Methodenartikel

Charakterisierung einzelner Proteinaggregate durch Infrarot-Nanospektroskopie und Atomkraftmikroskopie

DOI:

10.3791/60108

⸱

12. September 2019

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry, University of Cambridge, 2Institute of Biotechnology, Life Sciences Center, Vilnius University, 3Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir beschreiben die Anwendung von Infrarot-Nanospektroskopie und hochauflösender Atomkraftmikroskopie, um den Prozess der Protein-Selbstmontage in oligomere Aggregate und Amyloidfibrillen zu visualisieren, die eng mit dem Beginn und der Entwicklung verbunden sind. einer Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen des Menschen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Phänomen der Proteinfehlfaltung und -aggregation führt zur Bildung hochheterogener Proteinaggregate, die mit neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson in Verbindung gebracht werden. Insbesondere niedermolekulare Aggregate, Amyloid-Oligomere, haben nachweislich generische zytotoxische Eigenschaften und sind als Neurotoxine in vielen Formen von Demenz involviert. Wir veranschaulichen den Einsatz von Methoden auf Basis der Atomkraftmikroskopie (AFM), um die anspruchsvolle Aufgabe der Charakterisierung der morphologischen, strukturellen und chemischen Eigenschaften dieser Aggregate anzugehen, die mit konventionellen strukturellen biophysikalische Methoden aufgrund ihrer Heterogenität und Vergänglichkeit. Scan-Sondenmikroskopie-Ansätze sind nun in der Lage, die Morphologie von Amyloid-Aggregaten mit Sub-Nanometer-Auflösung zu untersuchen. Wir zeigen hier, dass die Infrarot-Nanospektroskopie (AFM-IR), die gleichzeitig die hohe Auflösung von AFM und die chemische Erkennungskraft der IR-Spektroskopie ausnutzt, weiter gehen und die Charakterisierung der strukturellen Eigenschaften einzelner Proteinaggregate und bieten so Einblicke in die Aggregationsmechanismen. Da der von uns beschriebene Ansatz auch auf die Untersuchungen der Wechselwirkungen von Proteinassemblys mit kleinen Molekülen und Antikörpern angewendet werden kann, kann er grundlegende Informationen liefern, um neue therapeutische Verbindungen zur Diagnose oder Behandlung zu entwickeln. neurodegenerative Störungen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mehr als 40 Millionen Menschen weltweit sind derzeit von neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer (AD)1 und Parkinson (PD)2 Krankheiten betroffen. Allgemeiner gesagt, sind mehr als fünfzig Pathologien auf molekularer Ebene mit Proteinfehlfaltung und -aggregation assoziiert, ein Prozess, der zur Proliferation von unlöslichen fibrillaren Proteinaggregaten führt, die als Amyloidablagerungen3 bekannt sind. 4. Die molekularen Ursprünge der Neurodegeneration und ihre Verbindungen mit Proteinkonformationsveränderungen von Proteinen, die zur Amyloidbildung führen, bleiben jedoch weitgehend unklar, was zum großen Teil auf das hohe Maß an Heterogenität, transikulären Natur und nanoskalige Abmessungen der pathologischen Aggregate4,5.

Sehr erfolgreiche Untersuchungen von Proteinstrukturen in den letzten Jahrzehnten basierten weitgehend auf dem Einsatz von Massenmethoden, einschließlich Röntgenkristallographie, Kryo-Elektronenmikroskopie und Kernspinresonanzspektroskopie5, 6 , 7 , 8 , 9. Innerhalb dieser Klasse von Techniken hat sich die Infrarotspektroskopie (IR) als ein sensibles Analysewerkzeug herausgebildet, um die chemischen Eigenschaften biologischer Systeme wie Proteine8zu entwirren. IR-Methoden ermöglichen die Quantifizierung von sekundären und quartären Strukturveränderungen des Proteins während ihrer Fehlfaltung und Aggregation. Um auf mikroskopischer Ebene die mechanistischen Details, die in den komplexen freien Energielandschaften von Proteinen während ihrer Aggregation involviert sind, weiter zu entschlüsseln, war ein großer Fortschritt die Entwicklung chemischer Kinetik-Werkzeuge, die sich auf komplexe Selbstmontagewege einschließlich AmyloidfibrillenBildung5,6,7,10,11,12. Massenspektroskopische Methoden liefern jedoch nur durchschnittliche Informationen über das heterogene Artenensemble, das in Lösung oder in bestimmten mikroskopischen Schritten vorhanden ist, wodurch die Untersuchung der biophysikalischen Eigenschaften einzelner aggregierte Arten, die auf der Nanoskala anspruchsvoll sind13,14.

In den letzten Jahrzehnten sind mehrere Mikroskopietechniken mit der Fähigkeit entstanden, auf Skalen zu arbeiten, die kleiner als die Beugungsgrenze des Lichts sind. Diese Methodenklasse umfasst Elektronenmikroskopie (EM) und Atomkraftmikroskopie (AFM). Während Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zweidimensionale (2D) Bilder einer Probe liefern, hat sich AFM in den letzten Jahrzehnten als eine leistungsfähige und vielseitige Technik zur Untersuchung dreidimensionaler (3D) Morphologien sowie die nanomechanischen Eigenschaften einer Probe mit Sub-Nanometer-Auflösung13,14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. Der Grund für die Untersuchung der Proteinaggregation über AFM ist, dass dieser Ansatz die Untersuchung der Morphologie einzelner Arten in Lösung13,14,16ermöglicht. 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. Insbesondere durch die Überwachung der Probe als Funktion der Zeit, AFM ermöglicht die Untersuchung der Entwicklung der Morphologie der Art innerhalb der Probe, die es ermöglicht, zu folgen und visualisieren die Wege der Amyloidbildung23, 25,38,39,40,41,42. Darüber hinaus ermöglicht AFM die Quantifizierung von Strukturparametern wie Querschnittshöhen und -längen der einzelnen Arten in Lösung13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 , 45 , 46 , 47 , 48. Die Untersuchung einer einzigen biophysikalischen Eigenschaft, wie z. B. der Morphologie, reicht jedoch bei der Untersuchung heterogener und komplexer biologischer Systeme oft nicht aus. AFM-, SEM- oder TEM-Bildgebungsverfahren allein zeigen nicht ohne weiteres die chemischen Eigenschaften heterogener Arten von Amyloid-Aggregaten im Nanomaßstab.

Ein großer Fortschritt für die Analyse heterogener biologischer Proben in diesem Maßstab wurde in jüngster Zeit mit der Entwicklung und Anwendung auf dem Gebiet der Proteinaggregation der Infrarot-Nanospektroskopie (AFM-IR)24,26, 38,42,49,50,51,52. Diese innovative Methode nutzt die Kombination der räumlichen Auflösung von AFM (1,10 nm) mit der chemischen Analyseleistung von IR. Die AFM-IR-Technik basiert auf der Messung des photothermischen induzierten Resonanzeffekts, der von einem IR-Laser angetrieben wird, und auf der Messung der thermischen Ausdehnung der Probe, die von der AFM-Spitze untersucht wird. Die Probe kann mit dem IR-Laser direkt von oben oder von unten in der gesamten inneren Reflexion beleuchtet werden, ähnlich wie bei der herkömmlichen Infrarotspektroskopie24,42,52,53 . Der IR-Laser kann mit typischen Frequenzen in der Größenordnung von Hunderten von Kilohertz (1x1000 kHz) gepulst und über einen weiten Spektralbereich abgestimmt werden, typischerweise zwischen 1000 und 3300 cm-1. Obwohl die Laserquelle eine Fläche von 30 m Durchmesser abdeckt, wird die räumliche Auflösung der AFM-IR-Technik nominell durch den AFM-Spitzendurchmesser bestimmt, der die lokale Wärmeausdehnung des Systems erkennt. AFM-IR eignet sich gut für die Untersuchung biologischer Proben, da das IR-Signal proportional zu ihrer Dicke bis zu 1,5 m ist und die resultierenden IR-Spektren im Allgemeinen mit den entsprechenden FTIR-Übertragungsspektren13,54 übereinstimmen. ,55. Aus diesem Grund können etablierte Analysemethoden in der Spektroskopie problemlos angewendet werden, wie z. B. die Untersuchung chemischer Verschiebungen, Bandformänderung und De-Konvolution durch zweite Derivateanalyse52. Insgesamt ermöglicht AFM-IR durch die Kombination der räumlichen Auflösung von AFM mit der chemischen Erkennungskraft der IR-Spektroskopie die gleichzeitige Erfassung einer vielzahl morphologischer, mechanischer und chemischer Eigenschaften einer Probe im Nanomaßstab.

Hier illustrieren wir ein Protokoll zur Charakterisierung des Prozesses der Proteinaggregation, das die Kombination von In-vitro-Fluoreszenz-Assays, hochauflösender AFM-Bildgebung und nanoskaliger AFM-IR nutzt. Dieser kombinierte Ansatz hat sich bereits durch detaillierte Ergebnisse bei der Untersuchung der chemischen und strukturellen Eigenschaften einzelner Mikrotröpfchen, die durch Proteinaggregate gebildet werden, bei der Untersuchung der Flüssigkeits-Flüssig-Proteinphasentrennung und in Untersuchung der Heterogenität und der biophysikalischen Eigenschaften einzelner aggregierter Arten im Nanomaßstab23,26,38,45,50,53, 56,57.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Aggregations-Assays auf Fluoreszenzplattenlesern

HINWEIS: Das hier beschriebene Protokoll ist ein Beispiel dafür, wie die Aggregation von Proteinen oder Peptiden durch chemische Kinetik untersucht werden kann. Insbesondere beschreibt es ein optimiertes Protokoll zur Untersuchung der Aggregation des Peptids A-42, das am Beginn und fortschreitender Alzheimer-Krankheit beteiligt ist58,59. Ein ähnliches Protokoll kann angepasst und angenommen werden, um die Aggregation von Proteinen oder Peptiden zu untersuchen.

  1. Erhalten Sie eine hochreine monomerische Lösung von A-42 durch Ionenaustausch- und Größenausschluss-Chromatographie-Techniken, um Proteinfraktionen zu unterscheiden, die A42 enthalten, und um die monomere Fraktion von anderen aggregierten Formen von A-42 zu isolieren58 , 59.
  2. Verdünnen Sie das Peptid A-42 in 20 mM Natriumphosphatpuffer, 200 m EDTA bei pH 8,058 auf eine gewünschte Endkonzentration zwischen 1 und 5 m, in 1,5 ml bindungsarmen Röhrchen. Proben, die für AFM-Messungen gesammelt wurden, sollten nicht den fluoreszierenden Farbstoff enthalten, der im Aggregationstest verwendet wird (Thioflavin T, ThT), da es Artefakte während der Probenabscheidung für die AFM-Analyse einführen könnte. So bereiten Sie Triplicate von zwei identischen Lösungen vor: i) die erste, die monomeric A-42 enthält, um den Prozess der Aggregation durch AFM zu verfolgen; ii) die zweite, die die A-42-Monomeric-Datei mit einer Zugabe von 20 M ThT als Tracer zur Überwachung der Kinetik der Aggregation enthält.
    HINWEIS: Es ist wichtig, die Schritte 1.1 und 1.2 auf Eis durchzuführen. Mit diesem Verfahren soll sichergestellt werden, dass sich die monomere Lösung A-42 erst aggregiert, wenn sie im Plattenleser initiiert wird. Bei der Handhabung von Proben ist eine sorgfältige Pipettierung unerlässlich, um das Einbringen von Luftblasen zu vermeiden, die die Proteinprobe beeinflussen können.
  3. Pipette 80 l jeder Probe in jeder Bohrung einer 96-Well-Halbflächenplatte aus schwarzem Polystyrol mit klaren Boden- und unverbindlichen Oberflächen.
  4. Versiegeln Sie die Platte mit einer Folie, um die Verdunstung der Probe im Verlauf der Aggregation zu minimieren.
  5. Die Temperatur des Plattenlesers auf 37 °C ausdemieren.
  6. Richten Sie das Aggregationsprotokoll ein, um Fluoreszenzmessungen in festen Zeitpunktintervallen bei einer Anregungswellenlänge von 440 nm und einer Emissionswellenlänge von 480 nm zu lesen. Die Aggregation sollte unter stillen Bedingungen initiiert werden.
  7. Setzen Sie die Platte in den Plattenleser ein.
    HINWEIS: Es ist wichtig, beim Umgang mit der Platte vorsichtig zu sein, um sicherzustellen, dass die Aggregation nicht ausgelöst wird, bevor der Plattenleser gestartet wird. Verwenden Sie die Gain-Einstellungseinstellungen, um die optimale Auslesung der Fluoreszenz jeder Probe sicherzustellen.
  8. Starten Sie die Messung.
    ANMERKUNG: Das Aggregationsexperiment wird abgeschlossen, wenn die ThT-Fluoreszenz-Sigmoidalkurve ein Plateau58erreicht.

2. Probenvorbereitung für AFM- und Nano-IR-Messungen

  1. Kleben Sie die hochwertigste V1 Glimmerscheibe auf hochwertige magnetische Edelstahlscheibe mit Klebelaschen oder doppelseitigem Klebeband.
  2. Ätzen Sie Glimmer, indem Sie ein Stück Klebeband auf die Glimmeroberfläche legen und die obere Schicht des Glimmers abziehen. Dieses Verfahren erzeugt eine saubere, atomar flache Oberfläche, die für die Probenabscheidung geeignet ist.
    HINWEIS: Die geätzte Oberfläche muss gleichmäßig und glatt sein.
    VORSICHT: Berühren oder atmen Sie nicht direkt über frisch geätztem Glimmer, da dies Artefakte einführt.
  3. Halten/stoppen Sie die Plattenlesermessung, um den Zeitpunkt des Interesses während des Aggregationsprozesses des Proteins zu erfassen.
  4. Entfernen Sie die Dichtfolie und sammeln Sie 10 L Aliquot der Proben ohne ThT aus dem Brunnen in ein 1,5 ml tief bindendes Rohr.
  5. Legen Sie die 10 l der Probe auf den frisch geätzten Glimmer ab. Für AFM-IR-Messungen müssen Proben auf frisch abgestreiftem Goldsubstrat abgelagert werden.
  6. Inkubieren Sie die Lösung auf der Glimmer für 1 min, um eine Physisorbtion zu ermöglichen.
    HINWEIS: Eine längere Inkubationszeit würde eine bessere Absorption auf der Oberfläche ermöglichen, kann aber eine künstliche Selbstorganisation und Selbstmontage induzieren25. Um diese Effekte zu vermeiden, kann die Sprühabscheidung25ausgenutzt werden.
  7. Spülen Sie dreimal mit 1 ml Reinstwasser.
  8. Trocknen Sie unter einem sanften Stickstofffluss, um die Probe in der Luftumgebung zu messen.

3. AFM-Bildgebung der Morphologie von Proteinaggregaten

HINWEIS: Morphologiemessungen können sowohl im Kontakt- als auch im dynamischen Modus durchgeführt werden, in den folgenden Schritten wird letzteres beschrieben, da es die seitlichen Kräfte reduziert, um die 3D-Morphologie der Probe mit hoher Auflösung zu messen. AFM-IR-Messungen werden im Kontaktmodus durchgeführt, um das AFM-IR-Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern.

  1. Schalten Sie das AFM-System mindestens 30 min vor den Messungen ein, damit das System eine thermische Stabilität erreicht. Klicken Sie auf Setup, dann auf Probe. Klicken Sie im Fenster Probewechsel auf Weiter, um Z vorzubereiten, Fokusstufe.
  2. Schalten Sie den AFM-Strahlschalter aus (falls er eingeschaltet ist). Entsperren Sie die Schwalbenschwanzschlösser, trennen Sie den Kopf vom System und klicken Sie im Fenster Probewechsel auf Weiter.
  3. Montieren Sie den AFM-Ausleger am Sondenhalter. Schließen Sie den Kopf an das System an und verriegeln Sie die Schwalbenschwanzschlösser.
    HINWEIS: Optimale Ausleger zur Untersuchung biologischer Proben im dynamischen Modus AFM haben eine Federkonstante zwischen 2 x 40 N m-1 und eine Spitzenradien zwischen 2 8 nm14.
  4. Schalten Sie den AFM-Laserstrahlschalter ein und klicken Sie im Fenster Probewechsel auf Weiter.
  5. Klicken Sie im Popup-Fenster auf Nein, wenn sich der Freischwingertyp nicht geändert hat. Passen Sie die optischen Ausrichtungsknöpfe an, um den Ausleger zu finden. Passen Sie den Fokus auf den Ausleger an und klicken Sie auf Weiter.
  6. Klicken Sie im Popup-Fenster auf Ja, wenn der Fokus auf dem Ausleger liegt.
  7. Positionieren Sie den Laserstrahl am Ende des Auslegers mit den Knöpfen, die die Position des Detektionslasers steuern. Maximieren Sie das von der Vier-Quadranten-Photodiode gemessene Gesamtsignal auf mindestens >1 V mit den Knöpfen, die die Position des abgelenkten Laserstrahls auf der positionsempfindlichen Photodiode (PSPD) steuern. Klicken Sie im Fenster Probeänderung auf Weiter und dann auf Schließen.
  8. Warten Sie 15 min, bis der Ausleger thermische Stabilität erreicht. Stellen Sie bei Bedarf die Position des abgelenkten Laserstrahls auf dem PSPD nach.
  9. Klicken Sie auf NCM SWEEP, wählen Sie die gewünschte Amplitude der Schwingung, klicken Sie auf Phase verwenden, klicken Sie auf Auto und stimmen Sie den Ausleger in der Nähe des Maximums seiner ersten freien Resonanz der Schwingung, die von ca. 300 kHz für eine Ausleger mit einer Federkonstante von 40 N m-1.
    HINWEIS: Das Ausstellen des Auslegers aus dem Maximum seiner freien Resonanz gewährleistet eine höhere Stabilität der Messungen14.
  10. Legen Sie die Probe auf den Probenhalter. Wählen Sie geeignete Bildparameter aus. Die typische Scanrate liegt bei 0,3 bis 1,0 Hz für eine Scanfläche von 1 x 1 m2 bis 5 x 5 m2. Die typische Auflösung liegt zwischen 256 x 256 und 1024 x 1024 Pixeln. Klicken Sie auf Scanbereich, um die Scangröße und die Pixelzahl auszuwählen.
  11. Konzentrieren Sie die optische Ansicht auf die Probe. Klicken Sie auf Ansatz, um sich der Probenoberfläche zu nähern. Sobald der Anflug abgeschlossen ist, klicken Sie auf Lift 100 'm, um die AFM-Spitze 100 'm über die Oberfläche der Probe zu erheben. Klicken Sie auf das optische Bild des Samples erweitern. Klicken Sie auf die Fokusstufenleiste, um die Ansicht auf die Oberfläche des Beispiels zu fokussieren.
  12. Verwenden Sie die Pfeile, um sich im Bereich der Interessenprobe zu bewegen. Betreiben Sie die Oberfläche, indem Sie die Anflugtaste drücken. Klicken Sie auf die Schaltfläche Linienscan, und überprüfen Sie, ob die Spitze der Oberfläche gut folgt, passen Sie ggf. den Sollwert an.
  13. Starten Sie die Bildgebung der Probenoberfläche durch Drücken der Scan-Taste. Während der Bildgebung, um große bildgebende Kraft zu vermeiden und die Konsistenz innerhalb unabhängiger Proben zu halten, halten Sie ein konstantes Regime der Phasenänderung nicht mehr als 20 °42.
  14. Geben Sie den Dateinamen ein, und wählen Sie das Basisverzeichnis aus, in dem das erworbene Bild gespeichert werden soll.

4. Infrarot-Nanospektroskopie-Messungen von Proteinaggregaten

  1. Schalten Sie das AFM-IR-System und den Infrarot-Laser (IR)60 30 bis 60 min vor Messungen zur thermischen Stabilisierung ein. Typische Laser für AFM-IR-Instrumente sind optische Parameteroszillatoren (OPO) und Quantenkaskadenlaser (QCL).
  2. Öffnen Sie die integrierte Software, um das Gerät zu steuern. Klicken Sie auf Datei und dann auf neu, um eine neue nanoIR-Datei zu öffnen. Drücken Sie die Taste initialisieren, um das AFM-IR-System zu starten.
  3. Öffnen Sie die Instrumentenabdeckung und montieren Sie am AFM-IR-System eine siliziumgoldbeschichtete Sonde mit einem Nennradius von 30 nm und einer Federkonstante von 0,2 N/m, um die Probe im Kontaktmodus zu messen.
  4. Klicken Sie im Abschnitt AFM-Sonde auf Laden und dann weiter. Klicken Sie im Fokus auf den Sondenabschnitt auf die Pfeile, um die Kamera auf den Ausleger zu fokussieren. Verwenden Sie im Abschnitt SbXY-Bewegungdie Pfeile, um die Querluft am Ende des Auslegers zu platzieren.
  5. Drehen Sie die Knöpfe, die die Position des Erkennungslasers steuern, um den Laser am Ende des Auslegers zu positionieren. Drehen Sie die Laserknöpfe, um die von der Vier-Quadranten-Photodiode gemessene Summe auf einen Wert >3 V zu erkennen und zu maximieren. Drehen Sie den Umlenkknopf, um die Auslegerablenkung auf -1 V einzustellen, und klicken Sie dann auf weiter. Schließen Sie die Abdeckung des Instruments.
  6. Verwenden Sie im Abschnitt Fokus auf Beispiel die Pfeile, um die Kamera auf das Beispiel zu fokussieren. Dann, in der Abschnittsbeispiel XY Bewegung verwenden Sie die Pfeile in den Bereich des Interesses der Probe zu bewegen und klicken Sie auf Ansatz und engagieren.
  7. Wählen Sie im Mikroskopfenster als Eingänge die Kanäle aus, die von Interesse sind, um die biophysikalischen Eigenschaften der Probe abzubilden. Wählen Sie insbesondere Die Höhe für die Morphologie, Amplitude 2 für IR-Absorption und PLL-Frequenz, um die Kontaktresonanz der Spitze und der Probe zu kartieren.
  8. Verwenden Sie im AFM-Scanbereich des Steuerelementfensters ähnliche Parameter wie in Abschnitt 3 (d. h. Scanrate 0,1 x 1,0 Hz, zwischen 256 x 256 und 1024 x 1024 Pixel). Wählen Sie als Wert der Gewinne nach Stichprobenrauheit: Integral I = 1x10 und proportional P = 10-30. Klicken Sie dann auf Scannen, um eine Morphologiekarte zu erhalten.
    HINWEIS: Die Morphologie kann im dynamischen Abstichmodus ähnlich gemessen werden, aber AFM-IR-Messungen werden hier im Kontaktmodus durchgeführt, um höhere Signal-Rausch-Verhältnisse zu haben.
  9. Nachdem die Kartierung der Morphologie abgeschlossen ist, klicken Sie im Mikroskopfenster auf die Höhenkarte, um die Sonde oben auf einem Aggregat zu positionieren. Klicken Sie dann im Bereich nanoIR des Steuerungsfensters auf IR starten, um die Probe mit dem IR-Laser zu beleuchten.
  10. Um den Infrarotlaser auf den Ausleger zu fokussieren, klicken Sie auf Optimierung. Schreiben Sie in diesem Fenster eine Wellenzahl, bei der die Probe eine hohe Absorption simiert hat, und klicken Sie auf Hinzufügen. Für Protein ist ein typischer Wert 1655 cm-1. Klicken Sie auf Scannen, um die IR-Laserposition zu finden, und klicken Sie auf Update, um ihre Position am Ausleger auszurichten. Schließen Sie das Fenster.
  11. Schreiben Sie im Abschnitt Allgemein der nanoIR-Einstellung eine Wellenzahl, bei der eine hohe Absorption im relativen Feld erwartet wird. Deaktivieren Sie dann die Option Bandpassfilter und schauen Sie sich den Zählerstand und die schnelle Fourier-Transformation (FFT) der Auslegerantwort an. Bewegen Sie im FFT-Fenster den grünen Cursor, um die Resonanzfrequenz des Auslegers zu lesen. Ein typischer Wert der FFT der Resonanz der Ausleger liegt bei etwa 300 kHz. Schreiben Sie diesen Resonanzfrequenzwert in den allgemeinen Abschnitt im Freq.-Mittelfeld und verwenden Sie ein Freq.-Fenster von 50 kHz.
    HINWEIS: Wählen Sie eine Laserleistung aus, die niedrig genug ist, um den Zählerstand nicht zu sättigen und eine Verzerrung in der Auslegerantwort zu haben und die Probe nicht zu überhitzen.
  12. Klicken Sie auf das Laserpuls-Tuning-Fenster, um den Resonanz-verbesserten Modus zu verwenden. Wählen Sie einen Frequenzbereich von 300 kHz, einen Stimmbereich von 50 kHz und einen Einschaltzyklus des Lasers von 5%. Klicken Sie auf erwerben, um die Pulsfrequenz des Lasers zu fegen. Stimmen Sie den Laserpuls mithilfe des Cursors im Diagramm auf die Frequenz der mechanischen Reaktion der thermischen Ausdehnung der Probe ab, die das IR-Licht absorbiert. Wählen Sie dann die Option PLL aus, um die Kontaktresonanz zwischen der Probe und der Spitze zu überwachen. Drücken Sie die Nulltaste im PLL-Fenster und aktivieren Sie die Taste, um die Kontaktresonanz der Sample-Spitze zu verfolgen. Wählen Sie eine integrale Verstärkung I = 0,5 und proportionale Verstärkung P = 10. Schließen Sie das Fenster.
  13. Öffnen Sie erneut das Optimierungsfenster und finden Sie die Position des IR-Lasers für mindestens 3 Wellenzahlen, die den großen Absorptionsbändern der Probe (Amidband I-II-III) entsprechen, und für mindestens eine Wellenzahl für jeden Chip des Lasers.
  14. Klicken Sie auf Extras | IR-Hintergrundkalibrierung | Neu. Wählen Sie im Fenster den spektroskopischen Bereich aus, der von Interesse ist (1800 x 1200 cm-1, um Proteinproben zu untersuchen); die gleiche Pulsrate wie in Schritt 4.12 und einem Betriebszyklus von 5% zu wählen; Klicken Sie auf schnelle Erfassung und wählen Sie die Lasergeschwindigkeit, typische Reichweite für einen Quantenkaskadenlaser liegt zwischen 20 x 500 cm-1. Klicken Sie auf Acquire, um den IR-Laserhintergrund zu messen. Dieses Hintergrundspektrum wird zur Normalisierung der gemessenen nanoskaligen lokalisierten Spektren verwendet. Schließen Sie das Fenster.
    HINWEIS: Wenn ein schneller Laser- und Resonanz-verbesserter Modus nicht verfügbar ist, überspringen Sie Schritt 4.12 und wählen Sie gestufte Spektren anstelle von schnell im Hintergrund- und IR-Spektrenerfassungsfenster aus. Eine einzige Aggregatempfindlichkeit wird jedoch nicht erreicht.
  15. Wählen Sie in den IR-Spektreneinstellungen eine IR-Spektrumauflösung zwischen 1 x 4 cm-1 und einer Anzahl von Co-Durchschnitten von mindestens 64x. Klicken Sie auf Erwerben, um ein nanoskaliges lokalisiertes IR-Spektrum im Proteinbereich zu messen (1800 x 1200 cm-1).
  16. Um eine nanoskalige gelöste chemische Karte zu erhalten, wählen Sie die IR-Bildgebungsoption, wählen Sie eine Wellenzahl von Interesse (z. B. 1655 cm-1 für Amidband I) und klicken Sie im AFM-Scanfenster auf Scan.
  17. Sobald die Zuordnung abgeschlossen ist, gehen Sie zu Datei und speichern Sie die Messungen. Um die erworbenen Karten der Morphologie, Kontaktresonanz und Chemie sowie der nanoskaligen lokalisierten Spektren zu analysieren, verwenden Sie die integrierte AFM-Bildverarbeitungssoftware. Spectra und Images können als .csv- oder .axz-Dateien für eine weitere detaillierte Analyse mit kommerzieller Software gespeichert werden.

5. Bildverarbeitung und Analyse von Querschnittsabmessungen

  1. Flatten Rohbilder14,17,19,41,42,59 mit eingebauter AFM Bildverarbeitungssoftware oder kommerzieller Software.
    HINWEIS: Die Aggregate sollten aus der Berechnung verdeckt werden, um Artefakte der Analyse und Unterschätzung ihrer gemessenen Höhe zu vermeiden.
  2. Flachen Sie das Bild um 0 Order-Ebene passen Subtraktion.
  3. Das Bild nach Ebene und dann Zeile für Zeile in einer1. Regressionsreihenfolge abflachen, wird der zweite Schritt wiederholt, bis die flache Grundlinie im Linienprofil des Bildes erreicht ist.
  4. Wenn die Probe sehr überfüllt ist, außergewöhnlich hohe Aggregate enthält oder Scanner-Bogen-Artefakt vorhanden ist, flachten Sie das Bild mit 2nd Regressionsreihenfolge fit.
  5. Messen Sie die Aggregathöhe und -breite von einem Linienprofil, das senkrecht zur Fibrillenachse14,17,19,41,42,59genommen wird.
  6. Messen Sie die Fibrillenlänge parallel zur Fibrillenachse14,17,19,41,42,59.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbildung 1zeigt einen repräsentativen Zeitverlauf der A-42-Aggregation, gemessen anhand des ThT-Fluoreszenz-Assays. Der Aggregationsprozess ist häufig durch eine sigmoidale Kurve gekennzeichnet, bei der zunächst eine Verzögerungsphase beobachtet wird, gefolgt von einer steilen Wachstumsphase, bevor die Kurve ein Plateau erreicht, wenn ein Gleichgewichts-Stabilitätszustand erreicht wird6,7 , 58. Es ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der erste kritische Schritt in diesem Protokoll ist die Herstellung monomerer Proteine, wie im Fall der in den Schritten 1.1 und 1.2 beschriebenen Lösung A-42. Es ist wichtig, den Aggregationsprozess aus einer hochreinen, monomeren Lösung zu initiieren, da das Vorhandensein von oligomeren oder aggregierten Arten zu einer schlechten Reproduzierbarkeit der Aggregationskinetik führen kann58, und Artefakte im AFM induzieren kann. (z. B. fibrillare Arten werden in den Anfangsstadien der Aggregation sic...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken der Schweizerischen Nationalstiftung für Wissenschaft (SNF) für die finanzielle Unterstützung (Fördernummer P2ELP2_162116 und P300P2_171219), dem Darwin College, Erasmus+ Programm für die finanzielle Unterstützung (Fördernummer 2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3) und Forschung, die zu diesen Ergebnissen führt, wurde vom Europäischen Forschungsrat im Rahmen des Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Union (RP7/2007-2013) über das ERC-Stipendium PhysProt (Vereinbarung nr. 337969), die Newman Foundation (T.P.J.K.) und The The Cambridge Centre for Misfolding Diseases (C.G., M.V. und T.P.J.K.).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AFM-IR-SystemAnasys InstrumentsnanoIR 2 oder 3Systeme zur Messung der Wärmeausdehnung im Kontakt- und Resonanzmodus
Corning 96-Well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrol NBS MicroplateCorning3881
Corning Microplate Aluminium-DichtbandCorning6570
Doppelseitige KlebescheibenAGAR ScientificAGG3347N
FLUOstar OmegaBMG Labtech415-101Plattenleser
Glimmer Disc 10mm V1AGAR ScientificAGF7013
Park NX10 AFM-SystemPark SystemsN/ARasterkraftmikroskop
Platypus Ultra-Flat Gold ChipsPlatypus TechnologiesAU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 AuslegerPark SystemsPPP-NCHR-10
Protein LowBind Röhrchen, 2,0 mLEppendorf30108132
Silizium goldbeschichtete CantileversAnasys InstrumentsPR-EX-nIR2
SPM Probenscheiben 12 mmAGAR ScientificAGF7001

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).
  2. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 1-21 (2017).
  3. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
  4. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: A summary of progress over the last decade. Annual Review of Biochemistry. 86, 27-68 (2017).
  5. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 384-396 (2014).
  6. Meisl, G., et al. Molecular mechanisms of protein aggregation from global fitting of kinetic models. Nature Protocols. 11, 252-272 (2016).
  7. Knowles, T. P. J., et al. An analytical solution to the kinetics of breakable filament assembly. Science. 326, 1533-1537 (2009).
  8. Barth, A. Infrared spectroscopy of proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1767, 1073-1101 (2007).
  9. Fitzpatrick, A. W. P., et al. Atomic structure and hierarchical assembly of a cross- amyloid fibril. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 5468-5473 (2013).
  10. Cohen, S. I. A., et al. Proliferation of amyloid-β42 aggregates occurs through a secondary nucleation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 9758-9763 (2013).
  11. Michaels, T. C. T., Lazell, H. W., Arosio, P., Knowles, T. P. J. Dynamics of protein aggregation and oligomer formation governed by secondary nucleation. Journal of Chemical Physics. 143, (2015).
  12. Šarić, A., Michaels, T. C. T., Zaccone, A., Knowles, T. P. J., Frenkel, D. Kinetics of spontaneous filament nucleation via oligomers: Insights from theory and simulation. The Journal of Chemical Physics. 145, 211926(2016).
  13. Ruggeri, F. S., Habchi, J., Cerreta, A., Dietler, G. AFM-based single molecule techniques: Unraveling the amyloid pathogenic species. Current Pharmaceutical Design. 22, 3950-3970 (2016).
  14. Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Atomic force microscopy for single molecule characterisation of protein aggregation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 664, 134-138 (2019).
  15. Iljina, M., et al. Nanobodies raised against monomeric α-synuclein inhibit fibril formation and destabilize toxic oligomeric species. BMC Biology. 15, 1-14 (2017).
  16. Schilling, C., et al. Sequence-Optimized Peptide Nanofibers as Growth Stimulators for Regeneration of Peripheral Neurons. Advanced Functional Materials. 1809112, 1-15 (2019).
  17. Chiki, A., et al. Mutant exon1 huntingtin aggregation is regulated by T3 phosphorylation-induced structural changes and crosstalk between T3 phosphorylation and acetylation at K6. Angewandte Chemie - International Edition. 56, 5202-5207 (2017).
  18. Sieste, S., et al. Water-dispersible polydopamine-coated nanofibers for stimulation of neuronal growth and adhesion. Advanced Healthcare Materials. 7, 1-11 (2018).
  19. De, S., et al. Different soluble aggregates of Aβ42 can give rise to cellular toxicity through different mechanisms. Nature Communications. 10, 1541(2019).
  20. Chang, K. C., Chiang, Y. W., Yang, C. H., Liou, J. W. Atomic force microscopy in biology and biomedicine. Tzu Chi Medical Journal. 24, 162-169 (2012).
  21. Variola, F. Atomic force microscopy in biomaterials surface science. Physical Chemistry Chemical Physics. 17, 2950-2959 (2015).
  22. Drolle, E., Hane, F., Lee, B., Leonenko, Z. Atomic force microscopy to study molecular mechanisms of amyloid fibril formation and toxicity in Alzheimer’s disease. Drug Metabolism Reviews. 46, 207-223 (2014).
  23. Ruggeri, F. S., et al. Identification and nanomechanical characterization of the fundamental single-strand protofilaments of amyloid α-synuclein fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 7230-7235 (2018).
  24. Ruggeri, F. S., et al. Infrared nanospectroscopy characterization of oligomeric and fibrillar aggregates during amyloid formation. Nature Communications. 6, 1-9 (2015).
  25. Ruggeri, F. S., et al. Microfluidic deposition for resolving single-molecule protein architecture and heterogeneity. Nature Communications. 9, (2018).
  26. Qamar, S., et al. FUS phase peparation is modulated by a molecular chaperone and methylation of arginine cation-π interactions. Cell. 173, 720-734 (2018).
  27. Habchi, J., et al. Cholesterol catalyses Aβ42 aggregation through a heterogeneous nucleation pathway in the presence of lipid membranes. Nature Chemistry. 10, 673-683 (2018).
  28. Sweers, K. K. M., Stöckl, M., Bennink, M. L., Subramaniam, V. Characterizing nanoscale morphologic and mechanical properties of α-Synuclein amyloid fibrils with atomic force microscopy. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding & Aggregation. Uversky, V. N., Lyubchenko, Y. L. , London, UK. 309-322 (2014).
  29. Goldsbury, C., et al. Amyloid structure and assembly Insights from scanning transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 173, 1-13 (2011).
  30. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Devlin, G. L., Dobson, C. M., Welland, M. E. Analysis of structural order in amyloid fibrils. Nanotechnology. 18, (2007).
  31. Knowles, T. P. J., Mezzenga, R. Amyloid fibrils as building blocks for natural and artificial functional materials. Advanced Materials. , 6546-6561 (2016).
  32. Knowles, T. P. J., Oppenheim, T. W., Buell, A. K., Chirgadze, D. Y., Welland, M. E. Nanostructured films from hierarchical self-assembly of amyloidogenic proteins. Nature Nanotechnology. 5, 204-207 (2010).
  33. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Craig, A., Dobson, C. M., Welland, M. E. Spatial persistence of angular correlations in amyloid fibrils. Physical Review Letters. 96, 1-4 (2006).
  34. Knowles, T. P. J., et al. Twisting transition between crystalline and fibrillar phases of aggregated peptides. Physical Review Letters. 109, 158101(2012).
  35. Knowles, T. P., et al. Role of intermolecular forces in defining material properties of protein nanofibrils. Science. 318, 1900-1903 (2007).
  36. Smith, J. F., Knowles, T. P. J., Dobson, C. M., MacPhee, C. E., Welland, M. E. Characterization of the nanoscale properties of individual amyloid fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 15806-15811 (2006).
  37. Sokolov, D. V. Atomic force microscopy for protein nanotechnology. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 300, 323-367 (2013).
  38. Ruggeri, F. S., et al. Influence of the β-sheet content on the mechanical properties of aggregates during amyloid fibrillization. Angewandte Chemie - International Edition. 54, 2462-2466 (2015).
  39. Jeong, J. S., Ansaloni, A., Mezzenga, R., Lashuel, H. A., Dietler, G. Novel mechanistic insight into the molecular basis of amyloid polymorphism and secondary nucleation during amyloid formation. Journal of Molecular Biology. 425, 1765-1781 (2013).
  40. Adamcik, J., Mezzenga, R. Study of amyloid fibrils via atomic force microscopy. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 17, 369-376 (2012).
  41. Deguire, S. M., et al. N-terminal huntingtin (Htt) phosphorylation is a molecular switch regulating Htt aggregation, helical conformation, internalization, and nuclear targeting. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
  42. Ruggeri, F. S., et al. Nanoscale studies link amyloid maturity with polyglutamine diseases onset. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  43. Adamcik, J., et al. Understanding amyloid aggregation by statistical analysis of atomic force microscopy images. Nature Nanotechnology. 5, 423-428 (2010).
  44. Lin, Y. C., Komatsu, H., Ma, J., Axelsen, P. H., Fakhraai, Z. Quantitative analysis of amyloid polymorphism using height histograms to correct for tip convolution effects in atomic force microscopy imaging. RSC Advances. 6, 114286-114295 (2016).
  45. Mannini, B., et al. Stabilization and characterization of cytotoxic Aβ40 oligomers isolated from an aggregation reaction in the presence of zinc ions. ACS Chemical Neuroscience. , (2018).
  46. Medalsy, I., Hensen, U., Muller, D. J. Imaging and quantifying chemical and physical properties of native proteins at molecular resolution by force-volume AFM. Angewandte Chemie - International Edition. 50, 12103-12108 (2011).
  47. Dufrêne, Y. F., Martínez-Martín, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Müller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve–based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
  48. Takai, E., et al. Scanning electron microscope imaging of amyloid fibrils. American Journal of Biochemistry and Biotechnology. 10, 31-39 (2014).
  49. Dazzi, A., et al. AFM-IR: Combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization. Applied Spectroscopy. 66, 1365-1384 (2012).
  50. Volpatti, L. R., et al. Micro- and nanoscale hierarchical structure of core-shell protein microgels. Journal of Materials Chemistry B. 4, 7989-7999 (2016).
  51. Galante, D., et al. A critical concentration of N-terminal pyroglutamylated amyloid beta drives the misfolding of Ab1-42 into more toxic aggregates. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 79, 261-270 (2016).
  52. Ruggeri, F. S., et al. Identification of oxidative stress in red blood cells with nanoscale chemical resolution by infrared nanospectroscopy. International Journal of Molecular Sciences. 19, 1-14 (2018).
  53. Ramer, G., Ruggeri, F. S., Levin, A., Knowles, T. P. J., Centrone, A. Determination of polypeptide conformation with nanoscale resolution in water. ACS Nano. 12 (7), 6612-6619 (2018).
  54. Dazzi, A., Prater, C. B. AFM-IR: Technology and applications in nanoscale infrared spectroscopy and chemical imaging. Chemical Reviews. 117, 5146-5173 (2017).
  55. Lahiri, B., Holland, G., Centrone, A. Chemical imaging beyond the diffraction limit: experimental validation of the PTIR technique. Small. 9 (3), 439-445 (2013).
  56. Ansaloni, A., et al. One-pot semisynthesis of exon 1 of the huntingtin protein: New tools for elucidating the role of posttranslational modifications in the pathogenesis of Huntington’s disease. Angewandte Chemie - International Edition. 53 (7), 1928-1933 (2014).
  57. Khalaf, O., et al. The H50Q mutation enhances α-synuclein aggregation, secretion, and toxicity. Journal of Biological Chemistry. 289, 21856-21876 (2014).
  58. Hellstrand, E., Boland, B., Walsh, D. M., Linse, S. Amyloid β-protein aggregation produces highly reproducible kinetic data and occurs by a two-phase process. ACS Chemical Neuroscience. 1, 13-18 (2010).
  59. Limbocker, R., et al. Trodusquemine enhances Aβ42 aggregation but suppresses its toxicity by displacing oligomers from cell membranes. Nature Communications. 10 (1), 225(2019).
  60. Lu, F., Belkin, M. A. Infrared absorption nano-spectroscopy using sample photoexpansion induced by tunable quantum cascade lasers. Optics Express. 19, 1902-1904 (2011).
  61. Jiao, Y., Schäffer, T. E. Accurate height and volume measurements on soft samples with the atomic force microscope. Langmuir. 20, 10038-10045 (2004).
  62. Müller, D. J., Engel, A. The height of biomolecules measured with the atomic force microscope depends on electrostatic interactions. Biophysical Journal. 73, 1633-1644 (1997).
  63. Heymann, J. B., Moller, C., Muller, D. J. Sampling effects influence heights measured with atomic force microscopy. Journal Of Microscopy-Oxford. 207, 43-51 (2002).
  64. Marinello, F., Balcon, M., Schiavuta, P., Carmignato, S., Savio, E. Thermal drift study on different commercial scanning probe microscopes during the initial warming-up phase. Measurement Science and Technology. 22, 9(2011).
  65. Marinello, F., Bariani, P., De Chiffre, L., Savio, E. Fast technique for AFM vertical drift compensation. Measurement Science and Technology. 18, 689-696 (2007).
  66. Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in AFM imaging (Clifton, N.J.). Methods in Molecular Biology. 242, 25-27 (2004).
  67. Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Atomic Force Microscopy in Biomedical Research. Braga, P. C., Ricci, D. 736, Humana Press. New York, NY. 31-43 (2011).
  68. Marinello, F., Carmignato, S., Voltan, A., Savio, E., De Chiffre, L. Error Sources in Atomic Force Microscopy for Dimensional Measurements: Taxonomy and Modeling. Journal of Manufacturing Science and Engineering. 132, 030903(2010).
  69. Ukraintsev, E., Kromka, A., Kozak, H., Reme, Z., Rezek, B. Artifacts in Atomic Force Microscopy of Biological Samples. Atomic Force Microscopy Investigations into Biology - From Cell to Protein. Frewin, C. L. , (2012).
  70. Tsukruk, V. V., Singamaneni, S. Scanning Probe Microscopy of Soft Matter: Fundamentals and Practices. , Wiley-VCH Verlag GmbH. Weinheim, Germany. (2011).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

AFM IRMorphological AnalysisStructural PropertiesChemical PropertiesNeurodegenerative DiseasesAmyloid OligomersSingle Molecule Methods

Verwandte Artikel