Stammzell-abgeleitete virale Ag-spezifische T-Lymphozyten unterdrücken HBV-Replikation bei Mäusen

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur wirksamen Unterdrückung der Hepatitis-B-Virus -Replikation (HBV) bei Mäusen unter Verwendung des Adoptivzelltransfers (ACT) von Stammzell-abgeleitetem viralem Antigen (Ag)-spezifischen T-Lymphozyten vorgestellt. Dieses Verfahren kann für eine mögliche ACT-basierte Immuntherapie der HBV-Infektion angepasst werden.

Zusammenfassung

Hepatitis-B-Virus (HBV) Infektion ist ein globales Gesundheitsproblem. Mit über 350 Millionen Menschen weltweit ist die HBV-Infektion nach wie vor die Hauptursache für Leberkrebs. Dies ist ein großes Anliegen, insbesondere in den Entwicklungsländern. Das Versagen des Immunsystems, eine wirksame Reaktion gegen HBV zu montieren, führt zu einer chronischen Infektion. Obwohl HBV-Impfstoff vorhanden ist und neue antivirale Medikamente entwickelt werden, bleibt die Tilgung von Virusreservoirzellen ein großes Gesundheitsthema. Hier wird eine Methode zur Generierung von viralem Antigen (Ag) -spezifische CD8⁺ zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) beschrieben, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) (d. h. iPSC-CTLs) abgeleitet werden, die die Fähigkeit haben, die HBV-Replikation zu unterdrücken. Die HBV-Replikation wird bei Mäusen effizient durch hydrodynamische Injektion eines HBV-Expressionsplasmids pAAV/HBV1.2 in die Leber induziert. Dann werden HBV-Oberflächen-Ag-spezifische Maus-iPSC-CTLs adoptiv übertragen, was die HBV-Replikation in Leber und Blut stark unterdrückt und die HBV-Oberflächen-Ag-Expression in Hepatozyten verhindert. Diese Methode demonstriert die HBV-Replikation bei Mäusen nach hydrodynamischer Injektion und dass von Stammzellen abgeleitete virale Ag-spezifische CTLs die HBV-Replikation unterdrücken können. Dieses Protokoll bietet eine nützliche Methode für die HBV-Immuntherapie.

Einleitung

Nach einer akuten Infektion kontrolliert das adaptive Immunsystem (d.h. die humorale und zelluläre Immunität) den Großteil der akuten HBV-bedingten Hepatitis. Dennoch können eine Reihe von Menschen in den HBV-endemischen Regionen die Viren nicht eliminieren und sich anschließend als chronische Individuen bekehren. Mehr als 25% der chronischen Patienten (>250 Millionen Menschen) weltweit entwickeln progressive Lebererkrankungen, die zu Leberzirrhose und/oder hepatozellulärem Karzinom (HCC)¹führen. Infolgedessen bleibt die Tilgung von hartnäckig infizierten Zellen ein allgemeines Gesundheitsproblem, obwohl es einen verfügbaren Impfstoff

Protokoll

Alle Tierversuche sind vom Texas A&M University Animal Care Committee (IACUC; #2018-0006) zugelassen und werden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care durchgeführt. Mäuse werden im Alter von 6 bis 9 Wochen verwendet.

1. Erzeugung viraler Ag-spezifischer CD8⁺ T-Zellen aus iPSCs (iPSC-CD8⁺ T-Zellen)

1. Erstellung der retroviralen Konstrukte
   HINWEIS: TCR- und -Gene sind mit einer 2A-Selbstverklassungssequenz verknüpft. Der retrovirale Vektor MSCV-IRES-DsRed (MiDR) ist DsRed^{+ 23}.
   1. Subklon-HBs<....

Ergebnisse

Wie hier gezeigt, werden HBV-virale Ag-spezifische iPSC-CD8⁺ T-Zellen durch ein In-vitro-Kultursystem erzeugt. Nach ACT dieser viralen Ag-spezifischen iPSC-CD8⁺ T-Zellen unterdrücken hBV-Replikation in einem murinen Modell (Supplemental File 1). Maus iPSC werden mit dem MIDR retroviralen Konstrukt transduziert, das ein Human-Maus-Hybrid-HBV-TCR-Gen kodiert (HBs_{183-191-spezifisch,}s183), dann werden die gentransduzierten iPSCs mit OP9-DL1/DL4-Zellen kokulturiert, die Notchl.......

Diskussion

Dieses Protokoll stellt eine Methode zum Generieren der viralen Ag-spezifischen iPSC-CTLs zur Verwendung als ACT zur Unterdrückung der HBV-Replikation in einem murinen Modell dar. Bei chronischer HBV-Infektion bildet das virale Genom ein stabiles Mini-Chromosom, die kovalent geschlossene kreisförmige DNA (cccDNA), die über die gesamte Lebensdauer des Hepatozyten bestehen kann. Die gezielte Clearance des viralen Mini-Chromosoms kann zu einer Heilung der chronischen HBV-Infektion führen. Die aktuelle antivirale Therapie zi.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
HHD-Mäuse	Institut Pasteur, Paris, Frankreich		H-2 Klasse I Knockout, HLA-A2.1-transgene (HHD) Mäuse
iPS-MEF-Ng-20D-17	RIKEN Cell Bank	APS0001
SNL76/7	ATCC	SCRC-1049
OP9	ATCC	CRL-2749
pAAV/HBV1.2	Plasmid Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan)		HBV-DNA-Konstrukt
HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-spezifische TCR-Gene	Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Kanada)		FLLTRILTI-spezifische A2-restriktive human-murine Hybrid-TCR-Gene (Vα 34 und Vβ 28)
OVA257– 264-spezifische TCR-Gene	Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA)		SIINFEKL-spezifische H-2Kb-restriktive TCR-Gene
Anti-CD3 (17A2) Antikörper	Biolegend	100236
Anti-CD44 (IM7) Antikörper	BD Pharmingen	103012
Anti-CD4 (GK1.5) Antikörper	Biolegend	100408
Anti-CD8 (53-6.7) Antikörper	Biolegend
Anti-IFN-& Gamma (XMG1.2) Antikörper	Biolegend	505810
Anti-TNF-a (MP6-XT22) Antikörper	Biolegend	506306
α-MEM	Invitrogen	A10490-01
Anti-HBs Antikörper	Thermo Fisher	MA5-13059
ACK Lysepuffer	Lonza	10-548E
Brefeldin A	Sigma	B7651
DMEM	Invitrogen	ABCD1234
FBS	Hyclone	SH3007.01
FACSAria Fusion Zellsortierer	BD	656700
Gelatin	MilliporeSigma	G9391
GeneJammer	Agilent	204130
HLA-A201-HBs183-91-PE Pentamer	Proimmune	F027-4A - 27
HRP Anti-Maus Sekundärantikörper	Invitrogen	A27025
mFlt-3L	Peprotech	250-31L
mIL-7	Peprotech	217-17
Nuklease S7	Roche	10107921001
Paraformaldehyd	MilliporeSigma	P6148-500G	Vorsicht: Allergen, krebserregend, toxisch
Permeabilisierungspuffer	Biolegend	421002
Polybrene	MilliporeSigma	107689
ProLong™ Gold Antifading Eindeckmittel mit DAPI	Invitrogen	P36931
QIAamp MinElute Virus Spin Kit	Qiagen	57704

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