रिकार्ड की गई संख्या का उदाहरण है . नल परिकल्पना के लिए "अपेक्षित संख्या" भ्रूण है कि पैदा की और खाद्य शीशी (नीचे तालिका) के लिए स्थानांतरण के समय L1 लार्वा बन गया की संख्या से निर्धारित किया जाता है. वाइल्डटाइप मक्खियों के लिए, लगभग सभी भ्रूण अंडे से निकलते हैं और एल 1 लार्वा में विकसित होते हैं। यह अन्य आनुवंशिक पृष्ठभूमि के लिए मामला नहीं हो सकता है और इस विधि व्यवहार्यता में इन अंतरों को निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 7 : लार्वा स्थानांतरित करना. (A) L1 गणना रिकॉर्ड करने के बाद , अंगूर-आगर डिस्क को सावधानी से पेट्री डिश से एक साफ (एथेनोल-विड ) स्पैचुला (बी,सी) का उपयोग करके हटा दिया जाता है और डीमें दिखाए गए अनुसार शीशियों में भोजन से संपर्क करने के लिए एल1 साइड-डाउन स्थानांतरित किया जाता है . (ई) खाली पेट्री डिश का सावधानीपूर्वक निरीक्षण किया जाता है ताकि पीछे बचे किसी भी लार्वा का पता लगाया जा सके। यदि पीछे छोड़े गए लार्वा जीवित हैं और उन्हें खाद्य शीशी में स्थानांतरित किया जा सकता है, तो ऐसा सावधानी से और तुरंत (एफ) करते हैं। यदि पीछे छोड़े गए लार्वा मर चुके हैं या स्थानांतरित नहीं किए जा सकते हैं, तो बाद की गणना के लिए "अपेक्षित संख्या" को सही करने के लिए इस तथ्य को रिकॉर्ड करें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 8 : L2 लार्वा भोजन में अपना रास्ता बनाते हैं. अंगूर-आगर डिस्क और नीले भोजन के बीच दरारों और खांचे देखें। दैनिक शीशियों का निरीक्षण करने के लिए एक कार्यक्रम सेट करें, अधिमानतः दिन के एक ही समय में। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 9 : वयस्क उद्भव. (क) एल 3 लार्वा भोजन से प्यूपा बनने का रास्ता बनाते हैं। (ख) वयस्क 11 दिन पर उभरने लगते हैं। दैनिक शीशियों का निरीक्षण करने के लिए एक कार्यक्रम सेट करें, अधिमानतः दिन के एक ही समय में और ध्यान से अपने टिप्पणियों को रिकॉर्ड। जब सभी प्यूपा उभरा है गिनती बंद करो (खाली प्यूपा मामलों गिनती) और 15 दिन पर प्रयोग को रोकने के द्वारा मक्खियों की अगली पीढ़ी की गिनती से बचने और मृत प्यूपा गिनती अगर कोई (काला / लंबा जीवन चक्र के साथ उत्परिवर्ती समय की लंबी अवधि की आवश्यकता हो सकती है, जो अनुभवजन्य निर्धारित करने की आवश्यकता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
संक्षेप में, इस विधि Drosophilaमें व्यवहार्यता का एक सटीक और सरल मूल्यांकन प्रदान करता है. पूरे प्रोटोकॉल को पूरा करने के लिए लगभग 14 दिन लगते हैं। प्रक्रिया विशेषज्ञ तकनीकी कौशल की आवश्यकता नहीं है; हालांकि, उचित समय, दैनिक टिप्पणियों का एक कार्यक्रम, और सावधान agar स्थानांतरण सटीकता और पुन: उत्पादन क्षमता के लिए महत्वपूर्ण है।
भोजन शीशी में अंगूर-आगर डिस्क भ्रूण साइड नीचे की नियुक्ति के अलावा, प्रक्रिया में एक और महत्वपूर्ण कदम एक खाद्य शीशी के लिए agar डिस्क स्थानांतरित कर रहा है कोई बाद में 48 एच भ्रूण संग्रह मिनी पिंजरों से अंगूर आगर प्लेट को हटाने के बाद. 48 एच के बाद आगर को स्थानांतरित करने के परिणामस्वरूप भ्रूण और लार्वा की हानि हुई, जो आगर डिस्क के निर्जलीकरण के कारण होने की संभावना है। L2/L3 संक्रमण की गणना करने के लिए, प्लेट को 72 ज के लिए इनक्यूबेट करने की आवश्यकता होती है। यदि यह चरण महत्वपूर्ण है, अंगूर आगर प्लेटें मोटा डाला जाना चाहिए और एक आर्द्र कक्ष शुष्कता को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. पार भ्रूण संग्रह पिंजरों कि 35 मिमी प्लेटों को समायोजित में स्थापित किए गए थे; हालांकि, इस प्रक्रिया के रूप में अच्छी तरह से बड़ा भ्रूण संग्रह पिंजरों का उपयोग किया जा सकता है, इस तरह के एक है कि 60 मिमी या 100 मिमी पेट्री प्लेटों को समायोजित के रूप में. खाद्य बोतलें तो उन आकारों को समायोजित करने के लिए काफी बड़ा होना चाहिए.
इस प्रोटोकॉल में जोड़े जा सकते हैं जो चरण हैं। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, एल 2/एल3 संक्रमण आवश्यक समय और आगर के संभावित निर्जलीकरण के कारण प्लेटों पर परिमाणित करने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं। इसके अतिरिक्त, लार्वा आगर की सतह पर अत्यधिक मोबाइल बन जाते हैं, जो उन्हें सही ढंग से गिनने के लिए एक चुनौती प्रस्तुत करते हैं। 30 मिनट के लिए रेफ्रिजरेटर में प्लेटों रखकर या L2/L3 लार्वा की गिनती से पहले agar की सतह पर एक हल्के संवेदनाहारी (lidocaine समाधान) की कुछ बूँदें जोड़ने में मदद कर सकते हैं उन्हें और अधिक सही गिनती करने के लिए उनकी गतिविधियों को धीमा. इन संशोधनों के लिए एक चेतावनी है कि वे चर परिचय कर सकते हैं (ठंडा संवेदनशीलता, संवेदनाहारी संवेदनशीलता) और व्यवहार्यता परिणाम उलझन. यहां तक कि इन चरणों के बिना, रंगीन भोजन का उपयोग करके, शोधकर्ताओं भटक L3s/prepupae मात्रा के रूप में वे भोजन शीशियों के पक्ष में बसने के लिए pupation आरंभ कर सकते हैं. इस विधि के लिए एक सीमा यह है कि यह पार में इस्तेमाल वयस्कों की आवश्यकता है जीवित रहने के लिए भ्रूण संग्रह पिंजरों में पार स्थापित करने के लिए phenotyping के लिए सीओ2 के साथ anesthetized जा रहा है. Dm ime4 समयुग्मज उत्परिवर्ती पुरुषों अच्छी तरह से ठीक नहीं है और सीओ2 उपचार से जागने के बाद कुछ ही घंटों मर जाते हैं। छँटाई के लिए वयस्कों को स्थिर करने के लिए अन्य तरीकों का पता लगाया जा सकता है, जैसे कुछ मिनट के लिए रेफ्रिजरेटर में शीशियों रखने और फिर शीशियों को धीमा आंदोलन को धीमा करने और जल्दी और कुशलता से सॉर्ट करने के लिए कुचल बर्फ के लिए शीशियों को स्थानांतरित करें।
सहयोगी शक्तियों और व्यवहार्यता पर उनके प्रभाव की तुलना करने के अलावा, इस विधि को परिभाषित दवा यौगिकों के लिए संवेदनशीलता या प्रतिरोध स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अन्य विधियों के विपरीत जो कोशिका संस्कृति में यौगिक विषाक्तताको 15,16,17,18, इस विधि में पूरे जीवों का उपयोग करता है, जिससे विकासात्मक प्रभावों का विश्लेषण करना आसान हो जाता है। संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल और उसमें संशोधनों का उपयोग कर, allelic ताकत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से Drosophila व्यवहार्यता पर पर्यावरणीय कारकों और रासायनिक यौगिकों के प्रभाव को मापने के लिए अनुमति देगा, fecundity, प्रजनन, उम्र, और की अवधि विकास चक्र.
Disclosures
हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
हमारा काम NIH 1R15GM1131-01 से CFH और NIH पीए -12-149 CFH के लिए वित्त पोषित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimold additive | Carolina | ||
| Beaker | Fisher Scentific | S76100J | Beaker |
| Benchmark scientific digital hotplate | The Lab Depot | H3760H | Hot plate |
| Britta-filtered tap water to prepare grape agar and instant fly food | Any tap water filtration system | ||
| CO2 pistol or FlyNap | Carolina | Anesthetic to sort/count adult flies | |
| Dissecting microscope/stereoscope | Amscope | SM-1TSZ-V203 | Dissecting microscope |
| Drosophila culture vials and stoppers | Carolina | 173120 | Food vials for growing Drosophila |
| Embryo collection mini cage | Genesee Scientific | 59-105 | chamber used to gather embryos |
| Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | 70980 | Erlenmeyer flask |
| Formula 4-24 Instant Drosophila Medium, Blue | Carolina | https://www.carolina.com/drosophila-fruit-fly-genetics/formula-4-24-drosophila-medium-blue/FAM_173210.pr | |
| Grape agar | Genesee Scientific | 47-102 | Media used for agar plates |
| Instant fly flood | Carolina | 173210 | Blue media for food vials |
| Large Petri dish or any clear container to be used as a humid chamber by placing wet paper towels to keep the grape-agar plates moist during incubation/pre and post microscopic observation | |||
| Metal spatula (small) | Carolina | ||
| Microwave | Any | To cook grape agar | |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2901 | Petri dish for grape agar |
| Stir bar | The Lab Depot | 58948-981-EA | Magnetic stir bar |
References
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