Isolierung von Leukozyten aus menschlicher Muttermilch zur Verwendung in einem antikörperabhängigen zellulären Phagozytose-Assay von HIV-Zielen

Zusammenfassung

Muttermilch überträgt das humane Immundefizienzvirus (HIV), obwohl sich nur 15 % der säuglingsgestillten Säuglinge, die von HIV-infizierten Müttern gestillt werden, anstecken. Gestillte Säuglinge nehmen täglich 10⁵bis 10⁸ mütterliche Leukozyten auf, obwohl diese Zellen unteruntersucht sind. Hier beschreiben wir die Isolierung von Muttermilchleukozyten und eine Analyse ihrer phagozytischen Kapazität.

Zusammenfassung

Selbst in Ermangelung antiretroviraler Medikamente werden nur 15 % der Säuglinge infiziert, die von HIV-infizierten Müttern gestillt werden, was auf eine starke schützende Wirkung der Muttermilch (BM) hindeutet. Sofern der Zugang zu sauberem Wasser und geeigneter Säuglingsnahrung nicht zuverlässig ist, empfiehlt die WHO für HIV-infizierte Mütter keine Einstellung des Stillens. Zahlreiche Faktoren arbeiten wahrscheinlich zusammen, um die BM-Übertragung zu reduzieren. Gestillte Säuglinge nehmen täglich 10⁵bis 10⁸ mütterliche Leukozyten auf, was jedoch weitgehend unklar bleibt, ist der Beitrag dieser Zellen zu den antiviralen Qualitäten von BM. Antikörperabhängige zelluläre Phagozytose (ADCP), eine der essentiellen und durchdringendsten angeborenen Immunantworten, durch BM-Phagozyten gegen HIV-Ziele. Die Zellen wurden aus 5 menschlichen BM-Proben isoliert, die in verschiedenen Stadien der Laktation gewonnen wurden. Die Isolierung erfolgte durch sanfte Zentrifugation, gefolgt von einer sorgfältigen Entfernung von Milchfett und wiederholtem Waschen des Zellpellets. Fluoreszierende Perlen, die mit DEM Epitop hiv-hüllt waren, wurden als Ziele für die Analyse von ADCP verwendet. Die Zellen wurden mit dem CD45-Oberflächenmarker befleckt, um Leukozyten zu identifizieren. Es wurde festgestellt, dass die ADCP-Aktivität über Kontrollexperimenten signifikant war und reproduzierbar mit einem HIV-spezifischen Antikörper 830A messbar war.

Einleitung

Muttermilch (BM) besteht aus mütterlichen Zellen, die >90% lebensfähig sind¹. Die Zellzusammensetzung wird stark durch das Stadium der Stillzeit, den Gesundheitszustand von Mutter und Kind und die individuelle Variation beeinflusst, die nach wie vor wenig verstanden wird^1,2,3,4. Da BM 10³€10⁵ Leukozyten/ml enthält, kann geschätzt werden, dass gestillte Säuglinge täglich 10⁵x 10⁸ mütterliche Leukozyten^einnehmen. Verschiedene In-vivo-Studien haben gezei....

Protokoll

Jeder Teilnehmer an dieser Studie wurde in Übereinstimmung mit der Zustimmung des Ethik- und Institutionellen Prüfungsausschusses (IRB) mit der Anleitung und Genehmigung des Mount Sinai Program for the Protection of Human Subjects (PPHS) unter Verwendung eines Von IRB zugelassenen Programms für menschliche Subjekte (PPHS) rekrutiert und interviewt. für die Gewinnung von Muttermilchproben.

1. Ziel Mikrosphäre nerische Vorbereitung

1. Wählen Sie ein relevantes Zielantigen aus.
   HINWEIS: In diesem Beispiel wurde das rekombinante Protein V1V2-2F5K verwendet, das entwickelt wurde, um die trimerische Sp....

Ergebnisse

Milch kann bei Raumtemperatur oder kühler (wenn auch nicht gefroren) aufbewahrt werden; Da wir jedoch eine verminderte Lebensfähigkeit beobachtet haben, wenn Milch sehr kalt gehalten wurde (Daten nicht gezeigt), und dass es einfacher ist, kurz zu sammeln, zu lagern und bei Umgebungstemperaturen zu transportieren, wird empfohlen, Proben nicht zu kühlen, um Beispiel-zu-Probe-Variabilität. In Milch, die 7 bis 183 Tage nach der Partumato erhalten wurde, lag die durch den automatisierten Zellz.......

Diskussion

Die hier beschriebene Strömungszytometrie-basierte Technik zur Messung der ADCP-Aktivität wurde erstmals 2011³⁰ beschrieben und hat sich seitdem als robust erwiesen und in mehr als 80 Studien zitiert. Das hier beschriebene Protokoll passt diese Technik erstmals für die Verwendung mit primären BM-Zellen an. Frühere Studien über die Fc-vermittelte Funktionalität durch BM-Zellen beschränkten sich weitgehend auf die Messung oxidativer Ausbrüche oder histologiebasierte Phagozytose-Assays mit Zellen, di.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 & Mikro; m FluoSpheres NeutrAvidin-markierte Mikrosphären	Thermo Fisher	F8776
BD Pharmingen PE Maus Anti-Human CD45	BD	560975
Rinderserum Albumin	MP Biomedicals	8810025
Corning V-Boden Polystyrol 96-Well-Platte	Corning	3894
Cytochalasin D	Sigma	22144-77-0
EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin Kit	Thermo Fisher	21338
Falcon 15 mL Konische Zentrifugenröhrchen	Corning
Falcon 50 mL konische Zentrifugenröhrchen	Corning	352070
Fixierbarer Viability Stain 450	BD	562247
Formaldehydlösung	Sigma	252549
HBSS ohne Calcium, Magnesium oder Phenol Red	Life Technologies	14175-095
Human BD Fc Block	BD	564219
Human Serum Albumin	MP Biomedicals	2191349
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers	Kimberly-Clark Professional	34120
PBS 1x pH 7,4	Thermo Fisher	10010023
Polystyrol 10 mL Serologische Pipetten	Corning	4488
Proteinkonzentratoren PES, 3K MWCO, 0,5 mL	Loch	88512

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