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Methodenartikel

Immunglobulin G N-Glycan Analyse durch Ultra-Performance Liquid Chromatographie

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DOI:

10.3791/60104

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18. Januar 2020

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1Beijing Key Laboratory of Clinical Epidemiology, School of Public Health, Capital Medical University, 2School of Public Health, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences, 3School of Medical and Health Sciences, Edith Cowan University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Immunglobulin G (IgG) N-Glycanwird durch hydrophile Wechselwirkungschromatographie UPLC charakterisiert. Darüber hinaus ist die Struktur von IgG N-Glycan klar getrennt. Hier wird eine Einführung in diese experimentelle Methode vorgestellt, so dass sie in der Forschung weit verbreitet werden kann.

Zusammenfassung

Glycomics ist eine neue Spezialität in der Omics-Systemforschung, die ein erhebliches Potenzial bei der Entdeckung von Biomarkern der nächsten Generation für Krankheitsanfälligkeit, Wirkstoffzielforschung und Präzisionsmedizin bietet. Alternative IgG N-Glykane wurden bei mehreren häufigen chronischen Krankheiten berichtet und schlugen vor, großes Potenzial in klinischen Anwendungen zu haben (d. h. Biomarker für die Diagnose und Vorhersage von Krankheiten). IgG N-Glykane sind weithin charakterisiert mit dem Verfahren der hydrophilen Interaktionschromatographie (HILIC) Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie (UPLC). UPLC ist eine stabile Detektionstechnologie mit guter Reproduzierbarkeit und hoher relativer quantitativer Genauigkeit. Darüber hinaus ist die Struktur von IgG N-Glycan klar getrennt, und Glyzanzusammensetzung und relative Häufigkeit im Plasma sind charakterisiert.

Einleitung

N-Glykosylierung menschlicher Proteine ist eine häufige und wesentliche posttranslationale Modifikation1 und kann dazu beitragen, das Auftreten und die Entwicklung von Krankheiten relativ genau vorherzusagen. Aufgrund der Komplexität seiner Struktur, es wird erwartet, dass es mehr als 5.000 Glykanstrukturen, die großes Potenzial als diagnostische und prädiktive Biomarker für Krankheiten2. N-Glykane, die an Immunglobulin G (IgG) angeschlossen sind, haben sich als wesentlich für die Funktion von IgG erwiesen, und IgG-N-Glykosylierung beteiligt sich am Gleichgewicht zwischen den pro- und entzündungshemmenden Systemen3. Differential-IgG N-Glykosylierung ist an der Entwicklung und Progression von Krankheiten beteiligt, was sowohl eine Veranlagung als auch einen funktionellen Mechanismus darstellt, der an der Krankheitspathologie beteiligt ist. Die entzündliche Rolle der IgG N-Glykosylierung wurde mit Alterung, entzündlichen Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen und Krebs assoziiert4.

Mit der Entwicklung der Detektionstechnik Die folgenden Methoden werden am häufigsten in Glykomik mit hohem Durchsatz eingesetzt: hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC) Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie mit Fluoreszenzdetektion (UPLC-FLR), Multiplex-Kapillargelelektrophorese mit laserinduzierten Fluores Cence Detection (xCGE-LIF), matrixgestützte Laser-Desorption/Ionisationszeit-massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) und Flüssigchromatographie-Elektrospray-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS) . Diese Methoden haben frühere Mängel des niedrigen Flusses, instabile Ergebnisse und schlechte Empfindlichkeitsspezifität5,6überwunden.

UPLC ist weit verbreitet, um den Zusammenhang zwischen IgG N-Glykosylierung und bestimmten Krankheiten zu erforschen (d.h. Alterung7, Adipositas8, Dyslipidämie9, Typ-II-Diabetes10, Bluthochdruck11, ischämischer Schlaganfall12, und Parkinson-Krankheit13). Im Vergleich zu den anderen drei oben genannten Methoden hat UPLC die folgenden Vorteile5,14. Erstens bietet es eine relative quantitative Analysemethode, und die Datenanalyse, die die Gesamtflächennormalisierung umfasst, verbessert die Vergleichbarkeit jeder Stichprobe. Zweitens sind die Kosten für Ausrüstung und das erforderliche Know-how relativ gering, was die Implementierung und Umwandlung von Glykosylierungsbiomarkern in klinische Anwendungen erleichtert. Hier wird eine Einführung in UPLC vorgestellt, damit es weiter verbreitet werden kann.

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Protokoll

Alle im Protokoll enthaltenen Themen wurden von der Ethikkommission der Capital Medical University, Peking, China12genehmigt. Zu Beginn der Studie wurde von jedem Fach die schriftliche Zustimmung in Kenntnis der Sachlage eingeholt.

1. IgG-Isolierung

  1. Herstellung der Chemikalien inklusive Bindungspuffer (Phosphatgepufferte Saline, PBS): 1x PBS (pH = 7,4), Neutralisationspuffer: 10x PBS (pH = 6,6-6,8), Eluent: 0,1 M Ameisensäure (pH = 2,5), Neutralisationslösung für Eluent: 1 M Ammoniumbicarbonat, gespeicherter Puffer: 20% Ethanol + 20 mM Tris + 0,1 M NaCl (pH = 7,4), Reinigungslösung für Protein G: 0,1 M NaOH + 30% Propan-2-ol.
    HINWEIS: Der pH-Wert ist in diesem Protokoll von entscheidender Bedeutung. Die Elution von IgG erfordert einen sehr niedrigen pH-Wert, und es besteht die Gefahr des Verlustes von Sialinsäuren durch saure Hydrolyse. Daher erfolgt die Elution innerhalb von Sekunden, und der pH-Wert wird schnell wieder neutralisiert, wodurch die Integrität von IgG und den Sialsäuren erhalten bleibt.
  2. Bereiten Sie die Proben vor: die gefrorene Plasmaprobe auftauen und dann 10 min bei 80 x g zentrieren und das Protein G monolithische Platte und die oben genannten Chemikalien 30 min bei Raumtemperatur (RT) lassen.
  3. Übertragen Sie eine 100-L-Probe (die verwendet werden kann, um 2x zu erkennen, um den ersten Ausfall zu verhindern) in eine 2 ml-Sammelplatte (hier wurden insgesamt sechs Standardproben, eine Kontrollprobe [ultrareines Wasser] und 89 Plasmaproben für 96 Bohrscheiben ausgelegt und nach dem Zufallsprinzip zugewiesen. auf die Platte).
  4. Die Proben mit 1x PBS mit 1:7 (v/v) verdünnen.
  5. Reinigen Sie eine 0,45 m hydrophile Polypropylen -Filterplatte (GHP) mit 200 l reinem Reinstwasser (Wiederholung 2x).
  6. Die verdünnten Proben in die Filterplatte geben und die Proben mit einer Vakuumpumpe in die Entnahmeplatte filtern (Vakuumdruck bei 266.6-399.9 Pa).
  7. Herstellung des Proteins G monolithische Platten
    1. Verwerfen Sie den Speicherpuffer.
    2. Reinigen Sie die monolithischen Platten mit 2 ml reinem Wasser, 2 ml 1x PBS, 1 ml 0,1 M Ameisensäure, 2 ml 10x PBS, 2 ml 1x 1x PBS (sequentiell) und entfernen Sie fließende Flüssigkeit mit einer Vakuumpumpe.
  8. Die gefilterten Proben zur IgG-Bindung und -Reinigung auf die monolithische Protein-G-Platte geben und anschließend die monolithischen Platten mit 2 ml 1x PBS reinigen (Reinigung 2x wiederholen).
  9. Elute IgG mit 1 ml 0,1 M Ameisensäure und Filtern Sie die Proben per Vakuumpumpe in die Sammelplatte, und fügen Sie dann 170 l 1 M Ammoniumbicarbonat in die Sammelplatte ein.
  10. IgG-Konzentration mit einem Absorptionsspektrophotometer (optimale Wellenlänge = 280 nm) erkennen.
    1. Öffnen Sie die Software und wählen Sie den Protein-CY3-Modus aus.
    2. Zeichnen Sie 2 l ultrareines Wasser und laden Sie es in den Bildschirm, und klicken Sie dann in der Software auf Leer, um den Bildschirm zu löschen (wiederholen Sie 1x).
    3. Zeichnen Sie 2 l ultrareines Wasser und laden Sie es in den Bildschirm, und klicken Sie dann in der Software auf Probe, um das reine Wasser zu erkennen.
    4. Zeichnen Sie 2 L igG-Probe und laden Sie es in den Bildschirm, und klicken Sie dann in der Software auf Sample, um das Sample zu erkennen.
    5. Zeichnen Sie 2 L ultrareines Wasser und laden Sie es in den Bildschirm, und klicken Sie dann in der Software auf Leer, um den Bildschirm zu löschen.
    6. Schließen Sie die Software.
      ANMERKUNG: Die Formel für die Berechnung der IgG-Konzentration lautet wie folgt:

      CIgG = Absorption x Aussterbekoeffizient (13,7) x 1.000 g/ml
  11. Das extrahierte IgG in einem Ofen bei 60 °C trocknen und das extrahierte IgG (300 l extrahiertes IgG für 4 h) aufbewahren.
    1. Entfernen Sie 300 l extrahiertes IgG, wenn die Konzentration größer als 1.000 g/ml ist.
    2. Entfernen Sie 350 l extrahiertes IgG, wenn die Konzentration zwischen 500-1.000 g/ml liegt.
    3. Entfernen Sie 400 l extrahiertes IgG, wenn die Konzentration zwischen 200-500 g/ml liegt.
    4. Entfernen Sie 600 l extrahiertes IgG, wenn die Konzentration kleiner als 200 g/ml ist.
      ANMERKUNG: Die Konzentration von IgG sollte vorzugsweise >200 g/ml für die nachfolgende Detektion betragen. Die durchschnittliche IgG-Menge sollte vorzugsweise >1.200 g betragen, was bei einem Fehlschlagen des ersten Tests 2x getestet werden kann.
  12. Reinigung der monolithischen Proteinplatte zur Wiederverwendung
    1. Waschen Sie die Platte mit 2 ml reinem Wasser, 1 ml 0,1 M NaOH (zur Entfernung von gefällten Proteinen), 4 ml reinem Wasser und 4 ml 1x PBS (sequentiell), und entfernen Sie dann fließende Flüssigkeit mit einer Vakuumpumpe.
    2. Waschen Sie die Platte mit 2 ml reinem Wasser, 2 ml 30% Propan-2-ol (zur Entfernung gebundener hydrophober Proteine), 2 ml reinem Wasser und 4 ml 1x PBS (sequenziell), und entfernen Sie dann fließende Flüssigkeit mit einer Vakuumpumpe.
    3. Waschen Sie die Platte mit 1 ml Puffer (20% Ethanol + 20 mm Tris + 0,1 M NaCl) und fügen Sie 1 ml Puffer (20% Ethanol + 20 mm Tris + 0,1 M NaCl) auf die Platte, dann lassen Sie die Platte bei 4 °C.

2. Glycan-Freisetzung

  1. Bereiten Sie das getrocknete IgG vor und lagern Sie die Chemikalien einschließlich 1,33% SDS, 4% Igepal (vom Licht weg lagern) und 5x PBS bei RT.
  2. Bereiten Sie das Enzym PNGase F vor, indem Sie das 250-U-Enzym mit 250 l reinem Wasser verdünnen.
  3. Denaturierung von IgG
    1. Fügen Sie 30 l von 1,33% SDS hinzu und mischen Sie sie durch Wirbeln, übertragen Sie die Probe 10 min in einen 65 °C-Ofen, dann entfernen Sie sie aus dem Ofen und lassen Sie sie 15 min ruhen.
    2. Fügen Sie 10 l von 4% Igepal hinzu und legen Sie es 5 min auf den Schüttelinkubator.
  4. Entfernung und Freisetzung von Glykanen
    1. Fügen Sie 20 l 5x PBS und 30-35 l 0,1 mol/L NaOH hinzu, um einen pH-Wert von 8,0 zu regulieren, und mischen Sie sie durch Wirbeln. Fügen Sie 4 L PNGase F-Enzym hinzu und mischen Sie sie durch Wirbeln. Dann für 18-20 h in einem 37 °C Wasserbad inkubieren.
    2. Die freigesetzten Glykane in einem Ofen bei 60 °C für 2,5-3,0 h trocknen.
    3. Die freigesetzten Glykane bis zur weiteren Messung bei -80 °C speichern.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung. Der Schlüssel zur Glykanfreisetzung ist die Verbesserung der Aktivität des Enzyms PNGase F, um seine Effizienz zu maximieren.

3. Glycan-Etikettierung und -Reinigung

  1. Bereiten Sie das 2-Aminobenzamid (2-AB) Etikettierungsreagenz mit 0,70 mg 2-AB, 10,50 l Essigsäure, 6 mg Natriumcyanoborohydrid (NaBH3CN) und 24,50 l Dimethylsulfoxid (DMSO) (Gesamtvolumen = 35 l) vor. Fügen Sie dann Essigsäure, 2-AB und NaBH3CN in die DMSO ein.
  2. Die Glykane mit 35 l 2-AB-Etikettierungsreagenz beschriften, die markierten Glykane 5 min auf den Oszillator übertragen, 3 h bei 65 °C in den Ofen geben und dann 30 min auf RT übertragen.
    HINWEIS: Der gesamte Glykan-Etikettierungsschritt muss unter Lichtschutz durchgeführt werden.
  3. Eine 0,2-mm-GHP-Filterplatte mit 200 l 70 % Ethanol, 200 l reinem Reinstwasser und 200 l 96 % Acetonitril (4 °C) pausieren und abfallen anschließend mit einer Vakuumpumpe.
  4. Reinigung von 2-AB-markiertem Glycan
    1. Fügen Sie dem 2-AB-markierten Glycan 700 l 100 % Acetonril hinzu und überweisen Sie es 5 min in einen Schüttelinkubator.
    2. Zentrifuge bei 134 x g für 5 min (4 °C).
    3. Übertragen Sie die Probe für 2 min auf eine 0,2 m GHP-Filterplatte und entfernen Sie das Filtrat (fließende Flüssigkeit) mit einer Vakuumpumpe.
  5. 2-AB-markiertes Glycan mit 200 l 96% Acetonitril (4 °C) waschen und das Filtrat (fließende Flüssigkeit) mit einer Vakuumpumpe 5x-6x entfernen.
  6. Elute 2-AB beschriftetes Glycan mit 100 l reinem Wasser 3x.
  7. Das 2-AB-markierte Glycan in einen Ofen geben, um bei 60 °C für 3,5 h zu trocknen.
  8. Bewahren Sie die beschrifteten N-Glykane bis zur weiteren Messung bei -80 °C auf.

4. Hydrophile Wechselwirkungschromatographie und Analyse von Glykanen

  1. Konditionierung von UPLC-Instrumenten und Vorbereitung mobiler Phasen
    1. Bereiten Sie mobile Phasen mit Lösungsmittel A vor: 100 mM Ammoniumformat (pH = 4,4), Lösungsmittel B: 100% Acetonitril, Lösungsmittel C: 90% reines Reinstwasser (10% Methanol) und Lösungsmittel D: 50% Methanol (ultrareines Wasser).
    2. Öffnen Sie die Software, um die mobilen Phasen zu steuern.
    3. WASCHEN Sie UPLC-Instrumente mit einer Durchflussrate von 0,2 ml/min (50% Lösungsmittel B und 50% Lösungsmittel C) für 30 min, dann bei einer Durchflussrate von 0,2 ml/min (25% Lösungsmittel A und 75% Lösungsmittel B) für 20 min, dann eine Durchflussrate von 0,4 ml/min Ausgleich.
  2. Lösen Sie die beschrifteten N-Glykane mit 25 l einer Mischung aus 100% Acetonitril und ultrareinem Wasser im Verhältnis 2:1 (v/v). Anschließend zentrifugieren Sie bei 134 g für 5 min (4 °C) und laden Sie 10 l der beschrifteten N-Glykane in die UPLC-Instrumente.
  3. Trennen Sie die beschrifteten N-Glykane mit einer Durchflussrate von 0,4 ml/min mit einem linearen Gradienten von 75% bis 62% Acetonitril für 25 min. Führen Sie dann einen analytischen Lauf mit dextran Kalibrierleiter/Glykopeptidsäule auf einem UPLC bei 60 °C durch (hier wurden die Proben vor der Injektion bei 4 °C aufbewahrt).
  4. Erkennen Sie N-Glyklyanfluoreszenz bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 330 nm bzw. 420 nm.
  5. Integrieren Sie die Glykane basierend auf Spitzenposition und Retentionszeit.
  6. Berechnen Sie den relativen Wert jedes Glycan Peak (GP)/ aller Glycan Peaks (GPs) (Prozentsatz, %) wie folgt: GP1: GP1/Gpps*100, GP2: GP2/GpPs*100, GP3: GP3/GPs*100, etc.

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Ergebnisse

Wie in Abbildung 1dargestellt, wurden IgG N-Glykane in 24 anfänglichen IgG-Glykanspitzen (GPs) basierend auf Spitzenposition und Retentionszeit analysiert. Die N-Glyglykanstrukturen sind durch Massenspektrometrienachweis gemäß einer früheren Studie (Tabelle 1)15verfügbar. Um eine vergleichbare Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten, wurde die Gesamtflächennormalisierung angewandt, bei der d...

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Diskussion

UPLC dient als relative quantitative Analysemethode5,15. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass UPLC eine stabile Detektionstechnologie mit guter Reproduzierbarkeit und relativer quantitativer Genauigkeit ist. Die Menge an Glykanen in jedem Peak wird als Prozentsatz der gesamten integrierten Fläche mit UPLC ausgedrückt, was der relative Wert ist. Die relative Quantifizierung verbessert die Vergleichbarkeit von Testproben. Darüber hinaus werden 96 Well-Protein-G-P...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Stipendien der National Natural Science Foundation of China (81673247 & 81872682) und des Australian-China Collaborative Grant (NH & MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-Aminobenzamid, 2-ABSigma, China
96-Well-SammelplatteAXYGEN
96-Well-FilterplattePol0,45 um GHP
96-Well-monolithische PlatteBIA Separations
96-Well-PlattenrotorEppendorf Co., Ltd, DeutschlandT_1087461900
EssigsäureSigma, China
AcetonitrilHuihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Ammonium bicarbonatShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Ammonium formiatBeijing Minruida Technology Co., Ltd.
Ständiges Schütteln Inkubator / WippeZhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, ChinaZWY-10313
Dextran Kalibrierungsleiter / GlykopeptidsäuleWatts technology Co., Ltd, ChinaBEH Säule
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma, China
DinatriumphosphatShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Elektrische ÖfenTester Instruments Co., Ltd202-2AB
Empower 3.0Waters Technology Co., Ltd, Amerika
EthanolHuihai Keyi Technology Co., Ltd, China
AmeisensäureSigma, China
GlycoProfile 2-AB BeschriftungskitSigma, China
HClJunrui Biotechnology Co., Ltd, China
HochgeschwindigkeitszentrifugeEppendorf Co., Ltd, Deutschland5430
IgepalSigma, China
NiedertemperaturzentrifugeEppendorf Co., Ltd, Deutschland
NiedertemperaturkühlschrankQingdao Haier Co., Ltd
Verteiler 96-Well-PlatteWatts-Technologie Co., Ltd, China186001831
MethanolHuihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Milli-Q ReinwassermessgerätMillipore Co., Ltd, AmerikaVorteil A10
NaOHShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
PH-TesterSartorius Co., Ltd, DeutschlandPB-10
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, PBSShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
PipetteEppendorf Co., Ltd, Deutschland4672100, 0,5-10μ L & 10-100 Monate L & 20-200 Mio. Jahre L & 1000 Mio. Tonnen l
PNGase FEnzym Sigma, China
KaliumdihydrogenphosphatShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Propan-2-olHuihai Keyi Technology Co., Ltd, China
SDSSigma, China
NatriumchloridShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Natriumcyanoborohydrid (NaBH3CN)Sigma, China
SpektralphotometerShanghai Yuanxi Instrument Co., LtdB-500
Transfer LiquidGun Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China4672100
TrisAmresco, Amerika
Ultra-Tieftemperatur-KühlschrankThermo Co., Ltd, AmerikaMLT-1386-3-V; MDF-382E
HochleistungsflüssigkeitschromatographieWatts Technology Co., Ltd, ChinaAcquity MLtraPerformance LC
VakuumpumpeWatts Technology Co., Ltd, China725000604
Verflüchtigungsmaschine/TrocknerEppendorf Co., Ltd, DeutschlandT_1087461900
VortexChangzhou Enpei Instrument Co., Ltd, ChinaNP-30S
Verifizierter Lieferant - Wasserbad-Tester instruments Co., LtdDK-98-IIA
WaageShanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd.MP200B

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

IgG N Glykananalysehydrophile InteraktionschromatographieGlykanzusammensetzungsanalyseProtein G monolithische PlatteEndoglykosidase F EnzymZwei Aminobenzimid MarkierungUPLC InstrumentenkalibrierungFluoreszenzdetektionswellenl ngenGlykan Peak Trennung
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