Isolierung von Leukozyten aus menschlicher Muttermilch zur Verwendung in einem antikörperabhängigen zellulären Phagozytose-Assay von HIV-Zielen

Muttermilch (BM) besteht aus mütterlichen Zellen, die >90% lebensfähig sind¹. Die Zellzusammensetzung wird stark durch das Stadium der Stillzeit, den Gesundheitszustand von Mutter und Kind und die individuelle Variation beeinflusst, die nach wie vor wenig verstanden wird^1,2,3,4. Da BM 10³€10⁵ Leukozyten/ml enthält, kann geschätzt werden, dass gestillte Säuglinge täglich 10⁵x 10⁸ mütterliche Leukozyten^einnehmen. Verschiedene In-vivo-Studien haben gezeigt, dass mütterliche Leukozyten dem Säugling eine kritische Immunität bieten und weit über diese Orte der Erstaufnahme hinaus funktionieren^{5,6,7,8 ,9,10,11}. Alle mütterlich abgeleiteten Zellen, die vom Säugling aufgenommen werden, haben das Potenzial, Nebenfunktionen neben dem Säugling samt Leukozyten auszuführen oder zu kompensieren¹².

Die Mutter-Kind-Übertragung (MTCT) des humanen Immundefizienzvirus (HIV) bleibt in ressourcenbegrenzten Ländern eine Krise. Da Durchfall- und Atemwegserkrankungen für eine erhebliche Sterblichkeitsrate bei Säuglingen in ressourcenbegrenzten Ländern verantwortlich sind und diese Krankheiten durch exklusives Stillen deutlich reduziert werden, sind die Vorteile für HIV-infizierte Mütter von Stillen weit überwiegt die Risiken^13,14,15. Sofern der Zugang zu sauberem Wasser und geeigneter Säuglingsnahrung nicht zuverlässig ist, empfiehlt die WHO für HIV-infizierte Mütter¹⁶keine Einstellung des Stillens. Jährlich treten ca. 100.000 MTCTs über BM auf; doch, nur 15% der Säuglinge gestillt von ihren HIV-infizierten Müttern infiziert, was auf eine starke Schutzwirkung von BM^17,18,^19,20,21. Zahlreiche Faktoren arbeiten wahrscheinlich im Tandem, um eine Übertragung zu verhindern. Wichtig ist, dass HIV-spezifische Antikörper (Abs) in BM mit reduziertem MTCT und/oder reduziertem Tod von Säuglingen durch HIV-Infektion korreliert wurden^22,23. Weitgehend unklar bleibt der Beitrag des zellulären Anteils von BM zu seinen antiviralen Qualitäten.

Viele Abs ermöglichen eine Vielzahl antiviraler Aktivitäten, die durch die "konstante" Region des Immunglobulinmoleküls, das kristallisierbare Fragment (Fc), über die Interaktion mit Fc-Rezeptoren (FcRs) vermittelt werden, die auf praktisch allen angeborenen Immunzellen gefunden werden, von denen praktisch alle finden sie in human BM²⁴. Die antikörperabhängige zelluläre Phagozytose (ADCP) wurde als notwendig für die Clearance von Virusinfektionen nachgewiesen und im Falle der Prävention von MTCT von HIV^{25,26,27, 28 , 29}. Angesichts des Mangels an Wissen über den potenziellen Beitrag der ADCP-Aktivität durch BM-Phagozyten zur Prävention von MTCT von HIV, wollten wir eine strenge Methode entwickeln, um Zellen aus menschlichen BM zu isolieren, um eine Studie über ADCP durchzuführen, die von Zellen aus BM in verschiedenen Stadien der Laktation erhalten.

Jeder Teilnehmer an dieser Studie wurde in Übereinstimmung mit der Zustimmung des Ethik- und Institutionellen Prüfungsausschusses (IRB) mit der Anleitung und Genehmigung des Mount Sinai Program for the Protection of Human Subjects (PPHS) unter Verwendung eines Von IRB zugelassenen Programms für menschliche Subjekte (PPHS) rekrutiert und interviewt. für die Gewinnung von Muttermilchproben.

1. Ziel Mikrosphäre nerische Vorbereitung

1. Wählen Sie ein relevantes Zielantigen aus.
   HINWEIS: In diesem Beispiel wurde das rekombinante Protein V1V2-2F5K verwendet, das entwickelt wurde, um die trimerische Spitze der nativen HIV-Hüllkurve³⁰nachzuahmen.
2. Biotinylierung mit einem kommerziellen Kit (Tabelle der Materialien) nach dem Herstellerprotokoll durchführen.
   1. Berechnen Sie mmol des Biotin-Reagenzes, um die Reaktion für einen 5-fachen Molüberschuss mit der Formel hinzuzufügen: mmol biotin = mL Protein x (mg Protein/mL Protein) x (mmol biotin/mg protein) x (5 mmol biotin/mmol protein)^30,31. Berechnen Sie dann die L des Biotin-Reagenzes, das sie nach der Formel hinzufügen: "L biotin = mmol biotin x "1.000.000 l/L) x (L/10 mmol).
   2. Biotin vor dem Öffnen auf Raumtemperatur ausstellen. Auflösen Sie Dasprotein in 0,5 bis 2,0 ml Phosphatgepufferter Saline (PBS) nach der oben durchgeführten Berechnung.
   3. Bereiten Sie eine 10 mM Lösung des Biotinreagenzes in Dimethylsulfoxid (DMSO) vor und fügen Sie der Proteinlösung das entsprechende Volumen von 10 mM Biotinreagenz hinzu und inkubieren Sie die Reaktion auf Eis für 2 h oder bei Raumtemperatur 30 min.
3. Überschüssiges Biotin mit Proteinkonzentratoren (Polyethersulfon [PES]-Membranen, 3 kDa Molekulargewichtsabschaltung [MWCO], 0,5 ml entfernen; Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   1. Legen Sie die Probe in die obere Kammer der Spinsäule ein und fügen Sie PBS bis zu 400 l. Kappe hinzu, und legen Sie diese Probenkammer dann in ein Sammelrohr ein. Zentrifuge bei 12.000 x g bei Raumtemperatur für 30 min.
   2. Durchfluss durchlassen und PBS zu 400 l hinzufügen. Zentrifugation wiederholen. Durchfluss durchlassen und PBS zu 100 l hinzufügen. Messen Sie die Proteinkonzentration durch ein Spektralphotometer.
      HINWEIS: Protein kann bei -80 °C eingefroren werden, bis es verwendet wird.

2. Antikörper-abhängige zelluläre Phagozytose (ADCP) Assay Plate Preparation

1. Konjugieren Sie biotinyliertes Protein zu 1 m Mikrosphären ("Perlen"; Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   1. Pro Teller konjugierter Perlen 6 g Protein mit 12 l Stockperlen in 200 l 0,1% Rinderserumalbumin (BSA)-PBS bei Raumtemperatur für 1 h inkubieren und alle 20 min sanft wirbeln.
   2. Zentrifuge bei 13.000 x g für 5 min. Überstand entsorgen, sanft wirbeln und in 1200 l mit 0,1% BSA-PBS wieder aufsetzen. Wiederholen Sie Spin und waschen Schritt 2x. Resuspend in 1200 l von 0,1% BSA-PBS.
2. Aliquot 10 l Perlenlösung pro Brunnen in einer runden 96-Well-Platte. Bereiten Sie Verdünnungen von Antikörpern oder Immunseren von Interesse in 12 l von 2% HSA HBSS, in der Regel beginnend bei 50 g/ml Antikörper oder einer 1/100 Serumverdünnung.
   HINWEIS: In den Probendaten wurde monoklonaler Antikörper (mAb) 830A verwendet.
3. 10 L titrierter Antikörper/Sera auf die Perlenplatte geben und 2 h bei 37 °C brüten. Fügen Sie jedem Brunnen 200 l von 2% HSA HBSS und zentrifugenplatte bei 2.000 x g für 10 min hinzu.
4. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig durch ein schnelles Umkippen und Dekantieren von Flüssigkeit aus den Plattenbrunnen in eine Spüle, um das unsichtbare Perlenpellet nicht zu stören.

3. Isolierung der Muttermilchzellen

1. Erhalten Sie Muttermilch von gesunden laktierenden Frauen, ausgedrückt mit doppelten elektronischen oder manuellen Pumpen. Isolieren Sie Zellen innerhalb von 4 h expression, wobei Die Milch bei Raumtemperatur gehalten wird.
2. Mit 50 ml Tuben Zentrifuge 50 ml Milch bei 800 x g für 15 min. Vorsichtig die Magermilch und Fett abgießen, während das Zellpellet ungestört bleibt. Wischen Sie die Innenseite des Rohres mit einem fusselfreien Wisch, um das gesamte Fett aus der Rohrwand zu entfernen.
3. Fügen Sie 10 ml 2% humanes Serumalbumen in Hanks ausgewogene Salzlösung hinzu (2% HSA HBSS [ohne Ca²⁺ oder Mg⁺]). Setzen Sie das Pellet durch sanftes Pipettieren wieder auf, um Zellaktivierung und Apoptose zu vermeiden. 10 min in ein 15 ml Rohr und eine Zentrifuge bei 450 x g übertragen.
4. Überstand abgießen und Schritt 1.3 wiederholen. Dann, sanft resuspendieren Zellen in 1-2 ml von 2% HSA HBSS in Abhängigkeit von der erwarteten Zellzahl, und zählen Zellen durch ein Hämozytometer oder einen automatisierten Zellzähler, beachten Sie auch die Zelllebensfähigkeit.

4. ADCP-Test

HINWEIS: Die hier beschriebenen Methoden sind von Ackerman et al.³²angepasst.

1. Fügen Sie 50.000 frisch isolierte BM-Zellen zu jeder ADCP-Assayplatte gut in 200 l von 2% HSA-HBSS hinzu. 2 h bei 37 °C inkubieren.
   1. Für Kontrollexperimente vorinkubierten Zellen bei 37 °C mit 10 g/ml-Aktininhibitor (Cytochalasin-D), 50 g/ml FcR-Blockiermittel (FcBlock) oder eine Kombination aus beidem vor deren Zugabe zu den Platten.
2. Zentrifugenplatte bei 930 x g für 10 min. Fügen Sie 200 l von 2% HSA HBSS und Wiederholungzentrifugation hinzu. Entfernen Sie überstand vorsichtig wie in Schritt 2.7 und wiederholen Sie die Wäsche.
3. Entfernen Sie vorsichtig Überstand- und Fleckenzellen für die Lebensfähigkeit mit 0,5 g/ml (Endkonzentration) fixierbaren Lebensfähigkeitsfleck 450 pro Bohrung in 50 l von 2% HSA HBSS. 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln bebrüten. Zentrifugenplatte bei 930 x g für 10 min und entfernen Überstand wie in Schritt 2.7. Fügen Sie 200 l von 2% HSA HBSS und Zentrifugenplatte wieder hinzu, gefolgt von der Entfernung von Überstand wie in Schritt 2.7.
4. Nach der Lebensfähigkeitsfärbung, Fleckenzellen für Leukozytenmarker von Interesse, minimal einschließlich eines CD45-spezifischen Flecks wie PE-Maus Anti-Human CD45 (Klon HI30) in einer optimierten Konzentration (1 g / l in 50 l von 1% BSA HBSS in den Beispieldaten).
   HINWEIS: Alle linienspezifischen Markierungen können einbezogen werden.
5. 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln bebrüten. Zentrifugenplatte bei 930 x g für 10 min und entfernen Überstand wie in Schritt 2.7. Fügen Sie 200 L von 1% BSA HBSS und Wiederholungzentrifugation hinzu. Entfernen Sie Überstand. Fixzellen in 200 l von 0,5% Formaldehyd im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 min oder über Nacht bei 4 °C. Kühlen Sie im Dunkeln bis zur Analyse.

5. Analyse durch Durchflusszytometrie

1. Führen Sie anfängliches Gating durch, um Doublets auf einem Vorwärtsstreuungsdiagramm (FSC) und Einem SSC-Plot (Material kleiner als FSC = 5000) zu eliminieren (siehe Abbildung 1). Verwenden Sie ein SSC vs. Lebensfähigkeitsfleck (in diesem Fall V450), um abgestorbene Zellen zu beseitigen (solche, die positiv für den Lebensfähigkeitsfleck sind).
2. Verwenden Sie ein SSC vs. CD45-Diagramm, um die wichtigsten Leukozytenklassen (Granulozyten, Monozyten, Lymphozyten) zu unterscheiden, wie ausführlich beschrieben^33,34.
   HINWEIS: Diese Klassifizierung ist nur suggestiv und linienspezifische Marker sind erforderlich, um den Zelltyp zu bestätigen.
3. Für alle CD45+-Zellen oder für jede Leukozyten-Teilmenge von Interesse messen SIE die ADCP-Aktivität, indem sie mit einem Marker auf den Perlen-positiven Zellen in einem Histogramm des Fluoresceinisothiocyanat(FITC)-Kanals, in dem die fluoreszierenden Perlen nachgewiesen werden, gegatingt werden.
   HINWEIS: Die negativen Kontrollbrunnen, in denen keine Perlen hinzugefügt wurden, zeigen an, wo die Perlen-positiven Zellen im Histogramm sichtbar sind und wo daher der Gating-Marker platziert werden soll.
4. Berechnen Sie ADCP-Werte als (mediane Fluoreszenzintensität [MFI] von Perlen-positiven Zellen) x (% der gesamten CD45 + Zellen in der positiven Population). Verwenden Sie Grafiksoftware, um Partituren bei jeder Ab/Serum-Konzentration zu zeichnen und eine AUC-Analyse (Area-under-the-curve) durchzuführen.
   HINWEIS: ADCP gilt als positiv, wenn die AUC größer als die 3x Standardabweichung des ADCP-Scores AUC eines unspezifischen Negativkontroll-mAb ist (in diesem Fall 3865).

Milch kann bei Raumtemperatur oder kühler (wenn auch nicht gefroren) aufbewahrt werden; Da wir jedoch eine verminderte Lebensfähigkeit beobachtet haben, wenn Milch sehr kalt gehalten wurde (Daten nicht gezeigt), und dass es einfacher ist, kurz zu sammeln, zu lagern und bei Umgebungstemperaturen zu transportieren, wird empfohlen, Proben nicht zu kühlen, um Beispiel-zu-Probe-Variabilität. In Milch, die 7 bis 183 Tage nach der Partumato erhalten wurde, lag die durch den automatisierten Zellzähler ermittelte Zellkonzentration zwischen 16.083 und 222.857 Zellen/ml. Abbildung 1 zeigt die Gating-Strategie zur Eliminierung von Doublets, Schutt und abgestorbenen Zellen. Die Lebensfähigkeit lag bei 90 bis 99 %. Etwa 1,6 bis 12,3 % aller lebenden Zellen waren CD45+ Leukozyten (Tabelle 1). Die meisten angeblichen Monozyten schienen Vorläufer/unreife Zellen zu sein, wie zuvor beschrieben, basierend auf dem suggestiven SSC vs. CD45 gating34. Die angeblichen Monozyten wurden als SSCLow-Intermediate/CD45lowdefiniert, obwohl nur wenige die höheren CD45-Färbungen aufwiesen, die sich von der angeblichen Lymphozytenpopulation (SSClow/CD45low)unterschieden. mit Blutmonozyten assoziiert (Abbildung 1), ähnlich wie frühere Studien33,34. Die angeblichen Granulozyten wurden als SSChigh/CD45intermediate33,34 ( Tabelle1) definiert. Beachten Sie, dass diese Klassifizierung nur suggestiv ist und dass linienspezifische Marker erforderlich wären, um den Zelltyp zu bestätigen.

Die ADCP-Aktivität der frisch isolierten BM-Zellen wurde mit dem HIV-spezifischen Human mAb 830A gemessen, der spezifisch für die V2-Region der HIV-Hüllkurve ist und an das hier getestete V1V2-2F5K-Antigen bindet. Die ADCP-Aktivität wurde hier anhand von Milch gemessen, die nach der Partumuma 1 Monat erhalten wurde (Abbildung 2A). Beispieldaten zeigen die erwarteten FITC-Histogramme (bead+), die beim Gating auf CD45+ Zellen gesehen werden (Daten, die mit 1 g/ml mAb generiert werden, werden angezeigt). Die schwarzen Markierungen geben die Populationen an, die zur Berechnung der ADCP-Werte verwendet werden. In der Stichprobe 830A Daten (erstes Panel von Abbildung 2A), Prozentsatz der CD45+ Zellen und mittlere Fluoreszenz dieser Grundgesamtheit werden gezeigt, die verwendet wurden, um den ADCP-Score mit der Gleichung in Schritt 3.4 zu berechnen. Zellen, die vor ihrer Inkubation mit den Ab-gebundenen/antigengekoppelten Perlen mit dem Actin-Inhibitor Cytochalasin-D (CytoD) und/oder FcR-blockierenden Abs (FcBlock) vorihrer Inkubation mit den Ab-gebundenen/antigengekoppelten Perlen vorgeschaltet wurden, zeigten ADCP adCP-Aktivität auf der Ebene der Kontrolle mAb 3865 oder darunter, was darauf hindeutet, dass ADCP FcR war. und actin-abhängig (Abbildung 2). Der ADCP-Wert, der für die Gesamt-CD45+-Zellen ermittelt wurde, lag 25-mal über den Hintergrundwerten, die mit dem negativen Kontrollanti-Anthrax mAb 3865 definiert wurden. Jede Hauptteilmenge wurde ebenfalls separat analysiert. Die angeblichen Granulozyten wiesen adCP-Aktivität auf, die um das 12-29-fache höher war als der Hintergrund. Der angebliche Monozyten ADCP lag 2-fach über dem Hintergrund(Abbildung 2). Die angeblichen Lymphozyten zeigten wie erwartet keine messbare ADCP-Aktivität (weniger als die 3x Standardabweichung des ADCP-Scores AUC der unspezifischen Negativkontrolle mAb 3865; Daten nicht dargestellt).

Abbildung 1: Probenflusszytometriedaten von Zellen, die aus der Muttermilch isoliert sind. Die Zellen wurden wie im Protokoll beschrieben verarbeitet und gefärbt. (A) Einzelne Zellen wurden angezäut, um Doublets in einem FSC-H vs. FSC-A-Plot wie gezeigt zu eliminieren, auch die kleinen Trümmer <5.000 in FSC-A herauszukleben. (B) Diese Population wurde verwendet, um auf lebenden Zellen (die nicht mit dem Lebensfähigkeitsfarbstoff färben) in einem SSC vs. V450 (Lebensfähigkeitfleck) Diagramm zu gate. (C) Diese lebenden Zellen wurden in einem FSC vs. SSC-Plot verwendet. Die erwartete Position von Nicht-Leukozyten, die wahrscheinlich überwiegend Brustepithelzellen sind, wird hervorgehoben ("E"). (D) Das gleiche FSC vs. SSC-Diagramm wird nur mit CD45+ Zellen angezeigt. Die wichtigsten leukozyten-Teilmengen sind nur angebliche Identitäten, die auf etablierten und erwarteten SSC-Parametern basieren (G = Granulozyten; M = Monozyten; L = Lymphozyten). (E) Lebensfähige Zellen wurden für ein SSC vs. CD45-Diagramm mit den wichtigsten Leukozyten-Teilmengen verwendet. Zurück-Gating aus diesem Diagramm ergab die Daten in Panel D gezeigt. Beachten Sie, dass diese Klassifizierung ist nur suggestiv und dass Linie-spezifische Marker sind erforderlich, um Zelltyp zu bestätigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Beispiel ADCP-Daten unter Verwendung von Zellen, die aus der Muttermilch isoliert sind. Der adCP-Assay basiert auf dem von Ackerman et al.30adaptierten Assay. Der Test wurde wie im obigen Protokoll beschrieben durchgeführt. (A) Beispiel-FITC-Histogramme bei 1 g/ml mAb, wobei Marker die Perlen-/FITC+-Populationen angeben, die zur Bestimmung des ADCP-Scores verwendet werden. Die Werte wurden als (MFI von Perlen-positiven Zellen) x (% der gesamten CD45+ Zellen in der Bead/FITC+ positiven Population) berechnet. Das erste Panel, das mAb 830A allein verwendet, gibt auch den Prozentsatz der gesamten CD45+ Zellen und den mittleren Fluoreszenzintensitätswert an, der zur Berechnung des ADCP-Scores in diesem Beispiel verwendet wird. (B) ADCP-Werte bei jedem mAb-Verdünnungstest wurden zur Berechnung von AUC-Werten (Area-under-the-curve) in Grafiksoftware verwendet. Für Kontrollexperimente wurden der Aktin-Inhibitor Cytochalasin-D (CytoD), das FcR-Blockierungsmittel (FcBlock) oder eine Kombination beider vorderinkubiert mit Zellen vor ihrer Zugabe zu den Immunkomplexen (siehe Legenden). Beachten Sie, dass diese Zellklassifizierung nur suggestiv ist und dass linienspezifische Marker erforderlich sind, um den Zelltyp zu bestätigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Beispiele für typische Anzahl und Eigenschaften von Muttermilchzellen.

Die Autoren haben nichts zu verraten.