Name: Isolierung von Leukozyten aus menschlicher Muttermilch zur Verwendung in einem antikörperabhängigen zellulären Phagozytose-Assay von HIV-Zielen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung von Leukozyten aus menschlicher Muttermilch zur Untersuchung der antikörperabhängigen zellulären Phagozytose gegen HIV-Ziele. Diese Methode ermöglicht die effiziente Analyse immunologischer Schutzmechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken Dr. Susan Zolla-Pazner in der Abteilung für Medizin und Abteilung für Mikrobiologie an der Icahn School of Medicine am Berg Sinai für die Manuskriptüberprüfung. Das NIH/NICHD stellte Mittel für dieses Projekt unter der Fördernummer R21 HD095772-01A1 bereit. Darüber hinaus wurde R. Powell durch Mittel des Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Icahn School of Medicine am Mount Sinai unterstützt.

Jeder Teilnehmer an dieser Studie wurde in Übereinstimmung mit der Zustimmung des Ethik- und Institutionellen Prüfungsausschusses (IRB) mit der Anleitung und Genehmigung des Mount Sinai Program for the Protection of Human Subjects (PPHS) unter Verwendung eines Von IRB zugelassenen Programms für menschliche Subjekte (PPHS) rekrutiert und interviewt. für die Gewinnung von Muttermilchproben.
1. Ziel Mikrosphäre nerische Vorbereitung
<ol><li>Wählen Sie ein relevantes Zielantigen aus. HINWEIS: In diesem Beispiel wurde das rekombinante Protein V1V2-2F5K verwendet, das entwickelt wurde, um die trimerische Spitze der nativen HIV-Hüllkurve30nachzuahmen.</li>
	<li>Biotinylierung mit einem kommerziellen Kit (Tabelle der Materialien) nach dem Herstellerprotokoll durchführen.<ol>
<li>Berechnen Sie mmol des Biotin-Reagenzes, um die Reaktion für einen 5-fachen Molüberschuss mit der Formel hinzuzufügen: mmol biotin = mL Protein x (mg Protein/mL Protein) x (mmol biotin/mg protein) x (5 mmol biotin/mmol protein)30,31. Berechnen Sie dann die L des Biotin-Reagenzes, das sie nach der Formel hinzufügen: "L biotin = mmol biotin x "1.000.000 l/L) x (L/10 mmol).</li>
		<li>Biotin vor dem Öffnen auf Raumtemperatur ausstellen. Auflösen Sie Dasprotein in 0,5 bis 2,0 ml Phosphatgepufferter Saline (PBS) nach der oben durchgeführten Berechnung.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 10 mM Lösung des Biotinreagenzes in Dimethylsulfoxid (DMSO) vor und fügen Sie der Proteinlösung das entsprechende Volumen von 10 mM Biotinreagenz hinzu und inkubieren Sie die Reaktion auf Eis für 2 h oder bei Raumtemperatur 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Überschüssiges Biotin mit Proteinkonzentratoren (Polyethersulfon [PES]-Membranen, 3 kDa Molekulargewichtsabschaltung [MWCO], 0,5 ml entfernen; Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.<ol>
<li>Legen Sie die Probe in die obere Kammer der Spinsäule ein und fügen Sie PBS bis zu 400 l. Kappe hinzu, und legen Sie diese Probenkammer dann in ein Sammelrohr ein. Zentrifuge bei 12.000 x g bei Raumtemperatur für 30 min.</li>
		<li>Durchfluss durchlassen und PBS zu 400 l hinzufügen. Zentrifugation wiederholen. Durchfluss durchlassen und PBS zu 100 l hinzufügen. Messen Sie die Proteinkonzentration durch ein Spektralphotometer. HINWEIS: Protein kann bei -80 °C eingefroren werden, bis es verwendet wird.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Antikörper-abhängige zelluläre Phagozytose (ADCP) Assay Plate Preparation
<ol><li>Konjugieren Sie biotinyliertes Protein zu 1 m Mikrosphären ("Perlen"; Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.<ol>
<li>Pro Teller konjugierter Perlen 6 g Protein mit 12 l Stockperlen in 200 l 0,1% Rinderserumalbumin (BSA)-PBS bei Raumtemperatur für 1 h inkubieren und alle 20 min sanft wirbeln.</li>
		<li>Zentrifuge bei 13.000 x g für 5 min. Überstand entsorgen, sanft wirbeln und in 1200 l mit 0,1% BSA-PBS wieder aufsetzen. Wiederholen Sie Spin und waschen Schritt 2x. Resuspend in 1200 l von 0,1% BSA-PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aliquot 10 l Perlenlösung pro Brunnen in einer runden 96-Well-Platte. Bereiten Sie Verdünnungen von Antikörpern oder Immunseren von Interesse in 12 l von 2% HSA HBSS, in der Regel beginnend bei 50 g/ml Antikörper oder einer 1/100 Serumverdünnung. HINWEIS: In den Probendaten wurde monoklonaler Antikörper (mAb) 830A verwendet.</li>
	<li>10 L titrierter Antikörper/Sera auf die Perlenplatte geben und 2 h bei 37 °C brüten. Fügen Sie jedem Brunnen 200 l von 2% HSA HBSS und zentrifugenplatte bei 2.000 x g für 10 min hinzu.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand vorsichtig durch ein schnelles Umkippen und Dekantieren von Flüssigkeit aus den Plattenbrunnen in eine Spüle, um das unsichtbare Perlenpellet nicht zu stören.</li>
</ol>3. Isolierung der Muttermilchzellen
<ol><li>Erhalten Sie Muttermilch von gesunden laktierenden Frauen, ausgedrückt mit doppelten elektronischen oder manuellen Pumpen. Isolieren Sie Zellen innerhalb von 4 h expression, wobei Die Milch bei Raumtemperatur gehalten wird.</li>
	<li>Mit 50 ml Tuben Zentrifuge 50 ml Milch bei 800 x g für 15 min. Vorsichtig die Magermilch und Fett abgießen, während das Zellpellet ungestört bleibt. Wischen Sie die Innenseite des Rohres mit einem fusselfreien Wisch, um das gesamte Fett aus der Rohrwand zu entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie 10 ml 2% humanes Serumalbumen in Hanks ausgewogene Salzlösung hinzu (2% HSA HBSS [ohne Ca2+ oder Mg+]). Setzen Sie das Pellet durch sanftes Pipettieren wieder auf, um Zellaktivierung und Apoptose zu vermeiden. 10 min in ein 15 ml Rohr und eine Zentrifuge bei 450 x g übertragen.</li>
	<li>Überstand abgießen und Schritt 1.3 wiederholen. Dann, sanft resuspendieren Zellen in 1-2 ml von 2% HSA HBSS in Abhängigkeit von der erwarteten Zellzahl, und zählen Zellen durch ein Hämozytometer oder einen automatisierten Zellzähler, beachten Sie auch die Zelllebensfähigkeit.</li>
</ol>4. ADCP-Test
HINWEIS: Die hier beschriebenen Methoden sind von Ackerman et al.32angepasst.
<ol><li>Fügen Sie 50.000 frisch isolierte BM-Zellen zu jeder ADCP-Assayplatte gut in 200 l von 2% HSA-HBSS hinzu. 2 h bei 37 °C inkubieren.<ol>
<li>Für Kontrollexperimente vorinkubierten Zellen bei 37 °C mit 10 g/ml-Aktininhibitor (Cytochalasin-D), 50 g/ml FcR-Blockiermittel (FcBlock) oder eine Kombination aus beidem vor deren Zugabe zu den Platten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zentrifugenplatte bei 930 x g für 10 min. Fügen Sie 200 l von 2% HSA HBSS und Wiederholungzentrifugation hinzu. Entfernen Sie überstand vorsichtig wie in Schritt 2.7 und wiederholen Sie die Wäsche.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig Überstand- und Fleckenzellen für die Lebensfähigkeit mit 0,5 g/ml (Endkonzentration) fixierbaren Lebensfähigkeitsfleck 450 pro Bohrung in 50 l von 2% HSA HBSS. 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln bebrüten. Zentrifugenplatte bei 930 x g für 10 min und entfernen Überstand wie in Schritt 2.7. Fügen Sie 200 l von 2% HSA HBSS und Zentrifugenplatte wieder hinzu, gefolgt von der Entfernung von Überstand wie in Schritt 2.7.</li>
	<li>Nach der Lebensfähigkeitsfärbung, Fleckenzellen für Leukozytenmarker von Interesse, minimal einschließlich eines CD45-spezifischen Flecks wie PE-Maus Anti-Human CD45 (Klon HI30) in einer optimierten Konzentration (1 g / l in 50 l von 1% BSA HBSS in den Beispieldaten). HINWEIS: Alle linienspezifischen Markierungen können einbezogen werden.</li>
	<li>20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln bebrüten. Zentrifugenplatte bei 930 x g für 10 min und entfernen Überstand wie in Schritt 2.7. Fügen Sie 200 L von 1% BSA HBSS und Wiederholungzentrifugation hinzu. Entfernen Sie Überstand. Fixzellen in 200 l von 0,5% Formaldehyd im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 min oder über Nacht bei 4 °C. Kühlen Sie im Dunkeln bis zur Analyse.</li>
</ol>5. Analyse durch Durchflusszytometrie
<ol><li>Führen Sie anfängliches Gating durch, um Doublets auf einem Vorwärtsstreuungsdiagramm (FSC) und Einem SSC-Plot (Material kleiner als FSC = 5000) zu eliminieren (siehe Abbildung 1). Verwenden Sie ein SSC vs. Lebensfähigkeitsfleck (in diesem Fall V450), um abgestorbene Zellen zu beseitigen (solche, die positiv für den Lebensfähigkeitsfleck sind).</li>
	<li>Verwenden Sie ein SSC vs. CD45-Diagramm, um die wichtigsten Leukozytenklassen (Granulozyten, Monozyten, Lymphozyten) zu unterscheiden, wie ausführlich beschrieben33,34. HINWEIS: Diese Klassifizierung ist nur suggestiv und linienspezifische Marker sind erforderlich, um den Zelltyp zu bestätigen.</li>
	<li>Für alle CD45+-Zellen oder für jede Leukozyten-Teilmenge von Interesse messen SIE die ADCP-Aktivität, indem sie mit einem Marker auf den Perlen-positiven Zellen in einem Histogramm des Fluoresceinisothiocyanat(FITC)-Kanals, in dem die fluoreszierenden Perlen nachgewiesen werden, gegatingt werden. HINWEIS: Die negativen Kontrollbrunnen, in denen keine Perlen hinzugefügt wurden, zeigen an, wo die Perlen-positiven Zellen im Histogramm sichtbar sind und wo daher der Gating-Marker platziert werden soll.</li>
	<li>Berechnen Sie ADCP-Werte als (mediane Fluoreszenzintensität [MFI] von Perlen-positiven Zellen) x (% der gesamten CD45 + Zellen in der positiven Population). Verwenden Sie Grafiksoftware, um Partituren bei jeder Ab/Serum-Konzentration zu zeichnen und eine AUC-Analyse (Area-under-the-curve) durchzuführen. HINWEIS: ADCP gilt als positiv, wenn die AUC größer als die 3x Standardabweichung des ADCP-Scores AUC eines unspezifischen Negativkontroll-mAb ist (in diesem Fall 3865).</li>
</ol>

<ol><li>Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+in+human+milk%3A+state+of+the+science%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Human+Lactation%22%5BJournal%5D)">Cells in human milk: state of the science.</a> Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).</li>
<li>Lonnerdal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+and+physiologic+significance+of+human+milk+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Nutritional and physiologic significance of human milk proteins.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).</li>
<li>Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+maternal+diet+and+body+composition+on+lactational+performance%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Effect of maternal diet and body composition on lactational performance.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).</li>
<li>Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+milk+volume+and+composition+during+late+lactation+%287-20+months%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months).</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).</li>
<li>Hassiotou, F., Geddes, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell-mediated+protection+of+the+mammary+gland+and+the+infant+during+breastfeeding%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding.</a> Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).</li>
<li>Hanson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mother-offspring+dyad+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Paediatrica%22%5BJournal%5D)">The mother-offspring dyad and the immune system.</a> Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).</li>
<li>Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+and+memory+T+lymphocytes+in+human+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Activated and memory T lymphocytes in human milk.</a> Cytometry. 13 (3), 282-290 (1992).</li>
<li>Jain, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+distribution+of+human+milk+leucocytes+after+ingestion+by+newborn+baboons%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Disease+in+Childhood%22%5BJournal%5D)">In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons.</a> Archives of Disease in Childhood. 64 (7 Spec No), 930-933 (1989).</li>
<li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+independent+pathways+of+maternal+cell+transmission+to+offspring%3A+through+placenta+during+pregnancy+and+by+breast-feeding+after+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth.</a> Immunology. 101 (4), 570-580 (2000).</li>
<li>Tuboly, S., Bernath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+absorption+of+colostral+lymphoid+cells+in+newborn+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).</li>
<li>Cabinian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+Maternal+Immune+Cells+by+Breastfeeding%3A+Maternal+Cytotoxic+T+Lymphocytes+Present+in+Breast+Milk+Localize+in+the+Peyer%27s+Patches+of+the+Nursed+Infant%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer's Patches of the Nursed Infant.</a> PLoS ONE. 11 (6), e0156762(2016).</li>
<li>Filias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+ability+of+neutrophils+and+monocytes+in+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates.</a> BMC Pediatrics. 11, 29(2011).</li>
<li>Natchu, U. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exclusive+breastfeeding+reduces+risk+of+mortality+in+infants+up+to+6+mo+of+age+born+to+HIV-positive+Tanzanian+women%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).</li>
<li>Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+morbidity+between+breast-fed+and+formula-fed+infants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants.</a> The Journal of Pediatrics. 126 (5 Pt 1), 696-702 (1995).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+Study+Team+on+the+Role+of+Breastfeeding+on+the+Prevention+of+Infant+Mortality.+Effect+of+breastfeeding+on+infant+and+child+mortality+due+to+infectious+diseases+in+less+developed+countries%3A+a+pooled+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis.</a> Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updates+on+HIV+and+Infant+Feeding%3A+The+Duration+of+Breastfeeding%2C+and+Support+from+Health+Services+to+Improve+Feeding+Practices+Among+Mothers+Living+with+HIVWHO+Guidelines+Approved+by+the+Guidelines+Review+Committee%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee.</a> World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2016).</li>
<li>Nelson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+HIV-1+Envelope+Systemic+and+Mucosal+Immunization+of+Lactating+Rhesus+Monkeys+Induces+a+Robust+Immunoglobulin+A+Isotype+B+Cell+Response+in+Breast+Milk%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).</li>
<li>Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+the+risk+of+mother-to-child+human+immunodeficiency+virus+transmission%3A+past+successes%2C+current+progress+and+challenges%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+and+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).</li>
<li>Shen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mother-to-Child+HIV-1+Transmission+Events+Are+Differentially+Impacted+by+Breast+Milk+and+Its+Components+from+HIV-1-Infected+Women%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women.</a> PLoS ONE. 10 (12), e0145150(2015).</li>
<li>Fouda, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-specific+functional+antibody+responses+in+breast+milk+mirror+those+in+plasma+and+are+primarily+mediated+by+IgG+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies.</a> Journal of Virology. 85 (18), 9555-9567 (2011).</li>
<li>Van de Perre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+reservoirs+in+breast+milk+and+challenges+to+elimination+of+breast-feeding+transmission+of+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1.</a> Science Translational Medicine. 4 (143), 143sr143(2012).</li>
<li>Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passively+acquired+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+%28ADCC%29+activity+in+HIV-infected+infants+is+associated+with+reduced+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality.</a> Cell Host & Microbe. 17 (4), 500-506 (2015).</li>
<li>Pollara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+HIV-1+Envelope-Specific+Breast+Milk+IgA+Responses+with+Reduced+Risk+of+Postnatal+Mother-to-Child+Transmission+of+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1.</a> Journal of Virology. 89 (19), 9952-9961 (2015).</li>
<li>Ackerman, M., Nimmerjahn, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAckerman%2C+M+%22Antibody+Fc%22">Antibody Fc</a>. , Academic Press. Cambridge, MA. (2014).</li>
<li>Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+receptor-mediated+phagocytosis+makes+a+significant+contribution+to+clearance+of+influenza+virus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections.</a> Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).</li>
<li>Fujisawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+play+an+essential+role+in+cooperation+with+antibody+in+both+protection+against+and+recovery+from+pulmonary+infection+with+influenza+virus+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice.</a> Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).</li>
<li>Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+recognition+of+cell+surface-associated+NS1+triggers+Fc-gamma+receptor-mediated+phagocytosis+and+clearance+of+West+Nile+Virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells.</a> Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).</li>
<li>Yasui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+cells+contribute+to+the+antibody-mediated+elimination+of+pulmonary-infected+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus.</a> Virology. 454-455, 157-168 (2014).</li>
<li>Quattrocchi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+macrophages+in+early+protective+immune+responses+induced+by+two+vaccines+against+foot+and+mouth+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease.</a> Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).</li>
<li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust%2C+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationally+Designed+Immunogens+Targeting+HIV-1+gp120+V1V2+Induce+Distinct+Conformation-Specific+Antibody+Responses+in+Rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits.</a> Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).</li>
<li>Sanders, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+next-generation+cleaved%2C+soluble+HIV-1+Env+trimer%2C+BG505+SOSIP.664+gp140%2C+expresses+multiple+epitopes+for+broadly+neutralizing+but+not+non-neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies.</a> PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618(2013).</li>
<li>Im, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+quantitative+analysis+of+cluster+of+differentiation+45+antigen+expression+on+lymphocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22The+Korean+Journal+of+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets.</a> The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).</li>
<li>Trend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+Populations+in+Human+Preterm+and+Term+Breast+Milk+Identified+by+Multicolour+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135580(2015).</li>
<li>Buescher, E. S., McIlheran, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphonuclear+leukocytes+and+human+colostrum%3A+effects+of+in+vivo+and+in+vitro+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).</li>
<li>Franca, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colostral+phagocytes+eliminate+enterotoxigenic+Escherichia+coli+opsonized+by+colostrum+supernatant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%2C+Immunology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die hier beschriebene Strömungszytometrie-basierte Technik zur Messung der ADCP-Aktivität wurde erstmals 201130 beschrieben und hat sich seitdem als robust erwiesen und in mehr als 80 Studien zitiert. Das hier beschriebene Protokoll passt diese Technik erstmals für die Verwendung mit primären BM-Zellen an. Frühere Studien über die Fc-vermittelte Funktionalität durch BM-Zellen beschränkten sich weitgehend auf die Messung oxidativer Ausbrüche oder histologiebasierte Phagozytose-Assays mit Zellen, di...

Muttermilch (BM) besteht aus mütterlichen Zellen, die >90% lebensfähig sind1. Die Zellzusammensetzung wird stark durch das Stadium der Stillzeit, den Gesundheitszustand von Mutter und Kind und die individuelle Variation beeinflusst, die nach wie vor wenig verstanden wird1,2,3,4. Da BM 103€105 Leukozyten/ml enthält, kann geschätzt werden, dass gestillte Säuglinge täglich 105x 108 mütterliche Leukozyteneinnehmen. Verschiedene In-vivo-Studien haben gezeigt, dass mütterliche Leukozyten dem Säugling eine kritische Immunität bieten und weit über diese Orte der Erstaufnahme hinaus funktionieren5,6,7,8 ,9,10,11. Alle mütterlich abgeleiteten Zellen, die vom Säugling aufgenommen werden, haben das Potenzial, Nebenfunktionen neben dem Säugling samt Leukozyten auszuführen oder zu kompensieren12.
Die Mutter-Kind-Übertragung (MTCT) des humanen Immundefizienzvirus (HIV) bleibt in ressourcenbegrenzten Ländern eine Krise. Da Durchfall- und Atemwegserkrankungen für eine erhebliche Sterblichkeitsrate bei Säuglingen in ressourcenbegrenzten Ländern verantwortlich sind und diese Krankheiten durch exklusives Stillen deutlich reduziert werden, sind die Vorteile für HIV-infizierte Mütter von Stillen weit überwiegt die Risiken13,14,15. Sofern der Zugang zu sauberem Wasser und geeigneter Säuglingsnahrung nicht zuverlässig ist, empfiehlt die WHO für HIV-infizierte Mütter16keine Einstellung des Stillens. Jährlich treten ca. 100.000 MTCTs über BM auf; doch, nur 15% der Säuglinge gestillt von ihren HIV-infizierten Müttern infiziert, was auf eine starke Schutzwirkung von BM17,18,19,20,21. Zahlreiche Faktoren arbeiten wahrscheinlich im Tandem, um eine Übertragung zu verhindern. Wichtig ist, dass HIV-spezifische Antikörper (Abs) in BM mit reduziertem MTCT und/oder reduziertem Tod von Säuglingen durch HIV-Infektion korreliert wurden22,23. Weitgehend unklar bleibt der Beitrag des zellulären Anteils von BM zu seinen antiviralen Qualitäten.
Viele Abs ermöglichen eine Vielzahl antiviraler Aktivitäten, die durch die "konstante" Region des Immunglobulinmoleküls, das kristallisierbare Fragment (Fc), über die Interaktion mit Fc-Rezeptoren (FcRs) vermittelt werden, die auf praktisch allen angeborenen Immunzellen gefunden werden, von denen praktisch alle finden sie in human BM24. Die antikörperabhängige zelluläre Phagozytose (ADCP) wurde als notwendig für die Clearance von Virusinfektionen nachgewiesen und im Falle der Prävention von MTCT von HIV25,26,27, 28 , 29. Angesichts des Mangels an Wissen über den potenziellen Beitrag der ADCP-Aktivität durch BM-Phagozyten zur Prävention von MTCT von HIV, wollten wir eine strenge Methode entwickeln, um Zellen aus menschlichen BM zu isolieren, um eine Studie über ADCP durchzuführen, die von Zellen aus BM in verschiedenen Stadien der Laktation erhalten.

<table><tbody><tr><td>1 & Mikro; m FluoSpheres NeutrAvidin-markierte Mikrosphären&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>F8776</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen PE Maus Anti-Human CD45</td><td>BD</td><td>560975</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>MP Biomedicals</td><td>8810025</td><td></td></tr><tr><td>Corning V-Boden Polystyrol 96-Well-Platte&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3894</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin D</td><td>Sigma</td><td>22144-77-0</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin Kit&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>21338</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Konische Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>352196</tr><tr><td>Falcon 50 mL konische Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning&nbsp;</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Fixierbarer Viability Stain 450&nbsp;</td><td>BD</td><td>562247</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehydlösung</td><td>Sigma</td><td>252549&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HBSS ohne Calcium, Magnesium oder Phenol Red</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Human BD Fc Block</td><td>BD</td><td>564219</td><td></td></tr><tr><td>Human Serum Albumin</td><td>MP Biomedicals</td><td>2191349</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td><td>Kimberly-Clark Professional&nbsp;</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x pH 7,4</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol 10 mL Serologische Pipetten&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Proteinkonzentratoren PES, 3K MWCO, 0,5 mL</td><td>Loch</td><td>88512</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von leukozyten aus menschlicher muttermilch zur verwendung in einem antikörperabhängigen zellulären phagozytose-assay von hiv-zielen

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Selbst in Ermangelung antiretroviraler Medikamente werden nur 15 % der Säuglinge infiziert, die von HIV-infizierten Müttern gestillt werden, was auf eine starke schützende Wirkung der Muttermilch (BM) hindeutet. Sofern der Zugang zu sauberem Wasser und geeigneter Säuglingsnahrung nicht zuverlässig ist, empfiehlt die WHO für HIV-infizierte Mütter keine Einstellung des Stillens. Zahlreiche Faktoren arbeiten wahrscheinlich zusammen, um die BM-Übertragung zu reduzieren. Gestillte Säuglinge nehmen täglich 105bis 108 mütterliche Leukozyten auf, was jedoch weitgehend unklar bleibt, ist der Beitrag dieser Zellen zu den antiviralen Qualitäten von BM. Antikörperabhängige zelluläre Phagozytose (ADCP), eine der essentiellen und durchdringendsten angeborenen Immunantworten, durch BM-Phagozyten gegen HIV-Ziele. Die Zellen wurden aus 5 menschlichen BM-Proben isoliert, die in verschiedenen Stadien der Laktation gewonnen wurden. Die Isolierung erfolgte durch sanfte Zentrifugation, gefolgt von einer sorgfältigen Entfernung von Milchfett und wiederholtem Waschen des Zellpellets. Fluoreszierende Perlen, die mit DEM Epitop hiv-hüllt waren, wurden als Ziele für die Analyse von ADCP verwendet. Die Zellen wurden mit dem CD45-Oberflächenmarker befleckt, um Leukozyten zu identifizieren. Es wurde festgestellt, dass die ADCP-Aktivität über Kontrollexperimenten signifikant war und reproduzierbar mit einem HIV-spezifischen Antikörper 830A messbar war.

Milch kann bei Raumtemperatur oder kühler (wenn auch nicht gefroren) aufbewahrt werden; Da wir jedoch eine verminderte Lebensfähigkeit beobachtet haben, wenn Milch sehr kalt gehalten wurde (Daten nicht gezeigt), und dass es einfacher ist, kurz zu sammeln, zu lagern und bei Umgebungstemperaturen zu transportieren, wird empfohlen, Proben nicht zu kühlen, um Beispiel-zu-Probe-Variabilität. In Milch, die 7 bis 183 Tage nach der Partumato erhalten wurde, lag die durch den automatisierten Zellz...

Muttermilch überträgt das humane Immundefizienzvirus (HIV), obwohl sich nur 15 % der säuglingsgestillten Säuglinge, die von HIV-infizierten Müttern gestillt werden, anstecken. Gestillte Säuglinge nehmen täglich 105bis 108 mütterliche Leukozyten auf, obwohl diese Zellen unteruntersucht sind. Hier beschreiben wir die Isolierung von Muttermilchleukozyten und eine Analyse ihrer phagozytischen Kapazität.

Isolierung von Leukozyten aus menschlicher Muttermilch zur Verwendung in einem antikörperabhängigen zellulären Phagozytose-Assay von HIV-Zielen

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Wir haben eine strenge Methode zur Isolierung von Zellen aus der Muttermilch entwickelt, um antikörperabhängige zelluläre Phagozytose (ADCP) durch Muttermilchphagozyten gegen HIV-Ziele zu untersuchen. Diese Technik erleichtert die relativ schnelle und einfache Isolierung von Muttermilchzellen, um die Fähigkeit von Leukozytenpopulationen zur Durchführung von ADCP zu bewerten. Demonstriert wird das Verfahren von Alisa Fox, einer Technikerin aus meinem Labor.Nach der Auswahl eines relevanten Zielantigens verwenden Sie ein kommerzielles Kit, um das Protein von Interesse gemäß dem Herstellerprotokoll zu biotinyn. Und legen Sie die biotinylierte Probe in die obere Kammer einer Spinsäule. Fügen Sie PBS bis zu 400 Mikroliter hinzu und verschließen Sie die Kammer, bevor Sie die Säule zur Zentrifugierung in ein Sammelrohr einsetzen.Nachdem Sie den Durchfluss verworfen haben, fügen Sie PBS zu 400 Mikrolitern für eine zweite Zentrifugation hinzu. Entsorgen Sie den Durchfluss, fügen Sie PBS zu 400 Mikroliterhinzulierung hinzu und messen Sie die Proteinkonzentration durch ein Spektralphotometer, um das biotinylierte Protein zu Mikrometer-Mikrosphären zu konjugieren. Inkubieren Sie sechs Mikrogramm Protein mit 12 Mikroliter n. B. Stockperlen in 200 Mikroliter PBS pro Platte konjugierter Perlen bei Raumtemperatur für zwei Stunden, wobei alle 20 Minuten sanft wirbelt.Am Ende der Inkubation, Pellet das Protein konjugierte Perlen durch Zentrifugation und entsorgen sie den Überstand. Nach sanftem Wirbeln das Protein in 1200 Mikrolitern 0,1%BSA in PBS wieder aufsetzen und das Rohr durch Zentrifugation noch zwei Mal waschen, wie gerade gezeigt. Nach der letzten Wäsche das Pellet in 1200 Mikrolitern in PBS plus BSA wieder aufsetzen.Um ADCP Assay Plates einzurichten, bereiten Sie zunächst 12 Mikroliter-Verdünnungen von Antikörpern oder dem Immunserum von Interesse in 2%BSA in PBS in einer runden unteren 96-Wellplatte vor. Fügen Sie 10 Mikroliter Protein konjugierte Perlen pro Brunnen auf den Teller für eine zweistündige Inkubation bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation 200 Mikroliter PBS plus BSA hinzufügen.Nach der Gewinnung von Muttermilch von gesunden laktierenden Frauen, die mit einer Pumpe ausdrücken, trennen Sie innerhalb von vier Stunden nach dem Ausdruck den Milchgehalt durch Zentrifugation und gießen Sie vorsichtig die Magermilch und das Fett ab, so dass das Zellpellet ungestört bleibt. Wischen Sie die Innenseite des Rohres mit einem fusselfreien Wisch, um das gesamte Fett aus der Rohrwand zu entfernen und 10 Milliliter PBS plus HSA hinzuzufügen. Setzen Sie das Pellet mit sanfter Pipettierung aus, um eine Zellaktivierung in der Apoptose zu vermeiden, und übertragen Sie die Zellsuspension zur Zentrifugation in ein 15-Milliliter-Rohr.Nach einer zweiten Wäsche in PBS plus HSA, wie gerade gezeigt, setzen Sie die Zellen vorsichtig in ein bis zwei Milliliter frische PBS plus HSA zum Zählen wieder ab. Für einen ADCP-Assay die vorbereitete ADCP-Platte schnell umkehren, um den Überstand nach der letzten Zentrifugation zu dekantieren und fünfmal 10 an einer vierten frisch isolierten Muttermilchzelle in 200 Mikroliter PBS plus BSA für eine zweistündige Inkubation bei 37 Grad Celsius hinzuzufügen. Zentrifugieren Sie am Ende der Inkubation die Zellen und waschen Sie die Pellets zweimal in 200 Mikroliter frischer PBS, wie gezeigt.Nach der letzten Wäsche, färben die Zellen mit 0,5 Mikrogramm pro Milliliter fixierbare Lebensfähigkeit Fleck 450 pro Brunnen in 50 Mikroliter PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt. Am Ende der Inkubation pellet die Zellen für zwei Waschungen in frischem PBS, wie gezeigt, und färben die Zellen für die Leukozytenmarker von Interesse für 30 Minuten bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht. Am Ende der Inkubation, sammeln Sie die Zellen Zentrifugation, und waschen Sie die Zellen zweimal in 200 Mikroliter von 1%BSA plus PBS pro Wäsche.Nach der letzten Wäsche die Pellets in 200 Mikroliter mit 0,5% Formaldehyd pro Brunnen 30 Minuten bei Raumtemperatur, lichtgeschützt, fixieren. Für die zytometrische Durchflussanalyse der Zellproben, stellen Sie ein Durchflusszytometer mit einem Hochdurchsatz-Plattenleser, um 175 Mikroliter Proben zurückzuziehen und 5000 Zellen pro Bohrkörper zu sammeln. Führen Sie das anfängliche Gating aus, um Doublets und Trümmer auf einem Vorwärtsstreuungs- oder Seitenstreuungsdiagramm zu beseitigen.Verwenden Sie ein Seitenstreuungs-/Lebensfähigkeits-Fleckendiagramm, um die abgestorbenen Zellen zu beseitigen. Und verwenden Sie eine Seitenstreuung im Vergleich zu CD45-Plot, um die wichtigsten Leukozytenklassen zu unterscheiden. Für alle CD45-positiven Zellen oder für jede Vonbiot-Untermenge messen Sie die antikörperabhängige zelluläre Phagozytoseaktivität, indem sie mit einem Marker auf die Adad-positiven Zellen in einem Histogramm des entsprechenden Fluorophorkanals für die konjugierten Perlen gegating.Berechnen Sie dann die Antikörperabhängigen zellulären Phagozytose-Werte als Median der Fluoreszenzintensität der Ad-positiven Zellen um den Prozentsatz der gesamten CD45 plus die Zellen in der positiven Population. Hier wird die Gating-Strategie zur Beseitigung von Doublets, Schutt und abgestorbenen Zellen gezeigt. Zwischen einem bis 12% aller lebenden Zellen sind in der Regel CD45-positive Leukozyten, wobei die meisten der angeblichen Seitenstreuung niedrig bis zwischen CD45 niedrige Monozyten scheinen Vorläufer zu sein, oder unreife Zellen, basierend auf der Seitenstreuung im Vergleich ZU CD45 Gating.Die angeblichen Granulozyten werden als Side Scatter high, CD45 Zwischenzellen definiert. Die Messung der ADCP-Aktivität frisch isolierter Muttermilchzellen mit einem HIV-spezifischen humanen monoklonalen Antikörper nach einem Monat nach der Partikation zeigt, dass die Behandlung mit Actin-Hemmer Cytochalasin D und oder Fc-Rezeptor-blockierenden Antikörpern vor der Inkubation mit Antikörper gebundenen Antigen-gekoppelten Perlen zu der ADCP-Aktivität führt, die in Gegenwart von Kontrollantikörpern beobachtet wurde. Der ADCP-Score, der für insgesamt CD45-positive Zellen ermittelt wird, liegt in der Regel zwischen 25 und 35 Mal über den Hintergrundniveaus, definiert mit einem negativen Kontroll-, Anti-Anthrax-Monoklon-Antikörper.Jede Muttermilchprobe ist einzigartig und einige Pellets können schwer zu sehen sein. Darüber hinaus können die Leukozytenpopulationen und damit die ADCP-Werte von Probe zu Probe sehr unterschiedlich sein.

isolation-leukocytes-from-human-breast-milk-for-use-an-antibody

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In diesem Video demonstrieren wir die Isolierung von B-Zellen aus menschlichem peripherem Blut mit biotinylierten Antikörpern, die spezifisch für Nicht-B-Zellen sind, und Streptavidin-konjugierten magnetischen Mikrokügelchen.

Isolierung und Reinigung von B-Zellen aus menschlichem peripherem Blut

Dieses Video zeigt einen Assay zur Messung der Antikörper-abhängigen zellulären Phagozytose (ADCP) durch Muttermilchphagozyten. Fluoreszenzmarkierte Mikrosphären, die an einen Antigen-Antikörper-Komplex konjugiert sind, werden mit einer aus der Muttermilch isolierten Zellsuspension kombiniert, um eine Antikörper-abhängige zelluläre Phagozytose durch die phagozytischen Leukozyten zu induzieren. Nach der Markierung der Zellen mit Antikörpern gegen das gemeinsame Leukozytenantigen (CD45) wird die...

Ein In-vitro-Assay zur Messung der Antikörper-abhängigen zellulären Phagozytose durch Phagozyten

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung Teilmengen von Vorläufer-B-Zellen aus Nabelschnurblut. Ein ausreichender Menge und Qualität von Nukleinsäuren können aus den Zellen extrahiert werden und in nachfolgenden Assays DNA oder RNA.

Isolierung von Precursor B-Zell-Subsets aus Nabelschnurblut

Hierin wird ein Protokoll zur Isolierung und weiteren Untersuchung der infiltrierenden Leukozyten der Decidua basalis und der Decidua parietalis - der menschlichen mütterlich-fetalen Schnittstelle - beschrieben. Dieses Protokoll bewahrt die Integrität der Zelloberflächenmarker und liefert genügend lebensfähige Zellen für nachgelagerte Anwendungen, wie die Durchflusszytometrie-Analyse beweist.

Isolation von Leukozyten aus dem menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle

Es werden Techniken beschrieben, die ein Gradientenverfahren zur Trennung von Exosomen von Partikeln des humanen Immundefizienzvirus (HIV) beschreiben. Dieses Verfahren wurde verwendet, um Exosomen weg von HIV-Partikeln im menschlichen Plasma von HIV-infizierten Personen zu isolieren. Die isolierten Exosomen wurden auf ihren Zytokin-/Chemokingehalt analysiert.

Isolierung der Exosomen aus dem Plasma von HIV-1-positiven Individuen

Wir beschreiben eine Methode zur Messung der Geschwindigkeit von Phagosomen, die sich in lebenden Zellen in Richtung des Zellzentrums bewegen, die mit oder ohne das humane Immundefizienzvirus (HIV) Typ 1 infiziert sind, wobei die konfokale Fluoreszenzmikroskopie der Spinning-Disk zur Identifizierung fluoreszierender infizierter Zellen und die Hellfeldmikroskopie zum Nachweis von Phagosomen  verwendet wird.

Phagosom Migration und Geschwindigkeit gemessen in Live-primären humanen Makrophagen mit HIV-1 infizierten

Menschliches peripheres Blut wird häufig zur Beurteilung der humoralen Immunantwort verwendet. Im Folgenden werden die Methoden zur Isolierung humaner B-Zellen aus peripherem Blut, zur Differenzierung humaner B-Zellen in Antikörper (Ab)-sezernierende B-Zellen (ASCs) in Kultur und zur Aufzählung der Gesamt-IgM- und IgG-ASCs über einen ELISpot-Assay beschrieben.

Die Isolation, Differenzierung und Quantifizierung von Human-Antikörper-sezernierenden B-Zellen aus Blut: ELISpot als Functional Readout der humoralen Immunität

Wir beschreiben eine Methode zur Verarbeitung von bronchoalveolarer Spülflüssigkeit und abgestimmtem peripherem Blut von chronisch HIV-infizierten Personen auf antiretrovirale Therapie zur Beurteilung von lungenen HIV-Reservoirs. Diese Methoden führen zum Erwerb von hochreinen CD4-T-Zellen und Alveolar-Makrophagen, die anschließend zur Immunphenotypisierung und HIV-DNA/RNA-Quantifizierungen durch ultraempfindliche Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt werden können.

Verarbeitung von Bronchoalveolar Lavage Fluid und Matched Blood für Alveolar Macrophage und CD4+ T-Zell Immunophenotypisierung und HIV Reservoir Assessment

Hier wird ein optimiertes Protokoll zur Isolierung, Kultivierung, Transfekung und Unterscheidung menschlicher Primärmonozyten von HIV-infizierten Personen und gesunden Kontrollen vorgestellt.

Isolation, Transfektion und Kultur der primären menschlichen Monozyten

Dieses Protokoll beschreibt eine automatisierungskompatible Methode mit hohem Durchsatz zur Isolierung von mononukleären Zellen des menschlichen peripheren Blutes für Biobanking und andere Zwecke.

Isolierung von mononukleären Zellen des humanen peripheren Blutes aus Buffy Coats durch immunmagnetische Hochdurchsatz-Bead-Trennung

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die effektive Isolierung extrazellulärer Vesikel aus der menschlichen Muttermilch mit hoher Reinheit zu beschleunigen und zu ermöglichen.

Schnelle Isolierung von extrazellulären Vesikeln aus der menschlichen Muttermilch

Erfahren Sie die Isolierung von Leukozyten aus menschlicher Muttermilch zur Untersuchung der antikörperabhängigen zellulären Phagozytose gegen HIV-Ziele. Diese Methode ermöglicht die effiziente Analyse immunologischer Schutzmechanismen.

Isolierung von Leukozyten aus menschlicher Muttermilch zur Verwendung in einem antikörperabhängigen zellulären Phagozytose-Assay von HIV-Zielen (Video) | JoVE Journal

Isolierung von Leukozyten aus menschlicher Muttermilch zur Verwendung in einem antikörperabhängigen zellulären Phagozytose-Assay von HIV-Zielen

Weitere Videos entdecken