Präsentiert wird hier eine Elektroporationsmethode für die Plasmid-DNA-Abgabe und ependymogliale Zellbeschriftung im erwachsenen Zebrafischtelencephalon. Dieses Protokoll ist eine schnelle und effiziente Methode zur Visualisierung und Verfolgung einzelner ependymoglialer Zellen und eröffnet neue Möglichkeiten, Elektroporation auf eine breite Palette genetischer Manipulationen anzuwenden.
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Methodenartikel
Elektroporationsmethode zur In-Vivo-Lieferung von Plasmid-DNA im erwachsenen Zebrafisch Telencephalon
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Elektroporation ist ein Transfektionsverfahren, bei dem ein elektrisches Feld auf Zellen angewendet wird, um temporäre Poren in einer Zellmembran zu erzeugen und ihre Durchlässigkeit zu erhöhen, wodurch verschiedene Moleküle in die Zelle eingeführt werden können. In diesem Papier wird Elektroporation verwendet, um Plasmide in ependymogliale Zellen einzuführen, die die ventrikuläre Zone des erwachsenen Zebrafischtelencephalons aussäumen. Ein Bruchteil dieser Zellen zeigt Stammzelleigenschaften und erzeugt neue Neuronen im Zebrafischgehirn; Daher ist es wichtig, ihr Verhalten zu untersuchen, um ihre Rolle bei der Neurogenese und Regeneration zu bestimmen. Die Einführung von Plasmiden über Elektroporation ermöglicht die langfristige Kennzeichnung und Verfolgung einer einzelnen ependymogliaalen Zelle. Darüber hinaus können Plasmide wie Cre recombinase oder Cas9 an einzelne ependymogliade Zellen abgegeben werden, was eine Genrekombination oder Genbearbeitung ermöglicht und eine einzigartige Gelegenheit bietet, die autonome Genfunktion der Zelle in einer kontrollierten, natürlichen umgebung. Schließlich wird dieses detaillierte, schrittweise Elektroporationsprotokoll verwendet, um eine erfolgreiche Einführung von Plasmiden in eine große Anzahl von einzelnen ependymogliaalen Zellen zu erhalten.
Einleitung
Zebrafische sind ausgezeichnete Tiermodelle, um die Hirnregeneration nach einer Stichwunde zu untersuchen. Im Vergleich zu Säugetieren weisen auf der evolutionären Leiter weniger entwickelte Arten wie Zebrafische im Allgemeinen höhere Raten konstitutiver Neurogenese und breitere Bereiche des aufenthaltes von adulten neuronalen Stammzellen auf, was zu einer konstanten Erzeugung neuer Neuronen im gesamten die meisten Hirnbereiche im Erwachsenenleben. Diese Funktion scheint mit deutlich höheren Regenerationsfähigkeit von Zebrafischen im Vergleich zu Säugetieren1korrelieren, da Zebrafische ein bemerkenswertes Potenzial haben, in den meisten untersu....
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Protokoll
Alle in diesem Protokoll verwendeten Tiere wurden unter Standardhaltungsbedingungen gehalten, und die Versuche wurden gemäß den Handhabungsrichtlinien und -vorschriften der EU und der Regierung von Oberbayern durchgeführt (AZ 55.2-1-54-2532-0916).
1. Herstellung von Plasmidmischung zur Elektroporation
- Verdünnen Sie das Plasmid von Interesse an sterilem Wasser und fügen Sie schnelle grüne Fleckenstammlösung [1 mg/ml] hinzu. Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration des Plasmids 1 g/l beträgt. Fügen Sie den Fleck mit einer Konzentration von nicht mehr als 3% hinzu, da der einzige Zweck darin besteht, die Lösung zu färben und die....
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Ergebnisse
Die beschriebene Elektroporationsmethode ermöglicht die Abgabe von Plasmid-DNA in ependymogliale Zellen, die sich oberflächlich im Zebrafischtelencephalon und knapp unter der dorsalen ependymalen Zellschicht befinden (Abbildung 1A).
Wenn das Ergebnis der Elektroporation positiv ist, können markierte einzelne ependygliale Zellen (rote Zellen in Abbildung 2A,B) unter anderen ependymog.......
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Diskussion
Dieses Elektroporationsprotokoll ist eine zuverlässige In-vivo-Methode zur Kennzeichnung einzelner ependymotaler Zellen. Das Protokoll kann eine weitere Anpassung benötigen, um andere Zelltypen wie Neuronen oder Oligodendrozyten zu kennzeichnen. Um eine erfolgreiche Kennzeichnung zu erreichen, können Plasmide verwendet werden, die verschiedene Promotoren enthalten. Chicken-beta Actin Promoter, eF1alpha, CMV und Ubiquitin Promoter wurden zuvor verwendet, um die Expression von verschiedenen Transgenen in Ependymoglia und i.......
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Offenlegungen
Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Besonderer Dank geht an James Copti für die Bearbeitung des Manuskripts. Wir danken auch der Finanzierung von JN durch die Deutsche Forschungsstiftung (DFG) durch die SFB 870 und SPP "Integrative Analyse der Olfaction" und SPP 1738 "Emerging roles of non-coding RNAs in nervous system development, plastizität & disease", SPP1757 " Glial heterogenity" und Exzellenzstrategie im Rahmen des Munich Cluster for Systems Neurology (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Reagenz/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | Zum Färben der Plasmidlösung |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 sollte bei RT (bis zu zwei Wochen) gelagert und vor Licht geschützt werden |
| Ultraschallgel | SignaGel, Parker Laboratories INC. | 15-60 | Elektroden Gel |
| Equipment | |||
| Luftpumpe | TetraTec APS 50, 10l-60l | Kann im Zoofachhandel gekauft | |
| werden BTX Pinzetten Elektroden | Platinum Pinzetten, BTX Harvard Gerät | 45-0486 | |
| Elektroporationsgerät | BTX ECM830 Rechteck-Elektroporationssystem, BTX Harvard Gerät | 45-0662 | |
| Injektionsgerät | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glas Kapillare | Warner Instruments | 64-0766 | Modellnummer: G100-4 |
| Microloader-Spitzen | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick Mikromanipulator | Narishige Japan | MN - 151 | |
| Nadelhalter | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Nadelhalter wird zusammen mit der Injektionsvorrichtung |
| Nadelzugvorrichtung | Narishige Japan | Modellnummer: PC-10 | Der PC-10 wurde 2017 von Narishige eingestellt und durch die PC-100 |
| Petrischalen | Greiner Bio-One International | 633161 |
Referenzen
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J.
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Nachdrucke und Genehmigungen
