Diskrimintion und Mapping der primären und verarbeiteten Transkripte in Mais mitochondrion mit einer kreisförmigen RT-PCR-basierten Strategie

Summary

Wir präsentieren eine kreisförmige RT-PCR-basierte Strategie, indem wir kreisförmige RT-PCR, quantitative RT-PCR, RNA 5' Polyphosphatase-Behandlung und Northern Blot kombinieren. Dieses Protokoll enthält einen Normalisierungsschritt, um den Einfluss von instabilem 5'-Triphosphat zu minimieren, und es eignet sich zur Unterscheidung und Kartierung der primären und verarbeiteten Transkripte, die in Maismitochondrion stabil angesammelt werden.

Abstract

In pflanzlichen Mitochondrien enthalten einige stationäre Transkripte 5' Triphosphat, das aus der Transkriptioninitiierung abgeleitet wurde (primäre Transkripte), während die anderen 5' Monophosphat enthalten, das posttranskriptional erzeugt wurde (verarbeitete Transkripte). Um zwischen den beiden Arten von Transkripten zu unterscheiden, wurden mehrere Strategien entwickelt, und die meisten von ihnen hängen von der Anwesenheit/Abwesenheit von 5' Triphosphat ab. Das Triphosphat bei primären 5' Termini ist jedoch instabil und behindert eine klare Diskriminierung der beiden Arten von Transkripten. Um die primären und verarbeiteten Transkripte, die in Maismitochondrion stabil angesammelt wurden, systematisch zu differenzieren und abzubilden, haben wir eine kreisförmige RT-PCR-basierte Strategie entwickelt, indem wir cRT-PCR, RNA 5' Polyphoshpatase-Behandlung, quantitative RT-PCR (RT-qPCR) und Northern Blot. Als Verbesserung beinhaltet diese Strategie einen RNA-Normalisierungsschritt, um den Einfluss von instabilem 5'-Triphosphat zu minimieren.

In diesem Protokoll wird die angereicherte mitochondriale RNA mit RNA 5' Polyphosphatase vorbehandelt, die 5' Triphsophat in Monophosphat umwandelt. Nach Zirkularisierung und umgekehrter Transkription werden die beiden cDNAs, die aus 5' Polyphosphatase-behandelten und nicht behandelten RNAs abgeleitet wurden, durch Mais 26S reife rRNA normalisiert, die ein verarbeitetes 5' Ende hat und unempfindlich gegen 5' Polyphosphatase ist. Nach der Normalisierung werden die primären und verarbeiteten Transkripte durch den Vergleich von cRT-PCR- und RT-qPCR-Produkten aus den behandelten und nicht behandelten RNAs diskriminiert. Die Transkript-Termini werden durch Klonen und Sequenzieren der cRT-PCR-Produkte bestimmt und dann durch Northern Blot überprüft.

Mit dieser Strategie wurden die meisten stationären Transkripte in Maismitochondrion bestimmt. Aufgrund des komplizierten Transkriptmusters einiger mitochondrialer Gene wurden einige stationäre Transkripte nicht unterschieden und/oder kartiert, obwohl sie in einem nördlichen Fleck nachgewiesen wurden. Wir sind nicht sicher, ob diese Strategie geeignet ist, die stationären Transkripte in anderen pflanzenmitochondrien oder in Plastiden zu unterscheiden und abzubilden.

Introduction

In pflanzlichen Mitochondrien werden viele reife und Vorläufer-RNAs als mehrere Isoformen angesammelt, und die stationären Transkripte können in zwei Gruppen unterteilt werden, basierend auf der Differenz an ihren 5' Enden^{1,2,3, 4}. Die primären Transkripte haben 5' Triphosphatendenden, die aus der Transkriptionioninitiation abgeleitet sind. Im Gegensatz dazu haben die verarbeiteten Transkripte 5' Monophosphat, das durch posttranskriptielle Verarbeitung erzeugt wird. Diskriminierung und Kartierung der beiden Arten von Transkripten sind wicht....

Protocol

1. Primer Design

1. Entwerfen Sie genspezifische Primer für die Reverse Transkription (RT) mit PCR Primer Design Software (Table of Materials) basierend auf den allgemeinen Regeln des Primer Designs¹⁷.
   HINWEIS: RT-Primer sind sehr spezifisch für die Zieltranskripte und sind in der Regel auf dem 5' Teil der Codierungssequenzen (reife mRNAs und Vorläufer-RNAs) oder 500–600 nt stromabwärts des erwarteten 5'-Ends (18S und 26S rRNAs) verankert.
2. Entwerfen Sie Paare von divergenten Primern, um die kreisförmigen Transkripte durch cRT-PCR zu verstärken.
   ANMERKUNG: Die gepaarten divergierenden Prim....

Results

Abschätzung der mitochondrialen RNA-Zirkularisierungseffizienz

In einer früheren Studie wurden sowohl totale als auch mitochondriale RNAs für die cRT-PCR-Mapping von mitochondrialen Transkripttermini in Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) verwendet, und die beiden Arten von RNAs ergaben ähnliche Kartierungsergebnisse¹². Anfangs verwendeten wir auch totale RNAs für die cRT.......

Discussion

In einer früheren Studie wurden totale und mitochondriale RNAs aus der Zellsuspensionskultur von Arabidopsis verwendet, um mitochondriale Transkript-Termini durch cRT-PCR zu kartieren, und ähnliche Ergebnisse wurden¹²erzielt. Jedoch, nur angereicherte mitochondriale RNA wurde verwendet, um mitochondriale Transkript termini in vielen anderen Studien^1,2,3,9. Wir f.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Essigsäure	Aladdin, China	A112880	Zur Herstellung von 1x TAE-Puffer
Applied Biosystems 2720 Thermocycler	Thermo Fisher Scientific, USA	4359659	Thermocycler für die PCR-Amplifikation
Ascorbinsäure	Sigma-aldrich, USA	V900134	Zur Herstellung von Extraktionspuffer
Biowest Agarose	Biowest, Spanien	9012-36-6	Zur Auflösung der PCR Produkte und RNAs
Rinderserumalbumin	Sigma-aldrich, USA	A1933	Zur Herstellung von Extraktionspuffer
Bromphenolblau	Sigma-aldrich, USA	B8026	Zur Herstellung von Loading-Puffer für die Agarose-Gelelektrophorese und Northern Blot
DEPC	Sigma-aldrich, USA	V900882	Deaktivierung von RNase
DIG Northern Starter kit	Roche, USA	12039672910	Für DIG-RNA-Markierung und Northern Blot. Dieses Kit enthält die Reagenzien für die Transkriptionsmarkierung von RNA mit DIG- und T7-RNA-Polymerase, Hybridisierung und Chemilumineszenz-Detektion.
EDTA	Sigma-aldrich, USA	V900106	Zur Aufbereitung von Extraktionspuffer und 1x TAE-Puffer
EGTA	Sigma-aldrich, USA	E3889	Zur Aufbereitung von Waschpuffer
Gel-Dokumentationssystem	Bio-Rad, USA	Gel Doc XR+	Zur Abbildung des Agarosegels
Glycerol	Sigma-aldrich, USA	G5516	Zur Aufbereitung von Loading-Puffer für die Agarose-Gelelektrophorese
GoldView II (5.000x)	Solarbio,. China	G8142	DNA-Färbung
Hybond-N+, Nylonmembran	Amersham Biosciences, USA	RPN119	Für Northern Blot
Image Lab	Bio-Rad, USA	Image Lab 3.0	Image Gel, und vergleichen Sie die Häufigkeit von PCR-Produkten.
KH2PO4	Sigma-aldrich, USA	V900041	Zur Herstellung von Extraktionspuffer
KOH	Aladdin, China	P112284	Zur Herstellung von Extraktionspuffer
L-Cystein	Sigma-aldrich, USA	V900399	Zur Herstellung von Extraktionspuffer
Millex	Millipore, USA	SLHP033RB	Zur sterilen Extraktion und Waschpuffer durch Filtration
Miracloth	Calbiochem, USA	475855-1R	Zur Filtration des gemahlenen Kerngewebes
MOPS	Sigma-aldrich, USA	V900306	Zur Vorbereitung von Laufpuffern für Northern Blot
	NanoDrop Thermo Fisher Scientific, USA	2000C	Für RNA-Konzentrations- und Reinheitsassays
NaOH	Sigma-aldrich, USA	V900797	Für Herstellung des Waschpuffers
pEASY-Blunt einfacher Klonierungsvektor	TransGen Biotech, China	CB111	Klonierung der gelgewonnenen Bande. Es enthält einen T7-Promotor mehrere bps stromaufwärts der Insertionsstelle.
Phanta max Super-Fidelity-DNA-Polymerase	Vazyme, China	P505	DNA-Polymerase für die PCR-Amplifikation
Polyvinylpyrrolidon 40	Sigma-aldrich, USA	V900008	Zur Herstellung von Extraktionspuffer
Primer Premier 6.24	PREMIER Biosoft, USA	Primer Premier 6.24	Zur Entwicklung von Primern für die reverse Transkription und PCR-Amplifikation
PrimeScript II reverse Transkriptase	Takara, Japan	2690	Zur Synthese des ersten Strangs cDNA
PureLink RNA Mini Kit	Thermo Fisher Scientific, USA	12183025	Für die RNA-Reinigung
RNA 5' Polyphosphatase	Epicentre, USA	RP8092H	Zur Umwandlung von 5'-Triphosphat in Monophosphat
RNase Inhibitor	New England Biolabs, UK	M0314	Es ist ein Bestandteil der RNA-Selbstligation und der 5'-Polyphosphatase-Behandlungsreaktionen und wird verwendet, um die Aktivität von RNase zu hemmen.
Natriumacetat	Sigma-aldrich, USA	V900212	Zur Herstellung von Laufpuffer für Northern Blot
Natriumchlorid	Sigma-aldrich, USA	V900058	Zur Herstellung von 20x SSC
SsoFas evaGreen Supermixes	Bio-Rad, USA	1725202	Für RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs, UK	M0437	Für RNA-Zirkularisierung
Tetranatrium	Pyrophosphat Sigma-aldrich, USA	221368	Zur Herstellung von Extraktionspuffer
TIANgel Midi-Aufreinigungskit	Tiangen Biotech, China	DP209	Zur Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegel
Tris	Aladdin, China	T110601	Zur Herstellung von 1x TAE-Puffer
TRIzol-Reagenz	Invitrogen, USA	15596026	Zur Extraktion von mitochondiraler RNA.
Universelles DNA-Aufreinigungskit	Tiangen Biotech, China	DP214	Zur Gewinnung linearisierter Plastmide aus der Restriktionsenzymverdauungsreaktion
Xylolcyanol FF	Sigma-aldrich, USA	X4126	Zur Herstellung von Ladepuffer für die Agarosegelelektrophorese