Wir präsentieren ein detailliertes reparaturbasiertes Analyseprotokoll für kleine RNA-Bibliotheken mit weniger Voreingenommenheit als Standardmethoden und einer erhöhten Empfindlichkeit für 2'-O-Methyl-RNAs. Dieses Protokoll kann mit hausgemachten Reagenzien befolgt werden, um Kosten zu sparen oder Kits für die Bequemlichkeit zu verwenden.
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Methodenartikel
Verbesserung der kleinen RNA-Seq: Weniger Voreingenommenheit und bessere Detektion von 2'-O-Methyl RNAs
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Untersuchung kleiner RNAs (sRNAs) durch Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) wird durch Voreingenommenheitsprobleme während der Bibliotheksvorbereitung in Frage gestellt. Mehrere Arten von sRNA, wie z. B. pflanzliche microRNAs (miRNAs), tragen eine 2'-O-Methyl(2'-OMe) Modifikation an ihrem 3' Terminalnukleotid. Diese Änderung fügt eine weitere Schwierigkeit hinzu, da sie 3' Adapterligation hemmt. Wir haben zuvor gezeigt, dass modifizierte Versionen des 'TruSeq (TS)'-Protokolls weniger Voreingenommenheit und eine verbesserte Erkennung von 2'-OMe RNAs haben. Hier beschreiben wir im Detail Protokoll 'TS5', das die beste Gesamtleistung zeigte. TS5 kann entweder mit hausgemachten Reagenzien oder Reagenzien aus dem TS-Kit mit gleicher Leistung verfolgt werden.
Einleitung
Kleine RNAs (sRNAs) sind an der Kontrolle einer Vielfalt biologischer Prozesse beteiligt1. Eukaryotische regulatorische sRNAs sind in der Regel zwischen 20 und 30 nt groß; Die drei Haupttypen sind microRNAs (miRNA), piwi-interagierende RNAs (piRNA) und kleine störende RNAs (siRNA). Aberrante miRNA-Expressionsniveaus wurden in eine Vielzahl von Krankheiten verwickelt2. Dies unterstreicht die Bedeutung von miRNAs in Gesundheit und Krankheit und die Forderung nach genauen, quantitativen Forschungsinstrumenten zum Nachweis von sRNAs im Allgemeinen.
Die Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) i....
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Protokoll
1. Isolierung kleiner RNAs
- Extrahieren Sie die gesamte RNA mit phenolbasierten Reagenzien oder einer anderen Methode. Überprüfen Sie, ob die RNA von guter Qualität ist.
- Führen Sie ein 15% TBE-Harnstoffgel (siehe Materialtabelle) 15 min bei 200 V vor.
- Während das Gel vorlaufend ist, mischen Sie 5-20 g Gesamt-RNA in einem Volumen von 5-15 l mit einem gleichen Volumen von Formamid-Ladefarbstoff (siehe Tabelle der Materialien;95% deionisiertes Formamid, 0,025% Bromphenolblau, 0,025% Xylol cyanol, 5 mM EDTA pH 8) in einem 200-L-PCR-Rohr. Ebenso mischen Sie 10 l (200 ng) kleine RNA-Leiter (siehe Tabelle....
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Ergebnisse
Kritische Schritte sind die Isolierung des kleinen RNA-Anteils des Startgesamt-RNA-Materials (Abbildung 3) und des gewünschten Endbibliotheksprodukts (Abbildung 4). Beide Schritte beinhalten Polyacrylamid-Gel-Reinigung; kleine RNA wird aus 15% TBE Harnstoffgelen isoliert, während die endgültigen Bibliotheken aus 6% nativen TBE-Gelen isoliert sind. Kleine rna isoliert aus Gel kann auf einem kleinen RNA Kapillarelektrophorese Chip analysiert werden (Tabell.......
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Diskussion
Die Vorbereitung der kleinen RNA-Bibliothek bleibt aufgrund von Verzerrungen schwierig, die hauptsächlich während der Adapterligationsschritte eingeführt werden. RNAs mit einer 2'-OMe-Modifikation an ihrem 3'-Ende wie pflanzliche miRNAs, piRNA bei Insekten, Nematoden und Säugetieren und kleine störende RNAs (siRNA) in Insekten und Pflanzen sind besonders schwer zu untersuchen, da die 2'-OMe-Modifikation 3' Adapterligation hemmt. Eine Reihe von Lösungen wurden in der Literatur vorgeschlagen, um sRNA-Bibliotheksvorbereitun.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde vom National Center for Scientific Research (CNRS), der Französischen Kommission für alternative Energien und Atomenergie (CEA) und der Universität Paris-Sud unterstützt. Alle Bibliotheksvorbereitungs-, Illumina-Sequenzierungs- und Bioinformatik-Analysen für diese Studie wurden in der I2BC Next-Generation Sequencing (NGS)-Anlage durchgeführt. Die Mitglieder der I2BC NGS-Einrichtung werden für die kritische Lektüre des Manuskripts und hilfreiche Vorschläge gewürdigt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 2100 Bioanalysator-Instrument | Agilent | G2939BA | |
| Säure-Phenol:Chloroform, pH 4,5 (mit IAA, 125:24:1) | ThermoFisher | AM9720 | |
| Adenosin 5'-Triphosphat (ATP) | Nex England Biolabs | P0756S | |
| Agencourt AMPure XP Kügelchen | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalysator Hochempfindliches DNA-Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Bioanalyzer Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | |
| Corning Costar Spin-X Zentrifugenröhrchenfilter | Sigma Aldrich | CLS8162-96EA | |
| Dark Reader Transilluminator | diverse Suppiers | ||
| HotStart PCR Kit, mit dNTPs | Kapa Biosystems | KK2501 | |
| NEXTflex small RNA-seq V3 Kit | BIOO Scientific | NOVA-5132-05 | optional |
| Novex FSME Gele 6% | ThermoFisher | EC6265BOX | |
| Novex TBE Harnstoff Gele 15% | ThermoFisher | EC6885BOX | |
| QIAquick Nukleotid Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Qubit 4 Quantifizierungs-Starterkit | ThermoFisher | Q33227 | |
| Qubit ssDNA-Assay-Kit | ThermoFisher | Q10212 | |
| RNA-Gel-Ladefarbstoff (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNA-Gel-Ladefarbstoff (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNase-Inhibitor, Maus | Nex England Biolabs | M0314S | |
| SuperScript IV Reverse Transkriptase | ThermoFisher | 18090200 | |
| SYBR Gold Nukleinsäure-Gel-Färbung | ThermoFisher | S11494 | |
| T4 RNA-Ligase 1 (ssRNA-Ligase) | Nex England Biolabs | M0204S | |
| T4 RNA-Ligase 2, gekürzt | Nex England Biolabs | M0242S | |
| TrackIt 50 bp DNA Leiter | ThermoFisher | 10488043 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012/24/36/48 | optional |
| UltraPure Glycogen | ThermoFisher | 10814010 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| ZR kleine RNA-Leiter | Zymo Research | R1090< | |
Referenzen
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
- Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8
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Nachdrucke und Genehmigungen
