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Methodenartikel

Diskrimintion und Mapping der primären und verarbeiteten Transkripte in Mais mitochondrion mit einer kreisförmigen RT-PCR-basierten Strategie

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DOI:

10.3791/60019

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29. Juli 2019

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1State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources, South China Agricultural University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding, College of Agriculture, South China Agricultural University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine kreisförmige RT-PCR-basierte Strategie, indem wir kreisförmige RT-PCR, quantitative RT-PCR, RNA 5' Polyphosphatase-Behandlung und Northern Blot kombinieren. Dieses Protokoll enthält einen Normalisierungsschritt, um den Einfluss von instabilem 5'-Triphosphat zu minimieren, und es eignet sich zur Unterscheidung und Kartierung der primären und verarbeiteten Transkripte, die in Maismitochondrion stabil angesammelt werden.

Zusammenfassung

In pflanzlichen Mitochondrien enthalten einige stationäre Transkripte 5' Triphosphat, das aus der Transkriptioninitiierung abgeleitet wurde (primäre Transkripte), während die anderen 5' Monophosphat enthalten, das posttranskriptional erzeugt wurde (verarbeitete Transkripte). Um zwischen den beiden Arten von Transkripten zu unterscheiden, wurden mehrere Strategien entwickelt, und die meisten von ihnen hängen von der Anwesenheit/Abwesenheit von 5' Triphosphat ab. Das Triphosphat bei primären 5' Termini ist jedoch instabil und behindert eine klare Diskriminierung der beiden Arten von Transkripten. Um die primären und verarbeiteten Transkripte, die in Maismitochondrion stabil angesammelt wurden, systematisch zu differenzieren und abzubilden, haben wir eine kreisförmige RT-PCR-basierte Strategie entwickelt, indem wir cRT-PCR, RNA 5' Polyphoshpatase-Behandlung, quantitative RT-PCR (RT-qPCR) und Northern Blot. Als Verbesserung beinhaltet diese Strategie einen RNA-Normalisierungsschritt, um den Einfluss von instabilem 5'-Triphosphat zu minimieren.

In diesem Protokoll wird die angereicherte mitochondriale RNA mit RNA 5' Polyphosphatase vorbehandelt, die 5' Triphsophat in Monophosphat umwandelt. Nach Zirkularisierung und umgekehrter Transkription werden die beiden cDNAs, die aus 5' Polyphosphatase-behandelten und nicht behandelten RNAs abgeleitet wurden, durch Mais 26S reife rRNA normalisiert, die ein verarbeitetes 5' Ende hat und unempfindlich gegen 5' Polyphosphatase ist. Nach der Normalisierung werden die primären und verarbeiteten Transkripte durch den Vergleich von cRT-PCR- und RT-qPCR-Produkten aus den behandelten und nicht behandelten RNAs diskriminiert. Die Transkript-Termini werden durch Klonen und Sequenzieren der cRT-PCR-Produkte bestimmt und dann durch Northern Blot überprüft.

Mit dieser Strategie wurden die meisten stationären Transkripte in Maismitochondrion bestimmt. Aufgrund des komplizierten Transkriptmusters einiger mitochondrialer Gene wurden einige stationäre Transkripte nicht unterschieden und/oder kartiert, obwohl sie in einem nördlichen Fleck nachgewiesen wurden. Wir sind nicht sicher, ob diese Strategie geeignet ist, die stationären Transkripte in anderen pflanzenmitochondrien oder in Plastiden zu unterscheiden und abzubilden.

Einleitung

In pflanzlichen Mitochondrien werden viele reife und Vorläufer-RNAs als mehrere Isoformen angesammelt, und die stationären Transkripte können in zwei Gruppen unterteilt werden, basierend auf der Differenz an ihren 5' Enden1,2,3, 4. Die primären Transkripte haben 5' Triphosphatendenden, die aus der Transkriptionioninitiation abgeleitet sind. Im Gegensatz dazu haben die verarbeiteten Transkripte 5' Monophosphat, das durch posttranskriptielle Verarbeitung erzeugt wird. Diskriminierung und Kartierung der beiden Arten von Transkripten sind wichtig, um die molekularen Mechanismen zu entwirren, die der Transkription und Transkriptendreifung zugrunde liegen.

Um zwischen den primären und verarbeiteten Transkripten im pflanzlichen Mitochondrion zu unterscheiden, wurden vier Hauptstrategien entwickelt. Die erste Strategie besteht darin, die mitochondrialen RNAs mit Tabaksäurepyrophosphatase (TAP) vorzubehandeln, die 5' Triphosphat in Monophosphat umwandelt und die Zirkularisierung von Primärtranskripten durch RNA-Ligase ermöglicht. Die Transkriptsfülle von TAP-behandelten und nicht behandelten RNA-Proben wird dann durch schnelle Amplifikation von cDNA-Enden (RACE) oder kreisförmiger RT-PCR (cRT-PCR)2,3,4verglichen. In der zweiten Strategie werden die verarbeiteten Transkripte zunächst von mitochondrialen RNAs mit Terminator 5'-phosphatabhängiger Exonuklease (TEX) aufgebraucht, und die primären Transkripte werden dann durch Primer-Erweiterungsanalyse5,6 . Die dritte Strategie besteht darin, die primären Transkripte mit Guanylyltransferase vorab zu begrenzen, und dann wird die Position der triphosphierten 5' Termini durch Primerverlängerung zusammen mit der Ribonuklease- oder S1-Nukleaseschutzanalyse7,8 bestimmt. ,9. Anders als je nach Vorhandensein/Abwesenheit von 5'-Triphosphat kombiniert die vierte Strategie In-vitro-Transkription, standortgesteuerte Mutagenese und Primer-Erweiterungsanalyse, um die vermeintlichen Promotoren zu charakterisieren und die Transkription zu bestimmen. Initiationsstandorte8,10,11. Durch die Verwendung dieser Strategien wurden viele primäre und verarbeitete Transkripte in pflanzlichen Mitochondrien bestimmt.

Mehrere Studien haben jedoch berichtet, dass die 5' Triphosphat der primären Transkripte instabil waren, und sie wurden leicht in Monophosphat aus unbekanntem Grund umgewandelt2,4,12,13. Dieses Problem verhindert eine klare Diskriminierung der beiden Arten von Transkripten, indem Techniken verwendet werden, die vom Vorhandensein/Fehlen von 5'-Triphosphat abhängen, und frühere Bemühungen, systematisch zwischen den primären und den verarbeiteten Transkripten in Pflanzen zu unterscheiden. mitochondrien fehlgeschlagen2,12.

In diesem Protokoll kombinieren wir cRT-PCR, RNA 5' Polyphosphatase-Behandlung, RT-qPCR und Northern Blot, um systematisch die primären und verarbeiteten Transkripte zu unterscheiden, die in Mais (Zea mays) Mitochondrion angesammelt wurden (Abbildung 1). cRT-PCR ermöglicht die gleichzeitige Kartierung von 5' und 3' Extremitäten eines RNA-Moleküls, und es ist in der Regel angepasst, um Transkript-Termini in Pflanzen2,12,14,15. DIE Polyphosphatase von RNA 5 könnte zwei Phosphate aus dem triphosphatierten 5' Termini entfernen, wodurch die primären Transkripte für die Selbstligation durch RNA-Ligase verfügbar sind. Frühere Studien zeigten, dass reife 26S rRNA in Mais 5' Endstation verarbeitet hatte, und es war unempfindlich gegen RNA 5' Polyphosphatase1,16. Um den Einfluss von instabilem Triphosphat auf primäre 5' Termini zu minimieren, werden die 5' Polyphosphatase-behandelten und nicht behandelten RNAs durch ausgereifte 26S rRNA normalisiert, und die primären und verarbeiteten Transkripte werden dann durch cRT-PCR-Produkte, die aus den beiden RNA-Proben gewonnen wurden. Die CRT-PCR-Mapping- und Diskriminierungsergebnisse werden von Northern Blot bzw. RT-qPCR überprüft. Schließlich werden alternative Primer verwendet, um die Transkripte zu verstärken, die im nördlichen Blot, aber nicht durch cRT-PCR erkannt wurden. Durch die Verwendung dieser cRT-PCR-basierten Strategie wurden die meisten stationären Transkripte in Maismitochondrion differenziert und kartiert1.

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Protokoll

1. Primer Design

  1. Entwerfen Sie genspezifische Primer für die Reverse Transkription (RT) mit PCR Primer Design Software (Table of Materials) basierend auf den allgemeinen Regeln des Primer Designs17.
    HINWEIS: RT-Primer sind sehr spezifisch für die Zieltranskripte und sind in der Regel auf dem 5' Teil der Codierungssequenzen (reife mRNAs und Vorläufer-RNAs) oder 500–600 nt stromabwärts des erwarteten 5'-Ends (18S und 26S rRNAs) verankert.
  2. Entwerfen Sie Paare von divergenten Primern, um die kreisförmigen Transkripte durch cRT-PCR zu verstärken.
    ANMERKUNG: Die gepaarten divergierenden Primer flankieren die 5'-3'-Kreuzung der kreisförmigen Transkripte, und ihre Positionen variieren zwischen den analysierten Zieltranskripten (Abbildung S1). Einige Transkripte haben lange UTRs; zum Beispiel sind nad2-1 5' UTR und rps4-1 3' UTR 1.985 bzw. 1.826/1.834 nt bzw.1. Wenn beide Primer im Codierungsbereich verankert sind, ist es schwierig, die Zieltranskripte zu verstärken. Im Gegensatz dazu sind einige UTRs kurz; Beispielsweise sind die 3' UTRs von nad2-1 und nad4-1 34/35 und 29–31 nt bzw.1. Wenn sich die gekoppelten Primer weit von den Codierungssequenzen entfernt befinden, schlägt die PCR fehl. Im Allgemeinen sind zwei Paare von divergenten Primern für jedes Zieltranskript entworfen, während mehrere Paare erforderlich sein können, um diejenigen zuzuordnen, deren Transkriptmuster kompliziert sind und/oder UTRs sehr lang sind.
  3. Entwerfen Sie Paare konvergenter Primer, um RNA-Sonden für northern blot vorzubereiten.
    HINWEIS: Die gepaarten Primer befinden sich im Kodierungsbereich des Zielgens, und die Größe des PCR-Produkts sollte im Bereich von 100 bis 1.000 bp liegen. Jede Vorwärtsprimer sollte eine Restriktionsenzym-Site enthalten, um Vektorsequenzen in den resultierenden Sonden zu minimieren.

2. Herstellung von Rohmitochondrion aus Mais entwicklungserkerne

  1. Schädlinge, Mörtel, Glastrichter, Rohre und Spitzen per Autoklav ensterilisieren und im Ofen trocknen.
  2. Führen Sie alle Verfahren bei 4 °C oder auf Eis durch und kühlen Sie alle Lösungen vor.
  3. Bereiten Sie 100 ml Extraktionspuffer (EB), bestehend aus 0,3 M Saccharose, 5 mM Tetranatriumpyrophosphat, 10 mM KH2PO4, 2 mM EDTA, 1% [w/v] Polyvinylpyrrolidon 40, 1% [w/v] Rinderserumalbumin, 5 mM L-Cystein und 20 mM Ascorbinsäure vor. Mit KOH auf pH 7.3 einstellen und durch Filtration sterilisieren.
  4. 100 ml Waschpuffer (WB) bestehend aus 0,3 M Saccharose, 1 mM EGTA und 10 mM MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonsäure) vorbereiten. Mit NaOH auf pH 7.2 einstellen und durch Filtration sterilisieren.
    HINWEIS: Es wird vorgeschlagen, EB und WB mit DEPC-behandelten deionisiertenH2O vorzubereiten.
  5. Sammeln Sie 20 g entwickelnde Kerne in 11–20 Tagen nach der Bestäubung (DAP) zu einem 50-ml-Rohr auf Eis gelegt, und übertragen Sie dann die Kerne auf vorgekühlte Mörtel.
    HINWEIS: Verwenden Sie ein Verhältnis von 100 ml EB zu 20 g Maiskernen.
  6. Fügen Sie jedem Mörtel 10–20 ml eiskalteEB hinzu und mahlen Sie die Kerne vollständig.
  7. Fügen Sie weitere EB hinzu, und filtern Sie das gemahlene Gewebe durch zwei Schichten Filtertuch (Tabelle der Materialien).
  8. Zentrifugieren Sie das Filtrat bei 8.000 x g für 10 min, und entsorgen Sie das Pellet.
  9. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues Rohr und zentrifugieren Sie ihn bei 20.000 x g für 10 min.
  10. Gießen Sie den Überstand ab, und setzen Sie das Pellet in 6 ml WB wieder auf.
  11. Aliquot die Suspension zu fünf 1,5 ml RNase-freien Rohren, und zentrifugieren Sie sie bei 14.000 x g für 5 min.
  12. Den Überstand entsorgen, das mitochondriale Pellet in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.

3. Extraktion von mitochondrialer RNA

  1. Extrahieren Sie mitochondriale RNA mit einem kommerziellen Reagenz (Materialtabelle) gemäß den Anweisungen der Herstellung.
    ACHTUNG: Dieses Reagenz enthält Phenol und Guanidinisothiocyanat. Arbeiten Sie damit in einer Dunstabzugshaube und tragen Sie Labormantel und Handschuhe.
  2. Lösen Sie die isolierte mitochondriale RNAin DEPC-behandelten deionisierten H2 O, und schätzen Sie die RNA-Konzentration und -Reinheit mit einem Spektralphotometer (Tabelle der Materialien).
    HINWEIS: Im Allgemeinen wird aus 20 g 15-DAP-Maiskernen eine mitochondriale RNA von 250 g gewonnen.
  3. Bereiten Sie ein Agarose-Gel bestehend aus 1x TAE Puffer (40 mM Tris, 20 mM Essigsäure, 1mM EDTA), 1,5% Agarose (Materialtabelle), und 1x Kernfärbung Farbstoff (Tabelle der Materialien).
  4. Fügen Sie ein geeignetes Volumen von 10x Ladepuffer (0,5% Bromphenolblau, 0,5% Xylolcyanol FF und 50% Glycerin) hinzu und laden Sie mitochondriale RNA/Loading Puffergemisch auf das 1,5% Agarose-Gel.
  5. Führen Sie das Gel im 1x TAE-Puffer bei 5–6 V/cm für 20–25 min aus und bewerten Sie die mitochondriale RNA-Integrität, indem Sie das Gel mit einem Gel-Dokumentationssystem (Tableof Materials)abbilden.
    HINWEIS: Das Vorhandensein von zwei unterschiedlichen Bändern (3.510 usd bzw. 1.970 nt für Mais mitochondriale 26S bzw. 18S rRNAs) ist ein akzeptabler Standard für intakte mitochondriale RNA. Um einen möglichen Abbau auszuschließen, sollte die RNA-Integrität in den verschiedenen Schritten der kreisförmigen RNA-Präparation untersucht werden (Abbildung 2).

4. RNA 5' Polyphosphatase Behandlung

  1. RNA 5' Polyphosphatase (Tabelle und Materialien) Behandlung einrichten ( Tabelle1), und inkubieren bei 37 °C für 30–60 min.
  2. Stellen Sie die 5' Polyphosphatase-behandelte RNA mit einem RNA-Reinigungskit (Tabelle der Materialien) gemäß den Anweisungen des Herstellers wieder her.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 3.3 bis 3.5.

5. RNA-Zirkularisation

  1. Bereiten Sie zwei Zirkulierungsreaktionen mit den gleichen Mengen von 5' Polyphosphatase-behandelten und nicht behandelten mitochondrialen RNAs (Tabelle 2) vor und inkubieren Sie beide Reaktionen bei 16 °C für 12–16 h.
  2. Stellen Sie die beiden Sätze von selbstligierten RNAs mit dem gleichen Kit wie in Schritt 4.2 wieder her.
    HINWEIS: Es sollte beachtet werden, dass nur ein Bruchteil der mitochondrialen RNA selbstligiert wird, und die wiedergewonnene RNA wird eine Mischung aus linearen und kreisförmigen Transkripten sein.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 3.3 bis 3.5.

6. Umgekehrte Transkription

  1. Synthetisieren Sie zwei Sätze von cDNAs aus den gleichen Mengen von kreisförmigen 5' Polyphosphatase-behandelten und nicht behandelten RNAs (200 ng).
  2. Bereiten Sie eine Primermischung vor, indem Sie ein gleiches Verhältnis von 26S-CRT und bis zu 7 weitere RT-Primer hinzufügen.
    HINWEIS: Die Endkonzentration des Primergemisches sollte 1 m betragen.
  3. Bereiten Sie zwei Vormischungen vor, indem Sie die in Tabelle 3aufgeführten Reagenzien kombinieren, bei 65 °C 5 min brüten und dann 2 min auf Eis abkühlen.
  4. Montieren Sie zwei RT-Reaktionssysteme (Tabelle 4) und inkubieren Sie sie bei 42 °C für 50 min.
  5. Beide RT-Reaktionen bei 70 °C 5 min erhitzen und dann auf Eis abkühlen lassen.

7. Normalisierung

  1. Bereiten Sie zwei PCR-Reaktionen vor, indem Sie das gleiche Volumen von Template-CDNAs hinzufügen, die von 5' Polyphosphatase-behandelten oder nicht behandelten RNAs abgeleitet sind, divergierende Primer flankieren die 5'-3'-Kreuzung von kreisförmiger 26S rRNA (d. h. 26S-CF1 und -CR1) usw. (Tabelle 5).
  2. Führen Sie die beiden Reaktionen in einem thermischen Cycler (Materialtabelle) unter den in Tabelle 6beschriebenen Bedingungen aus.
  3. Bereiten Sie ein Agarose-Gel aus 1x TAE-Puffer, 1,0% Agarose und 1x Kernfärbung vor.
  4. Fügen Sie jedem der beiden PCR-Produkte 2 l 10x Ladepuffer (0,5% Bromphenolblau, 0,5 % Xylolcyanol FF und 50 % Glycerin) hinzu und laden Sie sie auf das Gel.
  5. Führen Sie das Gel im 1x TAE-Puffer bei 5–6 V/cm für 30–40 min aus, und stellen Sie es mit demselben Geldokumentationssystem als Schritt 3.5 ab.
  6. Vergleichen Sie die Häufigkeit der beiden PCR-Produkte mit Computersoftware (Tabelle der Materialien, Abbildung 4A), und optimieren Sie die Normalisierung, indem Sie bei Bedarf die Mengen der Vorlagen-CDNAs ändern.

8. PCR-Verstärkung

  1. Vorbereiten Sie Paare von PCR-Reaktionen, indem Sie ein geeignetes Volumen der normalisierten cDNAs und ein Paar divergierender Primer hinzufügen, die 5'-3' Kreuzung der Zieltranskripte flankieren (Tabelle 7).
    HINWEIS: Die Menge der Vorlagen-CDNAs, die für die PCR-Verstärkung der Zieltranskripte verwendet werden, wird durch die 26S rRNA Normalisierungsergebnisse bestimmt.
  2. Führen Sie die PCR-Reaktionen gemäß dem in Tabelle 8beschriebenen Programm aus.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 7.3 bis 7.5.
  4. Wechseln Sie zu verschachtelten divergierenden Primern, und überprüfen Sie die PCR-Ergebnisse der ersten Runde, indem Sie die Schritte 8.1 und 8.2 wiederholen.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 7.3 bis 7.5.
  6. Stellen Sie die prominenten Bänder wieder her, die in zwei Runden PCR-Verstärkung mit einem Gel-DNA-Recovery-Kit (Tableof Materials)wiederholt werden könnten.

9. Bestimmung der Transkript-Termini

  1. Klonen Sie die gelgereinigten PCR-Produkte mit Standardtechniken in einen stumpfen Endvektor (Materialtabelle).
  2. Führen Sie Kolonie-PCR aus, um positive Klone auszuwählen, die die Zieleinsätze enthalten, und sequenzieren Sie sie kommerziell.
    HINWEIS: Positive Klone, die Inserts mit variabler Größe enthalten, werden in der Regel von einem einzigen wiederhergestellten Band erkannt, da viele stationäre Transkripte in pflanzenmitochondrial heterogenen 5' und/oder 3' Enden1,12haben.
  3. Richten Sie die Sequenzierungsdaten mit dem mitochondrialen Maisgenom mithilfe des grundlegenden lokalen Ausrichtungssuchwerkzeugs (BLAST) des nationalen Zentrums für biotechnologische Informationen (NCBI) aus. Wählen Sie Organismus "mais (taxid:4577)" und Suchdatenbank "Nukleotid-Sammlung (nr/nt)".
  4. Finden Sie die 5'-3' Kreuzung des kreisförmigen Transkripts, und bestimmen Sie die Positionen von 5' und 3' Transkript termini.
  5. Berechnen Sie die Größe der Zieltranskripte.

10. Verifikation der cRT-PCR Mapping Ergebnisse durch RNA Gel Blot Hybridisierung

HINWEIS: Die RNA-Gel-Blot-Hybridisierung erfolgt mit einem kommerziellen Kit (Table of Materials), das die Reagenzien für die Transkriptionskennzeichnung von RNA mit Digoxigenin (DIG) und T7-RNA-Polymerase, Hybridisierung und immunologischem Nachweis enthält. Weitere Informationen finden Sie in den Protokollen in diesem Kit. Stellen Sie sicher, dass nur RNase freie Geräte für den gesamten Vorgang verwendet werden.

  1. Verstärken Sie das DNA-Fragment, das zur Vorbereitung der RNA-Sonde verwendet wird, und klonen Sie es auf den gleichen Vektor wie in Schritt 9.1, der einen T7-Promotor 17 bp vor der Einfügestelle enthält.
  2. Linearisieren Sie das Konstrukt mit dem richtigen Restriktionsenzym, bergen Sie das linearisierte Plasmid durch ein DNA-Reinigungskit (Tabelle der Materialien) und lösen Sie es in DEPC-behandelten deionisierten H2O.
  3. Label RNA Sonden mit DIG-11-UTP durch ein kommerzielles Kit (Tabelle der Materialien) nach den Anweisungen des Herstellers.
  4. 500 ml 10x MOPS-Puffer (0,2 M MOPS, 50 mM Natriumacetat und 10 mM EDTA) mit DEPC-behandeltem deionisiertemH2O vorbereiten. Von NaOH auf pH 7,0 einstellen und durch Filtration sterilisieren.
  5. Fügen Sie der in den Schritten 3.1–3.3 hergestellten mitochondrialen RNA, die in den Schritten 3.1–3.3 hergestellt wird, 2–3 Volumen des Ladepuffers (50% Formamid, 6,2 % Formaldehyd, 1x MOPS, 10% Glycerin und 0,1% Bromphenolblau) hinzu.
  6. Die RNA-Probe/Ladepuffermischung 10 min bei 65 °C denaturieren und dann 1 min auf Eis abkühlen lassen.
  7. Bereiten Sie ein denaturiertes Agarose-Gel (2% Formaldehyd, 1,2% Agarose und 1x MOPS) vor und laden Sie die RNA-Probe/Loading-Puffermischung in das Gel (1–2 g mitochondriale RNA pro Brunnen).
  8. Führen Sie das Gel in 1x MOPS bei 3–4 V/cm für 4 h aus.
  9. 2 L 20x SSC (3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat, pH 7,0) vorbereiten. Behandeln Sie es mit 0,1% DEPC über Nacht, und sterilisieren durch Autoklaven.
  10. Spülen Sie das Gel zweimal in 20x SSC (15 min jedes Mal), und übertragen Gel RNA auf eine Nylonmembran (Tisch der Materialien) durch Kapillartransfer mit 20x SSC für 10-16 h.
  11. Fixieren Sie die RNA an der Membran, indem Sie 30 min bei 120 °C backen.
  12. Führen Sie die RNA-Hybridisierung und den immunologischen Nachweis mit einem kommerziellen Kit (Tabelle der Materialien) gemäß der Anweisung des Herstellers durch.

11. Diskriminierung von Primär- und Verarbeiteten 5' Enden

  1. Diskriminieren Sie die primären und verarbeiteten 5' Enden, indem Sie die cRT-PCR-Produkte vergleichen, die aus den normalisierten 5' Polyphosphatase-behandelten und nicht behandelten RNAs gewonnen werden.
    HINWEIS: Bei primären Transkripten ist die Häufigkeit von PCR-Produkten aus 5' Polyphosphatase-behandelter RNA viel höher als die von nicht behandelten Gegenstücken (Abbildung 1, "Gene A" und Abbildung 4A). Bei verarbeiteten Transkripten würde jedoch ein vergleichbares Niveau von PCR-Produkten aus den beiden Sätzen mitochondrialer RNAs (Abbildung1, "Gene B") verstärkt.
  2. Design RT-qPCR Primer basierend auf den cRT-PCR-Mapping-Ergebnissen.
  3. Überprüfen Sie die CRT-PCR-Diskriminierungsergebnisse durch RT-qPCR.
    HINWEIS: Die beiden cDNA-Proben, die aus 5' Polyphosphatase-behandelten und nicht behandelten RNAs gewonnen werden, werden durch die RT-qPCR-Produkte von 26S reifer rRNA normalisiert.

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Ergebnisse

Abschätzung der mitochondrialen RNA-Zirkularisierungseffizienz

In einer früheren Studie wurden sowohl totale als auch mitochondriale RNAs für die cRT-PCR-Mapping von mitochondrialen Transkripttermini in Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) verwendet, und die beiden Arten von RNAs ergaben ähnliche Kartierungsergebnisse12. Anfangs verwendeten wir auch totale RNAs für die cRT...

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Diskussion

In einer früheren Studie wurden totale und mitochondriale RNAs aus der Zellsuspensionskultur von Arabidopsis verwendet, um mitochondriale Transkript-Termini durch cRT-PCR zu kartieren, und ähnliche Ergebnisse wurden12erzielt. Jedoch, nur angereicherte mitochondriale RNA wurde verwendet, um mitochondriale Transkript termini in vielen anderen Studien1,2,3,9. Wir f...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant-Nr. 31600250, Y.Z.), Science and Technology Projects of Guangzhou City (Grant-Nr. 201804020015, H.N.) und dem China Agricultural Research System (Grant-Nr. CARS-04-PS09, H.N.).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
EssigsäureAladdin, ChinaA112880Zur Herstellung von 1x TAE-Puffer
Applied Biosystems 2720 ThermocyclerThermo Fisher Scientific, USA4359659Thermocycler für die PCR-Amplifikation
AscorbinsäureSigma-aldrich, USAV900134Zur Herstellung von Extraktionspuffer
Biowest AgaroseBiowest, Spanien9012-36-6Zur Auflösung der PCR Produkte und RNAs
RinderserumalbuminSigma-aldrich, USAA1933Zur Herstellung von Extraktionspuffer
BromphenolblauSigma-aldrich, USAB8026Zur Herstellung von Loading-Puffer für die Agarose-Gelelektrophorese und Northern Blot
DEPCSigma-aldrich, USAV900882Deaktivierung von RNase
DIG Northern Starter kitRoche, USA12039672910Für DIG-RNA-Markierung und Northern Blot. Dieses Kit enthält die Reagenzien für die Transkriptionsmarkierung von RNA mit DIG- und T7-RNA-Polymerase, Hybridisierung und Chemilumineszenz-Detektion.
EDTASigma-aldrich, USAV900106Zur Aufbereitung von Extraktionspuffer und 1x TAE-Puffer
EGTASigma-aldrich, USAE3889Zur Aufbereitung von Waschpuffer
Gel-DokumentationssystemBio-Rad, USAGel Doc XR+Zur Abbildung des Agarosegels
GlycerolSigma-aldrich, USAG5516Zur Aufbereitung von Loading-Puffer für die Agarose-Gelelektrophorese
GoldView II (5.000x)Solarbio,. ChinaG8142DNA-Färbung
Hybond-N+, NylonmembranAmersham Biosciences, USARPN119Für Northern Blot
Image LabBio-Rad, USAImage Lab 3.0Image Gel, und vergleichen Sie die Häufigkeit von PCR-Produkten.
KH2PO4Sigma-aldrich, USAV900041Zur Herstellung von Extraktionspuffer
KOHAladdin, ChinaP112284Zur Herstellung von Extraktionspuffer
L-CysteinSigma-aldrich, USAV900399Zur Herstellung von Extraktionspuffer
MillexMillipore, USASLHP033RBZur sterilen Extraktion und Waschpuffer durch Filtration
MiraclothCalbiochem, USA475855-1RZur Filtration des gemahlenen Kerngewebes
MOPSSigma-aldrich, USAV900306Zur Vorbereitung von Laufpuffern für Northern Blot
NanoDrop Thermo Fisher Scientific, USA2000CFür RNA-Konzentrations- und Reinheitsassays
NaOHSigma-aldrich, USAV900797Für Herstellung des Waschpuffers
pEASY-Blunt einfacher KlonierungsvektorTransGen Biotech, ChinaCB111Klonierung der gelgewonnenen Bande. Es enthält einen T7-Promotor mehrere bps stromaufwärts der Insertionsstelle.
Phanta max Super-Fidelity-DNA-PolymeraseVazyme, ChinaP505DNA-Polymerase für die PCR-Amplifikation
Polyvinylpyrrolidon 40Sigma-aldrich, USAV900008Zur Herstellung von Extraktionspuffer
Primer Premier 6.24PREMIER Biosoft, USAPrimer Premier 6.24Zur Entwicklung von Primern für die reverse Transkription und PCR-Amplifikation
PrimeScript II reverse TranskriptaseTakara, Japan2690Zur Synthese des ersten Strangs cDNA
PureLink RNA Mini KitThermo Fisher Scientific, USA12183025Für die RNA-Reinigung
RNA 5' PolyphosphataseEpicentre, USARP8092HZur Umwandlung von 5'-Triphosphat in Monophosphat
RNase InhibitorNew England Biolabs, UKM0314Es ist ein Bestandteil der RNA-Selbstligation und der 5'-Polyphosphatase-Behandlungsreaktionen und wird verwendet, um die Aktivität von RNase zu hemmen.
NatriumacetatSigma-aldrich, USAV900212Zur Herstellung von Laufpuffer für Northern Blot
NatriumchloridSigma-aldrich, USAV900058Zur Herstellung von 20x SSC
SsoFas evaGreen SupermixesBio-Rad, USA1725202Für RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1New England Biolabs, UKM0437Für RNA-Zirkularisierung
Tetranatrium Pyrophosphat Sigma-aldrich, USA221368Zur Herstellung von Extraktionspuffer
TIANgel Midi-AufreinigungskitTiangen Biotech, ChinaDP209Zur Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegel
TrisAladdin, ChinaT110601Zur Herstellung von 1x TAE-Puffer
TRIzol-ReagenzInvitrogen, USA15596026Zur Extraktion von mitochondiraler RNA.
Universelles DNA-AufreinigungskitTiangen Biotech, ChinaDP214Zur Gewinnung linearisierter Plastmide aus der Restriktionsenzymverdauungsreaktion
Xylolcyanol FFSigma-aldrich, USAX4126Zur Herstellung von Ladepuffer für die Agarosegelelektrophorese

Referenzen

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  2. Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants. Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).
  3. Calixte, S., Bonen, L. Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).
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