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Methodenartikel

Isolierung von Leukozyten aus menschlicher Muttermilch zur Verwendung in einem antikörperabhängigen zellulären Phagozytose-Assay von HIV-Zielen

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⸱

DOI:

10.3791/60149

⸱

6. September 2019

 , 
1Division of Infectious Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Muttermilch überträgt das humane Immundefizienzvirus (HIV), obwohl sich nur 15 % der säuglingsgestillten Säuglinge, die von HIV-infizierten Müttern gestillt werden, anstecken. Gestillte Säuglinge nehmen täglich 105bis 108 mütterliche Leukozyten auf, obwohl diese Zellen unteruntersucht sind. Hier beschreiben wir die Isolierung von Muttermilchleukozyten und eine Analyse ihrer phagozytischen Kapazität.

Zusammenfassung

Selbst in Ermangelung antiretroviraler Medikamente werden nur 15 % der Säuglinge infiziert, die von HIV-infizierten Müttern gestillt werden, was auf eine starke schützende Wirkung der Muttermilch (BM) hindeutet. Sofern der Zugang zu sauberem Wasser und geeigneter Säuglingsnahrung nicht zuverlässig ist, empfiehlt die WHO für HIV-infizierte Mütter keine Einstellung des Stillens. Zahlreiche Faktoren arbeiten wahrscheinlich zusammen, um die BM-Übertragung zu reduzieren. Gestillte Säuglinge nehmen täglich 105bis 108 mütterliche Leukozyten auf, was jedoch weitgehend unklar bleibt, ist der Beitrag dieser Zellen zu den antiviralen Qualitäten von BM. Antikörperabhängige zelluläre Phagozytose (ADCP), eine der essentiellen und durchdringendsten angeborenen Immunantworten, durch BM-Phagozyten gegen HIV-Ziele. Die Zellen wurden aus 5 menschlichen BM-Proben isoliert, die in verschiedenen Stadien der Laktation gewonnen wurden. Die Isolierung erfolgte durch sanfte Zentrifugation, gefolgt von einer sorgfältigen Entfernung von Milchfett und wiederholtem Waschen des Zellpellets. Fluoreszierende Perlen, die mit DEM Epitop hiv-hüllt waren, wurden als Ziele für die Analyse von ADCP verwendet. Die Zellen wurden mit dem CD45-Oberflächenmarker befleckt, um Leukozyten zu identifizieren. Es wurde festgestellt, dass die ADCP-Aktivität über Kontrollexperimenten signifikant war und reproduzierbar mit einem HIV-spezifischen Antikörper 830A messbar war.

Einleitung

Muttermilch (BM) besteht aus mütterlichen Zellen, die >90% lebensfähig sind1. Die Zellzusammensetzung wird stark durch das Stadium der Stillzeit, den Gesundheitszustand von Mutter und Kind und die individuelle Variation beeinflusst, die nach wie vor wenig verstanden wird1,2,3,4. Da BM 103€105 Leukozyten/ml enthält, kann geschätzt werden, dass gestillte Säuglinge täglich 105x 108 mütterliche Leukozyteneinnehmen. Verschiedene In-vivo-Studien haben gezeigt, dass mütterliche Leukozyten dem Säugling eine kritische Immunität bieten und weit über diese Orte der Erstaufnahme hinaus funktionieren5,6,7,8 ,9,10,11. Alle mütterlich abgeleiteten Zellen, die vom Säugling aufgenommen werden, haben das Potenzial, Nebenfunktionen neben dem Säugling samt Leukozyten auszuführen oder zu kompensieren12.

Die Mutter-Kind-Übertragung (MTCT) des humanen Immundefizienzvirus (HIV) bleibt in ressourcenbegrenzten Ländern eine Krise. Da Durchfall- und Atemwegserkrankungen für eine erhebliche Sterblichkeitsrate bei Säuglingen in ressourcenbegrenzten Ländern verantwortlich sind und diese Krankheiten durch exklusives Stillen deutlich reduziert werden, sind die Vorteile für HIV-infizierte Mütter von Stillen weit überwiegt die Risiken13,14,15. Sofern der Zugang zu sauberem Wasser und geeigneter Säuglingsnahrung nicht zuverlässig ist, empfiehlt die WHO für HIV-infizierte Mütter16keine Einstellung des Stillens. Jährlich treten ca. 100.000 MTCTs über BM auf; doch, nur 15% der Säuglinge gestillt von ihren HIV-infizierten Müttern infiziert, was auf eine starke Schutzwirkung von BM17,18,19,20,21. Zahlreiche Faktoren arbeiten wahrscheinlich im Tandem, um eine Übertragung zu verhindern. Wichtig ist, dass HIV-spezifische Antikörper (Abs) in BM mit reduziertem MTCT und/oder reduziertem Tod von Säuglingen durch HIV-Infektion korreliert wurden22,23. Weitgehend unklar bleibt der Beitrag des zellulären Anteils von BM zu seinen antiviralen Qualitäten.

Viele Abs ermöglichen eine Vielzahl antiviraler Aktivitäten, die durch die "konstante" Region des Immunglobulinmoleküls, das kristallisierbare Fragment (Fc), über die Interaktion mit Fc-Rezeptoren (FcRs) vermittelt werden, die auf praktisch allen angeborenen Immunzellen gefunden werden, von denen praktisch alle finden sie in human BM24. Die antikörperabhängige zelluläre Phagozytose (ADCP) wurde als notwendig für die Clearance von Virusinfektionen nachgewiesen und im Falle der Prävention von MTCT von HIV25,26,27, 28 , 29. Angesichts des Mangels an Wissen über den potenziellen Beitrag der ADCP-Aktivität durch BM-Phagozyten zur Prävention von MTCT von HIV, wollten wir eine strenge Methode entwickeln, um Zellen aus menschlichen BM zu isolieren, um eine Studie über ADCP durchzuführen, die von Zellen aus BM in verschiedenen Stadien der Laktation erhalten.

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Protokoll

Jeder Teilnehmer an dieser Studie wurde in Übereinstimmung mit der Zustimmung des Ethik- und Institutionellen Prüfungsausschusses (IRB) mit der Anleitung und Genehmigung des Mount Sinai Program for the Protection of Human Subjects (PPHS) unter Verwendung eines Von IRB zugelassenen Programms für menschliche Subjekte (PPHS) rekrutiert und interviewt. für die Gewinnung von Muttermilchproben.

1. Ziel Mikrosphäre nerische Vorbereitung

  1. Wählen Sie ein relevantes Zielantigen aus.
    HINWEIS: In diesem Beispiel wurde das rekombinante Protein V1V2-2F5K verwendet, das entwickelt wurde, um die trimerische Spitze der nativen HIV-Hüllkurve30nachzuahmen.
  2. Biotinylierung mit einem kommerziellen Kit (Tabelle der Materialien) nach dem Herstellerprotokoll durchführen.
    1. Berechnen Sie mmol des Biotin-Reagenzes, um die Reaktion für einen 5-fachen Molüberschuss mit der Formel hinzuzufügen: mmol biotin = mL Protein x (mg Protein/mL Protein) x (mmol biotin/mg protein) x (5 mmol biotin/mmol protein)30,31. Berechnen Sie dann die L des Biotin-Reagenzes, das sie nach der Formel hinzufügen: "L biotin = mmol biotin x "1.000.000 l/L) x (L/10 mmol).
    2. Biotin vor dem Öffnen auf Raumtemperatur ausstellen. Auflösen Sie Dasprotein in 0,5 bis 2,0 ml Phosphatgepufferter Saline (PBS) nach der oben durchgeführten Berechnung.
    3. Bereiten Sie eine 10 mM Lösung des Biotinreagenzes in Dimethylsulfoxid (DMSO) vor und fügen Sie der Proteinlösung das entsprechende Volumen von 10 mM Biotinreagenz hinzu und inkubieren Sie die Reaktion auf Eis für 2 h oder bei Raumtemperatur 30 min.
  3. Überschüssiges Biotin mit Proteinkonzentratoren (Polyethersulfon [PES]-Membranen, 3 kDa Molekulargewichtsabschaltung [MWCO], 0,5 ml entfernen; Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    1. Legen Sie die Probe in die obere Kammer der Spinsäule ein und fügen Sie PBS bis zu 400 l. Kappe hinzu, und legen Sie diese Probenkammer dann in ein Sammelrohr ein. Zentrifuge bei 12.000 x g bei Raumtemperatur für 30 min.
    2. Durchfluss durchlassen und PBS zu 400 l hinzufügen. Zentrifugation wiederholen. Durchfluss durchlassen und PBS zu 100 l hinzufügen. Messen Sie die Proteinkonzentration durch ein Spektralphotometer.
      HINWEIS: Protein kann bei -80 °C eingefroren werden, bis es verwendet wird.

2. Antikörper-abhängige zelluläre Phagozytose (ADCP) Assay Plate Preparation

  1. Konjugieren Sie biotinyliertes Protein zu 1 m Mikrosphären ("Perlen"; Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    1. Pro Teller konjugierter Perlen 6 g Protein mit 12 l Stockperlen in 200 l 0,1% Rinderserumalbumin (BSA)-PBS bei Raumtemperatur für 1 h inkubieren und alle 20 min sanft wirbeln.
    2. Zentrifuge bei 13.000 x g für 5 min. Überstand entsorgen, sanft wirbeln und in 1200 l mit 0,1% BSA-PBS wieder aufsetzen. Wiederholen Sie Spin und waschen Schritt 2x. Resuspend in 1200 l von 0,1% BSA-PBS.
  2. Aliquot 10 l Perlenlösung pro Brunnen in einer runden 96-Well-Platte. Bereiten Sie Verdünnungen von Antikörpern oder Immunseren von Interesse in 12 l von 2% HSA HBSS, in der Regel beginnend bei 50 g/ml Antikörper oder einer 1/100 Serumverdünnung.
    HINWEIS: In den Probendaten wurde monoklonaler Antikörper (mAb) 830A verwendet.
  3. 10 L titrierter Antikörper/Sera auf die Perlenplatte geben und 2 h bei 37 °C brüten. Fügen Sie jedem Brunnen 200 l von 2% HSA HBSS und zentrifugenplatte bei 2.000 x g für 10 min hinzu.
  4. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig durch ein schnelles Umkippen und Dekantieren von Flüssigkeit aus den Plattenbrunnen in eine Spüle, um das unsichtbare Perlenpellet nicht zu stören.

3. Isolierung der Muttermilchzellen

  1. Erhalten Sie Muttermilch von gesunden laktierenden Frauen, ausgedrückt mit doppelten elektronischen oder manuellen Pumpen. Isolieren Sie Zellen innerhalb von 4 h expression, wobei Die Milch bei Raumtemperatur gehalten wird.
  2. Mit 50 ml Tuben Zentrifuge 50 ml Milch bei 800 x g für 15 min. Vorsichtig die Magermilch und Fett abgießen, während das Zellpellet ungestört bleibt. Wischen Sie die Innenseite des Rohres mit einem fusselfreien Wisch, um das gesamte Fett aus der Rohrwand zu entfernen.
  3. Fügen Sie 10 ml 2% humanes Serumalbumen in Hanks ausgewogene Salzlösung hinzu (2% HSA HBSS [ohne Ca2+ oder Mg+]). Setzen Sie das Pellet durch sanftes Pipettieren wieder auf, um Zellaktivierung und Apoptose zu vermeiden. 10 min in ein 15 ml Rohr und eine Zentrifuge bei 450 x g übertragen.
  4. Überstand abgießen und Schritt 1.3 wiederholen. Dann, sanft resuspendieren Zellen in 1-2 ml von 2% HSA HBSS in Abhängigkeit von der erwarteten Zellzahl, und zählen Zellen durch ein Hämozytometer oder einen automatisierten Zellzähler, beachten Sie auch die Zelllebensfähigkeit.

4. ADCP-Test

HINWEIS: Die hier beschriebenen Methoden sind von Ackerman et al.32angepasst.

  1. Fügen Sie 50.000 frisch isolierte BM-Zellen zu jeder ADCP-Assayplatte gut in 200 l von 2% HSA-HBSS hinzu. 2 h bei 37 °C inkubieren.
    1. Für Kontrollexperimente vorinkubierten Zellen bei 37 °C mit 10 g/ml-Aktininhibitor (Cytochalasin-D), 50 g/ml FcR-Blockiermittel (FcBlock) oder eine Kombination aus beidem vor deren Zugabe zu den Platten.
  2. Zentrifugenplatte bei 930 x g für 10 min. Fügen Sie 200 l von 2% HSA HBSS und Wiederholungzentrifugation hinzu. Entfernen Sie überstand vorsichtig wie in Schritt 2.7 und wiederholen Sie die Wäsche.
  3. Entfernen Sie vorsichtig Überstand- und Fleckenzellen für die Lebensfähigkeit mit 0,5 g/ml (Endkonzentration) fixierbaren Lebensfähigkeitsfleck 450 pro Bohrung in 50 l von 2% HSA HBSS. 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln bebrüten. Zentrifugenplatte bei 930 x g für 10 min und entfernen Überstand wie in Schritt 2.7. Fügen Sie 200 l von 2% HSA HBSS und Zentrifugenplatte wieder hinzu, gefolgt von der Entfernung von Überstand wie in Schritt 2.7.
  4. Nach der Lebensfähigkeitsfärbung, Fleckenzellen für Leukozytenmarker von Interesse, minimal einschließlich eines CD45-spezifischen Flecks wie PE-Maus Anti-Human CD45 (Klon HI30) in einer optimierten Konzentration (1 g / l in 50 l von 1% BSA HBSS in den Beispieldaten).
    HINWEIS: Alle linienspezifischen Markierungen können einbezogen werden.
  5. 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln bebrüten. Zentrifugenplatte bei 930 x g für 10 min und entfernen Überstand wie in Schritt 2.7. Fügen Sie 200 L von 1% BSA HBSS und Wiederholungzentrifugation hinzu. Entfernen Sie Überstand. Fixzellen in 200 l von 0,5% Formaldehyd im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 min oder über Nacht bei 4 °C. Kühlen Sie im Dunkeln bis zur Analyse.

5. Analyse durch Durchflusszytometrie

  1. Führen Sie anfängliches Gating durch, um Doublets auf einem Vorwärtsstreuungsdiagramm (FSC) und Einem SSC-Plot (Material kleiner als FSC = 5000) zu eliminieren (siehe Abbildung 1). Verwenden Sie ein SSC vs. Lebensfähigkeitsfleck (in diesem Fall V450), um abgestorbene Zellen zu beseitigen (solche, die positiv für den Lebensfähigkeitsfleck sind).
  2. Verwenden Sie ein SSC vs. CD45-Diagramm, um die wichtigsten Leukozytenklassen (Granulozyten, Monozyten, Lymphozyten) zu unterscheiden, wie ausführlich beschrieben33,34.
    HINWEIS: Diese Klassifizierung ist nur suggestiv und linienspezifische Marker sind erforderlich, um den Zelltyp zu bestätigen.
  3. Für alle CD45+-Zellen oder für jede Leukozyten-Teilmenge von Interesse messen SIE die ADCP-Aktivität, indem sie mit einem Marker auf den Perlen-positiven Zellen in einem Histogramm des Fluoresceinisothiocyanat(FITC)-Kanals, in dem die fluoreszierenden Perlen nachgewiesen werden, gegatingt werden.
    HINWEIS: Die negativen Kontrollbrunnen, in denen keine Perlen hinzugefügt wurden, zeigen an, wo die Perlen-positiven Zellen im Histogramm sichtbar sind und wo daher der Gating-Marker platziert werden soll.
  4. Berechnen Sie ADCP-Werte als (mediane Fluoreszenzintensität [MFI] von Perlen-positiven Zellen) x (% der gesamten CD45 + Zellen in der positiven Population). Verwenden Sie Grafiksoftware, um Partituren bei jeder Ab/Serum-Konzentration zu zeichnen und eine AUC-Analyse (Area-under-the-curve) durchzuführen.
    HINWEIS: ADCP gilt als positiv, wenn die AUC größer als die 3x Standardabweichung des ADCP-Scores AUC eines unspezifischen Negativkontroll-mAb ist (in diesem Fall 3865).

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Ergebnisse

Milch kann bei Raumtemperatur oder kühler (wenn auch nicht gefroren) aufbewahrt werden; Da wir jedoch eine verminderte Lebensfähigkeit beobachtet haben, wenn Milch sehr kalt gehalten wurde (Daten nicht gezeigt), und dass es einfacher ist, kurz zu sammeln, zu lagern und bei Umgebungstemperaturen zu transportieren, wird empfohlen, Proben nicht zu kühlen, um Beispiel-zu-Probe-Variabilität. In Milch, die 7 bis 183 Tage nach der Partumato erhalten wurde, lag die durch den automatisierten Zellz...

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Diskussion

Die hier beschriebene Strömungszytometrie-basierte Technik zur Messung der ADCP-Aktivität wurde erstmals 201130 beschrieben und hat sich seitdem als robust erwiesen und in mehr als 80 Studien zitiert. Das hier beschriebene Protokoll passt diese Technik erstmals für die Verwendung mit primären BM-Zellen an. Frühere Studien über die Fc-vermittelte Funktionalität durch BM-Zellen beschränkten sich weitgehend auf die Messung oxidativer Ausbrüche oder histologiebasierte Phagozytose-Assays mit Zellen, di...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir danken Dr. Susan Zolla-Pazner in der Abteilung für Medizin und Abteilung für Mikrobiologie an der Icahn School of Medicine am Berg Sinai für die Manuskriptüberprüfung. Das NIH/NICHD stellte Mittel für dieses Projekt unter der Fördernummer R21 HD095772-01A1 bereit. Darüber hinaus wurde R. Powell durch Mittel des Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Icahn School of Medicine am Mount Sinai unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 & Mikro; m FluoSpheres NeutrAvidin-markierte Mikrosphären Thermo FisherF8776
BD Pharmingen PE Maus Anti-Human CD45BD560975
Rinderserum AlbuminMP Biomedicals8810025
Corning V-Boden Polystyrol 96-Well-Platte Corning 3894
Cytochalasin DSigma22144-77-0
EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin Kit Thermo Fisher21338
Falcon 15 mL Konische ZentrifugenröhrchenCorning 
Falcon 50 mL konische ZentrifugenröhrchenCorning 352070
Fixierbarer Viability Stain 450 BD562247
FormaldehydlösungSigma252549 
HBSS ohne Calcium, Magnesium oder Phenol RedLife Technologies14175-095
Human BD Fc BlockBD564219
Human Serum AlbuminMP Biomedicals2191349
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task WipersKimberly-Clark Professional 34120
PBS 1x pH 7,4Thermo Fisher10010023
Polystyrol 10 mL Serologische Pipetten Corning 4488
Proteinkonzentratoren PES, 3K MWCO, 0,5 mLLoch88512
352196

Referenzen

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LeukozytenisolationZellen der MuttermilchDurchflusszytometrieCD45 MarkerZellw scheZentrifugationFluoreszenz BeadsViabilit tsf rbung
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